Name: automatic separation and collection of cancer-related substances from clinical samples
Uploaded: 2023-01-13T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automatic Separation and Collection of Cancer-Related Substances from Clinical Samples at JoVE.com

Detta manuskript stöddes delvis av Korea Medical Device Development Fund (KMDF, Grant No. RS-2020-KD000019) och Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, Grant No. HI19C0521020020).

Alla helblodsprover erhölls från lungcancerpatienter. Forskningen och analysen vid Clinomics utförs av Cancer Genomics Research Institute, och IRB-forskningsgodkännande av regeringen leds av Asan Medical Center Institutional Review Committee (IRB NO. 2021-0802) med IRB-numret registrerat för forskning vid Clinomics.
1. Beredning av prover
<ol><li>Samla 9 ml helblod i ett EDTA- eller CFDNA-stabilt bloduppsamlingsrör.</li>
	<li>Blanda väl genom att vända röret upp och...

<ol>
	<li>Babayan, A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+liquid+biopsy+approaches+for+early+detection+and+monitoring+of+cancer.">Advances in liquid biopsy approaches for early detection and monitoring of cancer.</a> Genome Medicine. 10 (1), 21 (2018).</li><li>Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy:+monitoring+cancer-genetics+in+the+blood.">Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).</li><li>Bardelli, A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsies,+what+we+do+not+know+(yet).">Liquid biopsies, what we do not know (yet).</a> Cancer Cell. 31 (2), 172-179 (2017).</li><li>Mattox, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+liquid+biopsies+for+cancer.">Applications of liquid biopsies for cancer.</a> Science Translational Medicine. 11 (507), (2019).</li><li>Heitzer, E., Perakis, S., Geigl, J. B., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+liquid+biopsies+for+the+early+detection+of+cancer.">The potential of liquid biopsies for the early detection of cancer.</a> NPJ Precision Oncology. 1 (1), 36 (2017).</li><li>Scudellari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myths+that+will+not+die.">Myths that will not die.</a> Nature. 582 (7582), 322-326 (2015).</li><li>Prasad, V., Fojo, T., Brada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+oncology:+origins,+optimism,+and+potential.">Precision oncology: origins, optimism, and potential.</a> The Lancet Oncology. 17 (2), 81-86 (2016).</li><li>Prasad, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspective:+The+precision-oncology+illusion.">Perspective: The precision-oncology illusion.</a> Nature. 537 (7619), 63 (2016).</li><li>Siravegna, G., Marsoni, S., Siena, S., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+liquid+biopsies+into+the+management+of+cancer.">Integrating liquid biopsies into the management of cancer.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (9), 531-548 (2017).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-and+late-stage+human+malignancies.">Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies.</a> Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).</li><li>Udomruk, S., Orrapin, S., Pruksakorn, D., Chaiyawat, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+distribution+of+cell-free+DNA+in+oncology.">Size distribution of cell-free DNA in oncology.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 166, 103455 (2021).</li><li>Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+(CTC)+detection:+clinical+impact+and+future+directions.">Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions.</a> Cancer Letters. 253 (2), 180-204 (2007).</li><li>Loeian, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy+using+the+nanotube-CTC-chip:+capture+of+invasive+CTCs+with+high+purity+using+preferential+adherence+in+breast+cancer+patients.">Liquid biopsy using the nanotube-CTC-chip: capture of invasive CTCs with high purity using preferential adherence in breast cancer patients.</a> Lab on a Chip. 19 (11), 1899-1915 (2019).</li><li>Rikkert, L. G., Van Der Pol, E., Van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R., Coumans, F. A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrifugation+affects+the+purity+of+liquid+biopsy-based+tumor+biomarkers.">Centrifugation affects the purity of liquid biopsy-based tumor biomarkers.</a> Cytometry Part A. 93 (12), 1207-1212 (2018).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+isolation,+culture,+and+downstream+molecular+analysis.">Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis.</a> Biotechnology advances. 36 (4), 1063-1078 (2018).