Name: automatic separation and collection of cancer-related substances from clinical samples
Uploaded: 2023-01-13T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automatic Separation and Collection of Cancer-Related Substances from Clinical Samples at JoVE.com

Эта рукопись была частично поддержана Корейским фондом разработки медицинских изделий (KMDF, грант No RS-2020-KD000019) и Корейским институтом развития индустрии здравоохранения (KHIDI, грант No HI19C0521020020).

Все образцы цельной крови были получены от пациентов с раком легких. Исследования и анализ в Clinomics проводятся Научно-исследовательским институтом геномики рака, а одобрение исследований IRB правительством возглавляется Комитетом по институциональному обзору Медицинского центра Асана...

<ol>
	<li>Babayan, A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+liquid+biopsy+approaches+for+early+detection+and+monitoring+of+cancer.">Advances in liquid biopsy approaches for early detection and monitoring of cancer.</a> Genome Medicine. 10 (1), 21 (2018).</li><li>Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy:+monitoring+cancer-genetics+in+the+blood.">Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).</li><li>Bardelli, A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsies,+what+we+do+not+know+(yet).">Liquid biopsies, what we do not know (yet).</a> Cancer Cell. 31 (2), 172-179 (2017).</li><li>Mattox, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+liquid+biopsies+for+cancer.">Applications of liquid biopsies for cancer.</a> Science Translational Medicine. 11 (507), (2019).</li><li>Heitzer, E., Perakis, S., Geigl, J. B., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+liquid+biopsies+for+the+early+detection+of+cancer.">The potential of liquid biopsies for the early detection of cancer.</a> NPJ Precision Oncology. 1 (1), 36 (2017).</li><li>Scudellari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myths+that+will+not+die.">Myths that will not die.</a> Nature. 582 (7582), 322-326 (2015).</li><li>Prasad, V., Fojo, T., Brada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+oncology:+origins,+optimism,+and+potential.">Precision oncology: origins, optimism, and potential.</a> The Lancet Oncology. 17 (2), 81-86 (2016).</li><li>Prasad, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspective:+The+precision-oncology+illusion.">Perspective: The precision-oncology illusion.</a> Nature. 537 (7619), 63 (2016).</li><li>Siravegna, G., Marsoni, S., Siena, S., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+liquid+biopsies+into+the+management+of+cancer.">Integrating liquid biopsies into the management of cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (9), 531-548 (2017).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-and+late-stage+human+malignancies.">Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies.</a> Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).</li><li>Udomruk, S., Orrapin, S., Pruksakorn, D., Chaiyawat, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+distribution+of+cell-free+DNA+in+oncology.">Size distribution of cell-free DNA in oncology.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 166, 103455 (2021).</li><li>Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+(CTC)+detection:+clinical+impact+and+future+directions.">Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions.</a> Cancer Letters. 253 (2), 180-204 (2007).</li><li>Loeian, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+using+the+nanotube-CTC-chip:+capture+of+invasive+CTCs+with+high+purity+using+preferential+adherence+in+breast+cancer+patients.">Liquid biopsy using the nanotube-CTC-chip: capture of invasive CTCs with high purity using preferential adherence in breast cancer patients.</a> Lab on a Chip. 19 (11), 1899-1915 (2019).</li><li>Rikkert, L. G., Van Der Pol, E., Van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R., Coumans, F. A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugation+affects+the+purity+of+liquid+biopsy-based+tumor+biomarkers.">Centrifugation affects the purity of liquid biopsy-based tumor biomarkers.</a> Cytometry Part A. 93 (12), 1207-1212 (2018).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+isolation,+culture,+and+downstream+molecular+analysis.">Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis.</a> Biotechnology advances. 36 (4), 1063-1078 (2018).