</li><li>Bennett, C. W., Berchem, G., Kim, Y. J., El-Khoury, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA+and+next-generation+sequencing+in+the+service+of+personalized+medicine+for+lung+cancer.">Cell-free DNA and next-generation sequencing in the service of personalized medicine for lung cancer.</a> Oncotarget. 7 (43), 71013 (2016).</li><li>Lowes, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+(CTC)+and+cell-free+DNA+(cfDNA)+workshop+2016:+scientific+opportunities+and+logistics+for+cancer+clinical+trial+incorporation.">Circulating tumor cells (CTC) and cell-free DNA (cfDNA) workshop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1505 (2016).</li><li>Bryzgunova, O. E., Konoshenko, M. Y., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+of+cell-free+DNA+in+different+tumor+types.">Concentration of cell-free DNA in different tumor types.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 21 (1), 63-75 (2021).</li><li>Park, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cells+as+an+indicator+of+early+and+systemic+recurrence+after+surgical+resection+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Circulating tumour cells as an indicator of early and systemic recurrence after surgical resection in pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-12 (2021).</li><li>Heidrich, I., A&#269;kar, L., Mossahebi Mohammadi, P., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsies:+Potential+and+challenges.">Liquid biopsies: Potential and challenges.</a> International Journal of Cancer. 148 (3), 528-545 (2021).</li><li>Celec, P., Vlkov&#225;, B., Laukov&#225;, L., B&#225;b&#237;&#269;kov&#225;, J., Boor, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA:+the+role+in+pathophysiology+and+as+a+biomarker+in+kidney+diseases.">Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases.</a> Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1 (2018).</li><li>Thierry, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+quantification+of+circulating+DNA+in+mice+with+human+colorectal+cancer+xenografts.">Origin and quantification of circulating DNA in mice with human colorectal cancer xenografts.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), 6159-6175 (2010).</li><li>Moreira, V. G., de la Cera Mart&#237;nez, T., Gonzalez, E. G., Garcia, B. P., Menendez, F. V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+and+clearance+of+cell-free+plasma+DNA+in+hemodialysis+quantified+by+real-time+PCR.">Increase in and clearance of cell-free plasma DNA in hemodialysis quantified by real-time PCR.</a> Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 44 (12), 1410-1415 (2006).</li><li>Gauthier, V. J., Tyler, L. N., Mannik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+clearance+kinetics+and+liver+uptake+of+mononucleosomes+in+mice.">Blood clearance kinetics and liver uptake of mononucleosomes in mice.</a> Journal of Immunology. 156 (3), 1151-1156 (1996).</li><li>Meng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+in+patients+with+breast+cancer+dormancy.">Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy.</a> Clinical Cancer Research. 10 (24), 8152-8162 (2004).</li><li>Alix-Panabi&#232;res, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+circulating+tumour+cell+research.">Challenges in circulating tumour cell research.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+circulating+tumor+cells+in+non-small-cell-lung-cancer+patients+using+a+multi-flow+microfluidic+channel.">Isolation of circulating tumor cells in non-small-cell-lung-cancer patients using a multi-flow microfluidic channel.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 5 (1), 8 (2019).</li><li>Sajay, B. N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+optimal+and+unbiased+approach+for+tumor+cell+isolation.">Towards an optimal and unbiased approach for tumor cell isolation.</a> Biomedical Microdevices. 15 (4), 699-709 (2013).</li><li>Bailey, P. C., Martin, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+on+CTC+biology+and+clinical+impact+emerging+from+advances+in+capture+technology.">Insights on CTC biology and clinical impact emerging from advances in capture technology.</a> Cells. 8 (6), 553 (2019).</li><li>Ahn, S. M., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body+fluid+proteomics:+Prospects+for+biomarker+discovery.">Body fluid proteomics: Prospects for biomarker discovery.</a> Proteomics-Clinical Applications. 1 (9), 1004-1015 (2007).</li></ol>

Mängden och koncentrationen av CFDNA och CTC beror på individen, scenen och typen av cancer. Det beror också på patientens tillstånd 2,4,5,10,20. I synnerhet i de tidiga eller precancerösa stadierna av cancer är koncentrationerna av cancerrelaterade ämnen mycket låga, så det finns en stor möjlighet att det inte kan detekteras. Icke desto mindre har ...