</li><li>Bennett, C. W., Berchem, G., Kim, Y. J., El-Khoury, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA+and+next-generation+sequencing+in+the+service+of+personalized+medicine+for+lung+cancer.">Cell-free DNA and next-generation sequencing in the service of personalized medicine for lung cancer.</a> Oncotarget. 7 (43), 71013 (2016).</li><li>Lowes, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+(CTC)+and+cell-free+DNA+(cfDNA)+workshop+2016:+scientific+opportunities+and+logistics+for+cancer+clinical+trial+incorporation.">Circulating tumor cells (CTC) and cell-free DNA (cfDNA) workshop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1505 (2016).</li><li>Bryzgunova, O. E., Konoshenko, M. Y., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+of+cell-free+DNA+in+different+tumor+types.">Concentration of cell-free DNA in different tumor types.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 21 (1), 63-75 (2021).</li><li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cells+as+an+indicator+of+early+and+systemic+recurrence+after+surgical+resection+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Circulating tumour cells as an indicator of early and systemic recurrence after surgical resection in pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-12 (2021).</li><li>Heidrich, I., A&#269;kar, L., Mossahebi Mohammadi, P., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsies:+Potential+and+challenges.">Liquid biopsies: Potential and challenges.</a> International Journal of Cancer. 148 (3), 528-545 (2021).</li><li>Celec, P., Vlkov&#225;, B., Laukov&#225;, L., B&#225;b&#237;&#269;kov&#225;, J., Boor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA:+the+role+in+pathophysiology+and+as+a+biomarker+in+kidney+diseases.">Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases.</a> Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1 (2018).</li><li>Thierry, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+quantification+of+circulating+DNA+in+mice+with+human+colorectal+cancer+xenografts.">Origin and quantification of circulating DNA in mice with human colorectal cancer xenografts.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), 6159-6175 (2010).</li><li>Moreira, V. G., de la Cera Mart&#237;nez, T., Gonzalez, E. G., Garcia, B. P., Menendez, F. V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+and+clearance+of+cell-free+plasma+DNA+in+hemodialysis+quantified+by+real-time+PCR.">Increase in and clearance of cell-free plasma DNA in hemodialysis quantified by real-time PCR.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 44 (12), 1410-1415 (2006).</li><li>Gauthier, V. J., Tyler, L. N., Mannik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+clearance+kinetics+and+liver+uptake+of+mononucleosomes+in+mice.">Blood clearance kinetics and liver uptake of mononucleosomes in mice.</a> Journal of Immunology. 156 (3), 1151-1156 (1996).</li><li>Meng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+in+patients+with+breast+cancer+dormancy.">Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy.</a> Clinical Cancer Research. 10 (24), 8152-8162 (2004).</li><li>Alix-Panabi&#232;res, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+circulating+tumour+cell+research.">Challenges in circulating tumour cell research.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+circulating+tumor+cells+in+non-small-cell-lung-cancer+patients+using+a+multi-flow+microfluidic+channel.">Isolation of circulating tumor cells in non-small-cell-lung-cancer patients using a multi-flow microfluidic channel.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 5 (1), 8 (2019).</li><li>Sajay, B. N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+optimal+and+unbiased+approach+for+tumor+cell+isolation.">Towards an optimal and unbiased approach for tumor cell isolation.</a> Biomedical Microdevices. 15 (4), 699-709 (2013).</li><li>Bailey, P. C., Martin, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+CTC+biology+and+clinical+impact+emerging+from+advances+in+capture+technology.">Insights on CTC biology and clinical impact emerging from advances in capture technology.</a> Cells. 8 (6), 553 (2019).</li><li>Ahn, S. M., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body+fluid+proteomics:+Prospects+for+biomarker+discovery.">Body fluid proteomics: Prospects for biomarker discovery.</a> Proteomics-Clinical Applications. 1 (9), 1004-1015 (2007).</li></ol>

Количество и концентрация cfDNA и CTC зависит от индивидуальности, стадии и типа рака. Это также зависит от состояния больного 2,4,5,10,20. В частности, на ранних или предраковых стадиях рака концентрации св...