Tidig och korrekt upptäckt av olika sjukdomar, inklusive cancer, är den viktigaste faktorn för att upprätta en behandlingsstrategi 1,2,3,4. I synnerhet är tidig upptäckt av cancer nära besläktad med ökade överlevnadschanser för patienten 5,6,7,8. Nyligen har flytande biopsier varit i rampljuset för tidig upptäckt av cancer. Fasta tumörer genomgår angiogenes och släpper ut olika ämnen i blodet. I synnerhet har cirkulerande DNA (ctDNA), cirkulerande RNA (ctRNA), proteiner, vesiklar såsom exosomer och cirkulerande tumörceller (CTC) hittats i blodet hos cancerpatienter 2,9. Även om det finns skillnader i mängden av dessa ämnen, observeras de konsekvent inte bara i de tidiga stadierna utan också i de senare stadierna 6,10. Dessa individuella skillnader är dock mycket höga; till exempel är mängden cellfritt DNA (cfDNA) som innehåller ctDNA mindre än 1 000 ng och antalet CTC är mindre än 100 i 10 ml helblod från cancerpatienter11,12,13. Många studier har karakteriserat cancer med hjälp av dessa ämnen som finns i mindre mängder (dvs cfDNA, ctDNA och CTC). För att få exakta resultat är det viktigt att noggrant separera små mängder ämnen med hög renhet13,14. Konventionella centrifugeringsmetoder används ofta, men de är svåra att hantera och har låg renhet beroende på användarens skicklighet. Sedan upptäckten av CTC har flera separationstekniker utvecklats, såsom centrifugering eller densitetsseparation, immunobead och mikrofluidiska metoder. Flera inneslutningstekniker har utvecklats sedan upptäckten av CTC. Dessa tekniker är emellertid ofta begränsade när det är nödvändigt att isolera celler från de olika chips och membran som används för att isolera dem15. Märkningsmetoderna kräver också utrustning som FACS, och det finns gränser för nedströmsprocessen på grund av märkningskontaminering.
Nyligen har användningen av flytande biopsier ökat, och olika studier genomförs för tidig upptäckt av cancer. Även om denna metod är enkel finns det fortfarande svårigheter med nedströmsanalys, och olika studier försöker övervinna dessa svårigheter16,17. Dessutom kräver många webbplatser, inklusive sjukhus, automatiserade, reproducerbara och högrenhetsmetoder som är praktiska att använda. Här har vi utvecklat ett lab-on-a-disc för automatisk separation av ämnen från blodprover efter en flytande biopsi. Dessa enheter är baserade på principen om centrifugering, mikrofluidik och porstor cellfångst. Det finns tre typer av skivor: LBx-1 kan förvärva plasma och buffy coat, medan LBx-2 kan förvärva plasma och PBMC från helblod med en volym mindre än 10 ml; FAST-auto kan också skaffa CTC med hjälp av ett membran som kan tas bort från skivan. Upp till fyra av varje skiva kan användas i en körning. Framför allt är fördelen med denna enhet och metod att den kan erhålla en mängd olika cancer-härledda ämnen från samma prov med en liten mängd blod. Detta innebär att patientens blod bara behöver dras en gång. Dessutom har det fördelen att utesluta fel på grund av skillnader i blodprovtagningsperioden. Denna plattform är enkel att använda och ger exakta resultat för flytande biopsier och nedströmsapplikationer. I detta protokoll införs användningen av enheten och patronen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tube</td>
			<td>SPL</td>
			<td>50015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4150 TapeStation System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2992AA</td>
			<td>Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit&#160;</td>
			<td>Apostle</td>
			<td>A17622-250</td>
			<td>5 mL X 50 preps version</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer blood collection tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>367525</td>
			<td>EDTA Blood Collection Tube (10 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioViewCCBS</td>
			<td>Clinomics</td>
			<td></td>
			<td>BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MHCD4522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAST Auto cartridge</td>
			<td>Clinomics</td>
			<td>CLX-M3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBx-1 cartridge</td>
			<td>Clinomics</td>
			<td>CLX-M4101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LBx-2 cartridge</td>
			<td>Clinomics</td>
			<td>CLX-M4201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPR-2000 instrument</td>
			<td>Clinomics</td>
			<td>CLX-I2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass</td>
			<td>Marienfeld Superior</td>
			<td>HSU-0101040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag 2 Magnet Stand</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll Paque Solution</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td>density gradient solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Tip, 10 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AX-TF-10</td>
			<td>Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Tip, 200 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AX-TF-200</td>
			<td>Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Tip, 100 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AX-TF-100</td>
			<td>Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Tip, 1000 &#181;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AX-TF-1000</td>
			<td>Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>324204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>433284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Science Wipers</td>
			<td>Yuhan-Kimberly</td>
			<td>41117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex glove</td>
			<td>Microflex</td>
			<td>63-754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Bead Separation Rack</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>VP 772F2M-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Pipetting&#160; (0.5-10 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Pipetting&#160; (2-20 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Pipetting&#160; (10-100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Pipetting&#160; (20-200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Pipetting&#160; (100-1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium With DAPI&#160;- Aqueous, Fluoroshield</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab104139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Human IgG Control</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1-001-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLYMPUS BX-UCB</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>9217316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>53-9003-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffered Saline Solution)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040CVC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet Aid</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4-000-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Glass</td>
			<td>Marienfeld Superior</td>
			<td>HSU-1000612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StainTray Staining box</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Serological Pipette (10 mL)</td>
			<td>SPL</td>
			<td>91010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#160;X-100 solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN&#160;20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole Blood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stored at 4-8 &#176;C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator)</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>010-00157</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automatic separation and collection of cancer-related substances from clinical samples

Nyligen har flytande biopsier använts för att diagnostisera olika sjukdomar, inklusive cancer. Kroppsvätskor innehåller många ämnen, inklusive celler, proteiner och nukleinsyror som härrör från normala vävnader, men några av dessa ämnen härstammar också från det sjuka området. Undersökningen och analysen av dessa ämnen i kroppsvätskorna spelar en avgörande roll vid diagnos av olika sjukdomar. Därför är det viktigt att noggrant separera de erforderliga ämnena, och flera tekniker utvecklas för att användas för detta ändamål.
Vi har utvecklat en lab-on-a-disc-typ av enhet och plattform som heter CD-PRIME. Denna enhet är automatiserad och har goda resultat för provkontaminering och provstabilitet. Dessutom har det fördelar med ett bra förvärvsutbyte, en kort driftstid och hög reproducerbarhet. Dessutom, beroende på vilken typ av skiva som ska monteras, kan plasma som innehåller cellfritt DNA, cirkulerande tumörceller, mononukleära celler i perifert blod eller buffyrockar separeras. Således kan förvärvet av en mängd olika material som finns i kroppsvätskorna göras för en mängd olika nedströmsapplikationer, inklusive studier av omics.

Målet med denna teknik är att enkelt och automatiskt isolera cancerassocierade ämnen från helblod. I synnerhet kan vem som helst använda denna teknik inom alla lämpliga områden för forskning och analys. Den samtidiga och reproducerbara separationen av flera ämnen i ett enda blodprov är signifikant i flytande biopsier. LBx-1- och LBx-2-skivorna används för att isolera plasma och buffy coat eller PBMC från helblod. Figur 1 visar materialen separerade genom applicering av denna enh...