Раннее и точное выявление различных заболеваний, в том числе онкологических, является важнейшим фактором в установлении стратегии лечения 1,2,3,4. В частности, раннее выявление рака тесно связано с повышением шансов на выживаемость пациента 5,6,7,8. В последнее время жидкие биопсии находятся в центре внимания для раннего выявления рака. Солидные опухоли подвергаются ангиогенезу и выделяют в кровь различные вещества. В частности, вкрови больных раком обнаружены циркулирующие ДНК (ctDNAs), циркулирующие РНК (ctRNAs), белки, везикулы, такие как экзосомы, и циркулирующие опухолевые клетки (CTC). Хотя существуют различия в количестве этих веществ, они последовательно наблюдаются не только на ранних стадиях, но и на более поздних стадиях 6,10. Однако эти индивидуальные различия очень высоки; например, количество бесклеточной ДНК (cfDNA), содержащей ctDNA, составляет менее 1000 нг, а количество CTC составляет менее 100 в 10 мл цельной крови у больных раком 11,12,13. Многие исследования характеризуют рак с использованием этих веществ, присутствующих в меньших количествах (например, cfDNA, ctDNA и CTC). Для получения точных результатов важно точно отделить небольшие количества веществ с высокой чистотой13,14. Обычно используются обычные методы центрифугирования, но они сложны в обращении и имеют низкую чистоту в зависимости от навыков пользователя. С момента открытия CTC было разработано несколько методов разделения, таких как центрифугирование или разделение по плотности, иммуногранула и микрофлюидные методы. С момента открытия ЦОК было разработано несколько методов сдерживания. Однако эти методы часто ограничены, когда необходимо изолировать клетки из различных чипов и мембран, используемых для их выделения15. Кроме того, методы маркировки требуют такого оборудования, как FACS, и существуют ограничения на последующий процесс из-за загрязнения маркировки.
В последнее время возросло использование жидких биопсий, и проводятся различные исследования для раннего выявления рака. Хотя этот метод прост, все еще существуют трудности в последующем анализе, и различные исследования пытаются преодолеть эти трудности16,17. Кроме того, многие сайты, включая больницы, требуют автоматизированных, воспроизводимых и высокочистых методов, которые удобны в использовании. Здесь мы разработали лабораторию на диске для автоматического отделения веществ от образцов крови после жидкой биопсии. Эти устройства основаны на принципе центрифугирования, микрофлюидики и захвата клеток размером с пору. Существует три типа дисков: LBx-1 может приобретать плазму и пышную оболочку, в то время как LBx-2 может приобретать плазму и PBMC из цельной крови объемом менее 10 мл; FAST-auto также может приобретать CTC с помощью мембраны, которая снимается с диска. До четырех дисков можно использовать за один прогон. Прежде всего, преимущество этого устройства и метода заключается в том, что он может получать различные вещества, полученные из рака, из одного и того же образца, используя небольшое количество крови. Это означает, что кровь пациента должна быть взята только один раз. Кроме того, он имеет преимущество в исключении ошибок из-за различий в периоде забора крови. Эта платформа проста в использовании и обеспечивает точные результаты для жидких биопсий и последующих применений. В этом протоколе введено использование устройства и картриджа.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4150 TapeStation System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2992AA</td>
			<td>Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit&#160;</td>
			<td>Apostle</td>
			<td>A17622-250</td>
			<td>5 mL X 50 preps version</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer blood collection tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>367525</td>
			<td>EDTA Blood Collection Tube (10 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioViewCCBS</td>
			<td>Clinomics</td>
			<td></td>
			<td>BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MHCD4522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAST Auto cartridge</td>
			<td>Clinomics</td>
			<td>CLX-M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBx-1 cartridge</td>
			<td>Clinomics</td>
			<td>CLX-M4101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBx-2 cartridge</td>
			<td>Clinomics</td>
			<td>CLX-M4201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPR-2000 instrument</td>
			<td>Clinomics</td>
			<td>CLX-I2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass</td>
			<td>Marienfeld Superior</td>
			<td>HSU-0101040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag 2 Magnet Stand</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Paque Solution</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td>density gradient solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Tip, 10 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AX-TF-10</td>
			<td>Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Tip, 200 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AX-TF-200</td>
			<td>Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Tip, 100 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AX-TF-100</td>
			<td>Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Tip, 1000 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AX-TF-1000</td>
			<td>Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>324204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>433284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Science Wipers</td>
			<td>Yuhan-Kimberly</td>
			<td>41117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex glove</td>
			<td>Microflex</td>
			<td>63-754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Bead Separation Rack</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>VP 772F2M-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Pipetting&#160; (0.5-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Pipetting&#160; (2-20 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Pipetting&#160; (10-100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Pipetting&#160; (20-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Pipetting&#160; (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium With DAPI&#160;- Aqueous, Fluoroshield</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab104139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Human IgG Control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1-001-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS BX-UCB</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>9217316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>53-9003-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffered Saline Solution)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040CVC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet Aid</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4-000-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Glass</td>
			<td>Marienfeld Superior</td>
			<td>HSU-1000612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StainTray Staining box</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Serological Pipette (10 mL)</td>
			<td>SPL</td>
			<td>91010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#160;X-100 solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN&#160;20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole Blood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stored at 4-8 &#176;C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator)</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>010-00157</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automatic separation and collection of cancer-related substances from clinical samples

В последнее время жидкие биопсии стали использоваться для диагностики различных заболеваний, в том числе рака. Жидкости организма содержат много веществ, включая клетки, белки и нуклеиновые кислоты, происходящие из нормальных тканей, но некоторые из этих веществ также происходят из больной области. Исследование и анализ этих веществ в жидкостях организма играют ключевую роль в диагностике различных заболеваний. Поэтому важно точно отделить необходимые вещества, и для использования с этой целью разработано несколько методик.
Мы разработали устройство и платформу типа «лаборатория на диске» под названием CD-PRIME. Это устройство автоматизировано и имеет хорошие результаты по загрязнению образца и стабильности образца. Кроме того, он имеет преимущества хорошей доходности приобретения, короткого времени работы и высокой воспроизводимости. Кроме того, в зависимости от типа диска, подлежащего установке, плазма, содержащая бесклеточную ДНК, циркулирующие опухолевые клетки, мононуклеарные клетки периферической крови или пушистые оболочки могут быть разделены. Таким образом, приобретение различных материалов, присутствующих в жидкостях организма, может быть сделано для различных последующих применений, включая изучение омики.

Целью этой методики является легкое и автоматическое выделение связанных с раком веществ из цельной крови. В частности, любой желающий может использовать эту технику во всех подходящих областях исследований и анализа. Одновременное и воспроизводимое разделение нескольких веществ в о...

Watch this Scientific Journal Video about Automatic Separation and Collection of Cancer-Related Substances from Clinical Samples at JoVE.com

Automatic Separation and Collection of Cancer-Related Substances from Clinical Samples

В этой статье описывается применение автоматизированного оборудования для легкого и эффективного отделения и сбора веществ, таких как бесклеточная ДНК и циркулирующие опухолевые клетки, из цельной крови.

Автоматическое отделение и сбор веществ, связанных с раком, из клинических образцов

Recently, liquid biopsies have been used to diagnose various diseases, including cancer. Body fluids contain many substances, including cells, proteins, ...