Watch this Scientific Journal Video about Automatic Separation and Collection of Cancer-Related Substances from Clinical Samples at JoVE.com

Automatic Separation and Collection of Cancer-Related Substances from Clinical Samples

Detta dokument beskriver tillämpningen av automatiserad utrustning för att enkelt och effektivt separera och samla ämnen, såsom cellfritt DNA och cirkulerande tumörceller, från helblod.

Automatisk separation och insamling av cancerrelaterade ämnen från kliniska prover

Recently, liquid biopsies have been used to diagnose various diseases, including cancer. Body fluids contain many substances, including cells, proteins, ...

Vårt protokoll är användarvänligt. Med hjälp av denna teknik kan vem som helst enkelt isolera komponent från blodet. Föroreningar kan minimeras och material kan separeras exakt.Med automatisering och upprättandet av detta protokoll kan forskare enkelt få cancerrelaterade ämnen med hög renhet, vilket är till hjälp för olika nedströmsstudier. I synnerhet förväntas det ge viktiga fördelar för slutanvändarens forskning. Demonstrerar deras procedur kommer att vara Jay Jeong, seniorforskare och biträdande chef vid Cancer Genomics Research Institute.För att börja, ladda LBx 1-patronen genom att välja patrontyp på instrumentets pekskärmspanel. Tryck på pilknappen för att ändra antalet prover. Öppna sedan instrumentluckan och sätt i alla patroner som ska användas i ordning efter numret på patronhållaren.För totalt fyra patroner, placera provdockans patron i patronhållarens tomma utrymme. Använd stödhjulet för att montera patronen och dra åt låsmuttern för att säkra den. Stäng dörren och tryck på körknappen på pekplattans skärm.Instrumentet stänger ventilerna på patronerna vilket tar cirka 30 sekunder. Följ meddelandet för att öppna dörren. Ta bort stödhjulet och ta bort den ventilstängda patronen från patronhållaren.Pipettera högst 10 ml av ett helblodsprov med användning av en serologisk pipett. För in pipettspetsen djupt in i cylinderampullens provinlopp och injicera långsamt hela blodprovet. När du har satt in patronerna i instrumentet stänger du instrumentets dörr och trycker på OK-knappen.Plasma- och buffyrockar separeras automatiskt från helblod, vilket tar cirka 30 minuter. När plasma- och buffy-kappan har separerats visas ett meddelande på skärmen tillsammans med ett larmljud. Stoppa larmet genom att öppna dörren eller trycka på stoppknappen.Öppna dörren. Ta bort patronen och placera den på bordet. Återvinn tre milliliter plasma från plasmautloppet med en en-milliliter pipettspets.Återställ sedan tre milliliter av buffy-pälsen från buffy-pälsutloppet med en en-milliliters pipettspets. Ladda sedan LBx 2-patronen genom att välja patronnamnet på instrumentets pekskärmspanel. Tryck på pilknappen för att ändra antalet prover och följ samma procedur som visas för LBx 1-patronen för att sätta in patronen i patronhållaren.När du har satt i patronen och stängt dörren trycker du på körknappen på pekplattans skärm. Följ proceduren som visades tidigare för att ta bort den ventilstängda patronen från patronhållaren och placera den på bordet. Pipettera densitetsgradientlösningen med användning av en serologisk pipett.Sätt in pipettspetsen djupt in i patronens inlopp och injicera lösningen långsamt. Pipettera sedan hela blodprovet och injicera det långsamt i provinloppet. När du har satt i och säkrat patronen stänger du dörren och trycker på OK-knappen.När plasma och PBMC automatiskt separeras från helblod visas ett meddelande åtföljt av ett larmljud. Öppna dörren och ta bort patronen. Återvinn tre milliliter plasma från plasmautloppet med hjälp av en en-milliliters pipettspets och återvinn sedan tre milliliter PBMC från PBMC-utloppet.På samma sätt, för FAST-auto-patronen, efter att ha tagit bort den ventilslutna patronen från patronhållaren, injicera sex milliliter PBS-lösningen i patronens PBS-inlopp. Pipettera sedan tre milliliter helblod eller buffy coat erhållet från LBx 1, eller PBMC-prov erhållet från LBx 2, och injicera långsamt provet i provinloppet till cylinderampullen. När du har satt i patronen och säkrat den stänger du dörren och trycker på OK-knappen.När den automatiska anrikningen av CTC är klar, stoppa larmet. Ta bort patronen och sätt in bakplattborttagaren, eller BPR, i de fyra hålen på patronens framsida. Tryck på den mörkblå vingen med tummarna på båda händerna och tryck sedan på den ljusblå kroppen tills den klickar.Ta försiktigt bort patronkroppen genom att lyfta den. Mycket försiktigt, plocka upp filtermembranet vid kanten med en pincett och placera membranet i ett 1,5 ml rör för nukleinsyraberedning eller på ett glidglas för färgningen. Om det behövs, återställ det filtrerade blodet till blodutloppet med hjälp av en milliliter pipettspets.De extraherade cfDNA:erna utvärderades med hjälp av Bioanalyzer, och CFDNA-skärmband användes tillsammans med en elektronisk stege. Den gröna linjen användes för att rikta in stegen och provet. Triangelmärkena indikerar DNA-bandet.De flesta CFDNA har en längd på 166 baspar och vissa finns i heltalsmultiplar av längd. Vanligtvis mäter koncentrationen av CFDNA upp till storleken på 50 till 700 baspar. Även om det finns en skillnad i mängden erhållen från varje enskilt prov, såsom 8,47 nanogram per milliliter och 5,2 nanogram per milliliter, var resultaten av CFDNA-extraktion bra för både koncentration och storleksfördelning i alla fall.Dessa resultat indikerar att LBx 1-metoden exakt separerar plasmainnehållande cfDNA. I FAST-AUTO avlägsnades membranet och färgades med fluorescerande antikroppar för att detektera CTC och vita blodkroppar. Det färgade membranet, placerat på glasskivor, observerades under ett fluorescensmikroskop.Efter membranfärgning visar celler DAPI eller kärnpositiva signaler i blått, medan EpCAM och CK- eller CTC-positiva markeras med grönt och CD45- eller WBC-positiva markeras med rött. Det är inte svårt att ta bort membranet. Det är dock nödvändigt att vara försiktig med förlust och förorening av CTC.Helblod, PBMC och buffy coat är alla tillgängliga. Istället behöver du bara ställa in hela volymen. Andra vätskor kan också användas, även om testning kommer att krävas.Denna teknik kan användas direkt på sjukhus och ämnet kan erhållas snabbt.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Ultrasonographic Evaluation of Breast Cancer-related Lymphedema