Наш протокол удобен для пользователя. Используя эту методику, любой желающий может легко выделить компонент из крови. Загрязнение может быть сведено к минимуму, а материалы могут быть точно разделены.Благодаря автоматизации и созданию этого протокола исследователи могут легко получать связанные с раком вещества с высокой чистотой, что полезно для различных последующих исследований. В частности, ожидается, что он обеспечит важные преимущества для исследований конечных пользователей. Демонстрировать свою процедуру будет Джей Чжон, старший научный сотрудник и помощник менеджера в Научно-исследовательском институте геномики рака.Для начала загрузите картридж LBx 1, выбрав тип картриджа на сенсорной панели прибора. Нажмите кнопку со стрелкой, чтобы изменить количество образцов. Затем откройте дверцу прибора и вставьте все картриджи, которые будут использоваться, в порядке количества на держателе картриджа.В общей сложности четыре картриджа поместите фиктивный картридж в пустое пространство держателя картриджа. Используйте опорное колесо для крепления картриджа и затяните стопорную гайку, чтобы закрепить его. Закройте дверь и нажмите кнопку «Выполнить» на экране сенсорной панели.Прибор закрывает клапаны на картриджах, что занимает примерно 30 секунд. Следуйте сообщению, чтобы открыть дверь. Снимите опорное колесо и извлеките закрытый клапан картриджа из держателя картриджа.Пипетка максимум 10 миллилитров образца цельной крови с использованием серологической пипетки. Вставьте наконечник пипетки глубоко во входное отверстие картриджа и медленно введите образец цельной крови. После вставки картриджей в прибор закройте дверцу прибора и нажмите кнопку OK.Плазма и пушистые оболочки автоматически отделяются от цельной крови, что занимает примерно 30 минут. Как только плазменное и пышное пальто будут разделены, на экране появится сообщение, сопровождаемое звуком тревоги. Остановите сигнал тревоги, открыв дверь или нажав кнопку остановки.Откройте дверь. Извлеките картридж и положите его на стол. Извлеките три миллилитра плазмы из плазменного выхода с помощью одномиллилитрового наконечника пипетки.Затем извлеките три миллилитра пальто баффи из выходного отверстия для пальто, используя наконечник пипетки в один миллилитр. Затем загрузите картридж LBx 2, выбрав имя картриджа на сенсорной панели прибора. Нажмите кнопку стрелки, чтобы изменить количество образцов, и следуйте той же процедуре, что и для картриджа LBx 1, чтобы вставить картридж в держатель картриджа.После вставки картриджа и закрытия дверцы нажмите кнопку «Выполнить» на экране тачпада. Следуйте процедуре, показанной выше, чтобы извлечь закрытый клапан картриджа из держателя картриджа и поместить его на стол. Пипетка градиентного раствора плотности с помощью серологической пипетки.Вставьте наконечник пипетки глубоко во входное отверстие картриджа и медленно введите раствор. Затем пипетка образца цельной крови и медленно вводит его во входное отверстие образца. После вставки и закрепления картриджа закройте дверцу и нажмите кнопку OK.Как только плазма и PBMC автоматически отделяются от цельной крови, появляется сообщение, сопровождаемое звуком тревоги. Откройте дверцу и извлеките картридж. Извлеките три миллилитра плазмы из плазменного выхода с помощью одномиллилитрового наконечника пипетки, а затем извлеките три миллилитра PBMC из выходного отверстия PBMC.Аналогичным образом, для картриджа FAST-auto после извлечения закрытого клапаном картриджа из держателя картриджа впрыскивайте шесть миллилитров раствора PBS во входное отверстие PBS картриджа. Затем пипетку из трех миллилитров цельной крови или пышной оболочки, полученной из LBx 1, или образца PBMC, полученного из LBx 2, и медленно вводят образец во входное отверстие образца картриджа. Вставив картридж и закрепив его, закройте дверцу и нажмите кнопку OK.Как только автоматическое обогащение CTC будет завершено, остановите сигнализацию. Извлеките картридж и вставьте средство для удаления задней панели, или BPR, в четыре отверстия на передней панели картриджа. Нажмите на темно-синее крыло большими пальцами обеих рук, а затем нажмите на светло-голубое тело, пока оно не щелкнет.Осторожно извлеките корпус картриджа, подняв его. Очень осторожно подберите фильтрующую мембрану за край с помощью пинцета и поместите мембрану в 1,5-миллилитровую трубку для приготовления нуклеиновой кислоты или на скользящее стекло для окрашивания. При необходимости восстановите отфильтрованную кровь к выходу крови с помощью одномиллилитрового наконечника пипетки.Извлеченные cfDNAs оценивали с помощью биоанализатора, а экранные ленты cfDNA использовали вместе с электронной лестницей. Зеленая линия использовалась для выравнивания лестницы и образца. Треугольные знаки указывают на полосу ДНК.Большинство cfDNA имеет длину 166 пар оснований, а некоторые существуют в целочисленных кратных длине. Обычно концентрация cfDNA измеряется размером от 50 до 700 пар оснований. Хотя существует разница в количестве, полученном из каждого отдельного образца, например, 8,47 нанограмма на миллилитр и 5,2 нанограмма на миллилитр, результаты экстракции cfDNA были хорошими как для концентрации, так и для распределения по размерам во всех случаях.Эти результаты указывают на то, что метод LBx 1 точно разделяет плазму, содержащую cfDNA. В FAST-auto мембрану удаляли и окрашивали флуоресцентными антителами для обнаружения ЦОК и лейкоцитов. Витражная мембрана, размещенная на стеклянных слайдах, наблюдалась под флуоресцентным микроскопом.После окрашивания мембран клетки показывают DAPI или ядерно-положительные сигналы синим цветом, в то время как EpCAM и CK или CTC положительные выделены зеленым цветом, а CD45 или WBC положительные выделены красным. Удалить мембрану не составляет труда. Тем не менее, необходимо быть осторожным с потерей и загрязнением CTC.Цельная кровь, PBMC и пышная шерсть доступны. Вместо этого вам просто нужно установить весь объем. Другие жидкости также могут быть использованы, хотя потребуется тестирование.Этот метод может быть прооперирован непосредственно в больницах, и вещество может быть получено быстро.

automatic-separation-collection-cancer-related-substances-from

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ultrasonographic Evaluation of Breast Cancer-related Lymphedema

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet exists. Progressive Resistance Exercise (PRE) is expected to improve lymphedema without additional swelling. This study showed the therapeutic effects of PRE on lymphedema by using ultrasonography to measure the change in thickness of the muscle and subcutaneous tissue. The thickness of subcutaneous tissue decreased more in the PRE group than in the non-PRE group. Ultrasonography is widely used in many clinics because of its easy accessibility, safety, and inexpensiveness. Ultrasound is one of the best tools for diagnosing and determining treatment efficacy on breast cancer-related lymphedema (BCRL).

This study utilized ultrasonography for diagnosis and follow-up tests to confirm treatment efficacy of Progressive Resistance Exercise (PRE) in breast cancer-related lymphedema (BCRL). Ultrasonography can be applied effectively to ensure diagnosis and treatment of lymphedema.

Ультрасонографическая Оценка рака молочной железы, связанных с лимфедема

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. In the clinical setting, formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues are widely used for genetic testing. However, FFPE DNA is generally damaged and fragmented during the fixation process with formalin. Therefore, FFPE DNA is sometimes not adequate for genetic testing because of low quality and quantity of DNA. Here we present a method of touch imprint cytology (TIC) to obtain genomic DNA from cancer cells, which can be observed under a microscope. Cell morphology and cancer cell numbers can be evaluated using TIC specimens. Furthermore, the extraction of genomic DNA from TIC samples can be completed within two days. The total amount and quality of TIC DNA obtained using this method was higher than that of FFPE DNA. This rapid and simple method allows researchers to obtain high-quality DNA for genetic testing (e.g., next generation sequencing analysis, digital PCR, and quantitative real time PCR) and to shorten the turnaround time for reporting results.

Obtaining high-quality genomic DNA from tumor tissues is an essential first step for analyzing genetic alterations using next generation sequencing. In this article, we present a simple and rapid method to enrich tumor cells and obtain intact DNA from touch imprint cytology specimens.

Простой и быстрый метод для получения высокого качества опухоли ДНК от клинических патологических образцов с помощью касания отпечаток цитологии

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to objectively measure the severity of this condition. Here we describe an optimized method for assessing mitochondrial function of PBMCs collected from fatigued cancer patients. Using a compact extracellular flux system and sequential injection of respiratory inhibitors, we examined PBMC mitochondrial functional status by measuring basal mitochondrial respiration, spare respiratory capacity, and energy phenotype, which describes the preferred energy pathway to respond to stress. Fresh PBMCs are readily available in the clinical setting using standard phlebotomy. The entire assay described in this protocol can be completed in less than 4 hours without the involvement of complex biochemical techniques. Additionally, we describe a normalization method that is necessary for obtaining reproducible data. The simple procedure and normalization methods presented allow for repeated sample collection from the same patient and generation of reproducible data that can be compared between time points to evaluate potential treatment effects.

Our goal was to develop a practical protocol to evaluate mitochondrial dysfunction associated with fatigue in cancer patients. This innovative protocol is optimized for clinical use involving only standard phlebotomy and basic laboratory procedures.