Ultraljud av bröstcancer relaterade lymfödem

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet ...

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

Användning av DNA-färgutlösad sidob populationsfenotyp för att detektera och rena cancer stamceller från biologiska prov

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Enkel och snabb metod att få hög kvalitet tumör DNA från klinisk-patologiska exemplar med Touch avtryck cytologi

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

Utvärdera rollen av mitokondriell funktion i cancerrelaterad trötthet

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Använda 22C 3 Anti-PD-L1 antikropp koncentreras biopsi och cytologi prover från icke-small Cell Lung cancerpatienter

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

Klinisk tillämpning av tumör behandling av fält terapi i Glioblastoma

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatisk PD-L1 karakterisering och uppräkning av cirkulerande tumörceller från icke-småcellig Lung cancer patienter genom Immunofluorescensering

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Erhålla Cancer Stem Cell Spheres från gynekologiska och bröstcancertumörer

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Measuring the Motor Aspect of Cancer-Related Fatigue using a Handheld Dynamometer

Mäta motoraspekten av cancerrelaterad trötthet med hjälp av en handhållen dynamometer

Cancer-related fatigue (CRF) is commonly reported by patients both during and after receiving treatment for cancer. Current CRF diagnoses rely on ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolering och funktionell bedömning av mänskliga bröstcancerstamceller från cell- och vävnadsprover

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...