Оценивая роль митохондриальной функции в связанных с раком усталость

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer (NSCLC). Testing for PD-L1 expression with the PD-L1 immunohistochemistry (IHC) 22C3 companion diagnostic assay, which gives a tumor proportion score (TPS), has been validated on tumor tissue. We developed an optimized laboratory-developed test (LDT) that uses the 22C3 antibody (Ab) concentrate on a widely available IHC autostainer for biopsy and cytology specimens. The PD-L1 TPS was evaluated with 120 paired whole-tumor tissue sections and biopsy samples and with 70 paired biopsy and cytology samples (bronchial washes, n = 40; pleural effusions, n = 30). The 22C3 Ab concentrate-based LDT showed a high concordance rate between biopsy (~100%) and cytology (~95%) specimens when compared to PD-L1 IHC expression determined using the PD-L1 IHC 22C3 companion assay at both TPS cut points (&#8805;1%, &#8805;50%). The optimized LDT presented here, using the 22C3 Ab concentrate to determine the PD-L1 expression in both tumor tissue and in cytology specimens, will expand the ability of laboratories worldwide to assess the eligibility of patients with NSCLC for treatment with pembrolizumab monotherapy in a reliable and reproducible manner.

To expand the ability of laboratories worldwide to assess the eligibility of patients with lung cancer for treatment with pembrolizumab, in a reliable and reproducible manner, we developed an assay that uses the 22C3 antibody concentrate on a widely available immunohistochemical autostainer, for both biopsy and cytology specimens.

С помощью 22 c 3 антитела анти PD-L1 сосредоточиться на биопсию и цитологических мазков из больных раком легкого немелкоклеточного

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% with current standard of care. Tumors often recur within 9 months following initial surgery, radiation and chemotherapy, at which point treatment options become limited. This highlights the pressing need for the development of better therapeutics to prolong survival and increase the quality of life for these patients.
Tumor Treating Fields (TTFields) therapy was developed to take advantage of the effect of low frequency alternating electrical fields on cells for cancer therapy. TTFields have been demonstrated to disrupt cells during mitosis and slow tumor growth. There is also growing evidence that they act through stimulating immune responses within exposed tumors. The advantages of TTFields therapy include its noninvasive approach and increased quality of life compared to other treatment modalities such as cytotoxic chemotherapies. The Food and Drug Administration approved TTFields therapy for the treatment of recurrent glioblastoma in 2011 and for newly diagnosed glioblastoma in 2015. We report on the effects of TTFields during mitosis, the results of electric fields modeling, and proper transducer array placement. Our protocol outlines the clinical application of TTFields on a patient post-surgery, using the second-generation device.

Glioblastoma is the most common and aggressive primary brain malignancy in adults, with most tumors recurring after initial treatment. Tumor Treating Fields (TTFields) therapy is the newest treatment modality for glioblastoma. Here, we describe the proper application of TTFields-transducer arrays on patients and discuss theory and aspects of treatment.

Клиническое применение лечения глиобластома поля терапии опухоли

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL of blood) warrant a poor prognosis and are correlated with shorter overall survival in several cancers (e.g., breast, prostate and colorectal). Currently, the anti-EpCAM-coated magnetic bead-based CTC capturing system is the gold standard test approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) for enumerating CTCs in the bloodstream. This test is based on the use of magnetic beads coated with anti-EpCAM markers, which specifically target epithelial cancer cells. Many studies have illustrated that EpCAM is not the optimal marker for CTC detection. Indeed, CTCs are a heterogeneous subpopulation of cancer cells and are able to undergo an epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) associated with metastatic proliferation and invasion. These CTCs are able to reduce the expression of cell surface epithelial marker EpCAM, while increasing mesenchymal markers such as vimentin. To address this technical hurdle, other isolation methods based on physical properties of CTCs have been developed. Microfluidic technologies enable a label-free approach to CTC enrichment from whole blood samples. The spiral microfluidic technology uses the inertial and Dean drag forces with continuous flow in curved channels generated within a spiral microfluidic chip. The cells are separated based on the differences in size and plasticity between normal blood cells and tumoral cells. This protocol details the different steps to characterize the programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression of CTCs, combining a spiral microfluidic device with customizable immunofluorescence (IF) marker set.

The characterization of circulating tumor cells (CTCs) is a popular topic in translational research. This protocol describes a semi-automatic immunofluorescence (IF) assay for PD-L1 characterization and enumeration of CTCs in non-small cell lung cancer (NSCLC) patient samples.

Полуавтоматический PD-L1 Характеристика и перечисление циркулирующих опухолевых клеток от немелкоклеточных больных раком легких по иммунофлуоресценции

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

Получение Рак стволовых клеток Сферы от гинекологических и опухолей рака молочной железы

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Measuring the Motor Aspect of Cancer-Related Fatigue using a Handheld Dynamometer

Cancer-related fatigue (CRF) is commonly reported by patients both during and after receiving treatment for cancer. Current CRF diagnoses rely on self-report questionnaires which are subject to report and recall biases. Objective measurements using a handheld dynamometer, or handgrip device, have been shown in recent studies to correlate significantly with subjective self-reported fatigue scores. However, variations of both the handgrip fatigue test and fatigue index calculations exist in the literature. The lack of standardized methods limits the utilization of the handgrip fatigue test in the clinical and research settings. In this study, we provide detailed methods for administering the physical fatigue test and calculating the fatigue index. These methods should supplement existing self-reported fatigue questionnaires and help clinicians assess fatigue symptom severity in an objective and quantitative manner.

Simple and accessible methods were developed to measure the motor aspect of cancer-related fatigue objectively and quantitatively. We describe, in detail, ways to administer the physical fatigue test using a simple handgrip device as well as methods to calculate fatigue indices.

Измерение Мотор Аспект рака связанных усталость с помощью портативного Dynamometer

Cancer-related fatigue (CRF) is commonly reported by patients both during and after receiving treatment for cancer. Current CRF diagnoses rely on ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

Выделение и функциональная оценка стволовых клеток рака молочной железы человека из образцов клеток и тканей

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Simple and Fast Rolling Circle Amplification-Based Detection of Topoisomerase 1 Activity in Crude Biological Samples

Isothermal amplification-based techniques such as the rolling circle amplification have been successfully employed for the detection of nucleic acids, protein amounts, or other relevant molecules. These methods have shown to be substantial alternatives to PCR or ELISA for clinical and research applications. Moreover, the detection of protein amount (by Western blot or immunohistochemistry) is often insufficient to provide information for cancer diagnosis, whereas the measurement of enzyme activity represents a valuable biomarker. Measurement of enzyme activity also allows for the diagnosis and potential treatment of pathogen-borne diseases. In all eukaryotes, topoisomerases are the key DNA-binding enzymes involved in the control of the DNA topological state during important cellular processes and are among the important biomarkers for cancer prognosis and treatment.
Over the years, topoisomerases have been substantially investigated as a potential target of antiparasitic and anticancer drugs with libraries of natural and synthetic small-molecule compounds that are investigated every year. Here, the rolling circle amplification method, termed rolling circle enhanced enzyme activity detection (REEAD) assay that allows for the quantitative measurement of topoisomerase 1 (TOP1) activity in a simple, fast, and gel-free manner is presented.By cleaving and ligating a specially designed DNA substrate, TOP1 converts a DNA oligonucleotide into a closed circle, which becomes the template for rolling circle amplification, yielding ~103 tandem repeat rolling circle products. Depending on the nucleotide incorporation during the amplification, there is the possibility of different readout methods, from fluorescence to chemiluminescence to colorimetric. As each TOP1-mediated cleavage-ligation generates one closed DNA circle, the assay is highly sensitive and directly quantitative.

A protocol for the sensitive and quantitative detection of topoisomerase 1 activity using the rolling circle enhanced enzyme activity detection assay is described. The method allows detection of topoisomerase 1 activity from purified components or cell/tissue extracts. This protocol has wide-ranging applications in any field involving detection of enzymatic activity.

Простое и быстрое обнаружение активности топоизомеразы 1 в сырых биологических образцах на основе усиления скользящего круга

Isothermal amplification-based techniques such as the rolling circle amplification have been successfully employed for the detection of nucleic acids, ...