Name: sperm collection and computer-assisted sperm analysis in the teleost model japanese medaka (oryzias latipes)
Uploaded: 2022-10-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes at JoVE.com

Dit werk is gefinancierd door de Noorse University of Life Sciences en het Amerikaanse Fulbright-programma. De auteurs willen Anthony Peltier en Lourdes Carreon G Tan van NMBU bedanken voor het onderhoud van visfaciliteiten en Guillaume Gourmelin van de ISC LPGP bij INRAE (Frankrijk) voor het bieden van vis- en laboratoriumruimte om deze methoden verder te testen.

Alle experimenten en dierbehandeling werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen over het welzijn van proefdieren aan de Noorse Universiteit voor Levenswetenschappen (NMBU). De experimenten werden uitgevoerd met volwassen (6-9 maanden oude) mannelijke Japanse medaka (Hd-rR-stam) opgegroeid bij NMBU (Ås, Noorwegen). De methoden werden ook kort getest bij 9 maanden oude mannelijke Japanse medaka (CAB-stam) die is opgegroeid aan het National Research Institute for Agriculture, Food and the Environment (INRAE,...

Osmolaliteit is een belangrijke factor bij de activering van vissperma36,37. Over het algemeen zijn sperma immotielen in de teelballen en worden ze beweeglijk in media die hyperosmotisch zijn ten opzichte van zaadvloeistof voor zeevissen, en hypo-osmotisch ten opzichte van zaadvloeistof voor zoetwatervissen37. Net als bloed is zaadplasma in zoetwatervissen doorgaans lager dan dat van zeevissen (ongeveer 300 mOsmol/kg vergeleken met 400 mOs...

Japanse medaka is een kleine, eierleggende zoetwater teleost vis afkomstig uit Oost-Azië. Medaka is een uitstekend modelsysteem voor gewervelde dieren geworden voor ecotoxicologie, ontwikkelingsgenetica, genomica en evolutionaire biologie en fysiologiestudies 1,2. Net als de populaire zebravissen zijn ze relatief gemakkelijk te kweken en zeer resistent tegen veel voorkomende visziekten 1,2. Er zijn verschillende voordelen van het gebruik van medaka als model, waaronder een korte generatietijd, transparante embryo's 1,2 en een gesequenced genoom3. In tegenstelling tot zebravissen heeft medaka een geslachtsbepalend gen4 en een hoge temperatuur (van 4-40 °C) en zoutgehalte (euryhaliene soort) tolerantie5. Ook zijn veel genetische en anatomische hulpmiddelen, evenals protocollen 6,7,8,9,10,11,12, ontwikkeld in medaka om de studie van de biologie te vergemakkelijken.
Voortplanting is een essentiële fysiologische functie omdat het een soort in staat stelt om te bestendigen. Gewervelde reproductie vereist een groot aantal nauwkeurig georkestreerde gebeurtenissen, waaronder de productie van eicellen bij vrouwen en de productie van sperma bij mannen. Sperma zijn unieke cellen, geproduceerd door het complexe proces van spermatogenese, waarbij er een aantal controlepunten zijn om de levering van een hoogwaardig product te garanderen13. Gametenkwaliteit is een focus geworden in aquacultuur- en vispopulatiestudies vanwege de impact op het succes van de bevruchting en de overleving van larven. De kwaliteit van het sperma is daarom een belangrijke indicator voor de mannelijke vruchtbaarheid bij gewervelde dieren.
Drie nuttige factoren voor het beoordelen van de kwaliteit van het sperma van vissen zijn beweeglijkheid, progressiviteit en levensduur. Procentuele beweeglijkheid en progressieve beweeglijkheid zijn veel voorkomende indicatoren van de spermakwaliteit, omdat progressieve beweging noodzakelijk is voor en sterk correleert met bevruchtingssucces14,15. De duur van de beweging is ook een belangrijke indicator bij vissen, omdat sperma bij de meeste teleostsoorten minder dan 2 minuten volledig beweeglijk blijft en het traject van sperma over het algemeen minder lineair is dan bij zoogdieren15. Veel studies die de beweeglijkheid van sperma in het verleden beoordeelden, vertrouwden echter op subjectieve of semi-kwantitatieve methoden voor het analyseren van sperma15,16. De beweeglijkheid van het sperma in medaka is bijvoorbeeld in het verleden visueel geschat onder een microscoop17. Het is ook geschat door spermabewegingen te registreren en beeldvormingssoftware te gebruiken om frames samen te voegen en zwempad en -snelheid te meten 18,19,20. Dergelijke benaderingen missen vaak robuustheid en leveren verschillende resultaten op volgens de persoon die de analyse uitvoert15,21.
Computer-assisted sperm analysis (CASA) werd in eerste instantie ontwikkeld voor zoogdieren. CASA is een snelle kwantitatieve methode om de spermakwaliteit te beoordelen door de snelheid en het traject op een geautomatiseerde manier te registreren en te meten15. Bij vissen is het in verschillende soorten gebruikt om de effecten van verschillende waterverontreinigende stoffen op de spermakwaliteit te monitoren, voor het identificeren van interessante voorlopers om het broedbestand te verbeteren, om de efficiëntie van cryopreservatie en opslag te verbeteren en om de omstandigheden voor bevruchting te optimaliseren15. Daarom is het een krachtig hulpmiddel voor het betrouwbaar beoordelen van de spermakwaliteit bij verschillende gewervelde soorten. Vanwege de belangrijke diversiteit in voortplantingsstrategieën tussen vissen, verschilt het sperma van teleostvissen echter van dat van zoogdieren en van de ene vissoort tot de andere. Teleostvissen, die voornamelijk eieren extern bevruchten door gameten in water vrij te geven, hebben sterk geconcentreerd sperma dat relatief eenvoudig van structuur is zonder acrosoom, in tegenstelling tot zoogdieren, die intern bevruchten en daarom niet hoeven te compenseren voor verdunning in water, maar wel meer viskeuze vloeistoffen moeten weerstaan14. Bovendien beweegt sperma van de meeste vissen snel, maar is het minder dan 2 minuten na activering volledig beweeglijk, hoewel er verschillende uitzonderingen zijn15,22. Omdat de beweeglijkheid bij de meeste vissen snel kan afnemen, moet uiterste voorzichtigheid worden betracht met de timing van de analyse na activering bij het bepalen van een spermaanalyseprotocol voor vissen.
Reproductie is een van de gebieden in de biologie waarin teleosts en medaka op grote schaal zijn gebruikt als modelorganismen. Inderdaad, medaka-mannetjes vertonen interessant reproductief en sociaal gedrag, zoals partnerbewakingvan 23,24. Daarnaast bestaan er verschillende transgene lijnen om de neuro-endocriene controle van de voortplanting bij deze soort te bestuderen 25,26,27. Spermabemonstering, een procedure die relatief eenvoudig is bij grotere vissen, kan ingewikkelder zijn bij kleine modelvissen omdat ze minder sperma produceren en delicater zijn. Om deze reden, de meeste studies met sperma bemonstering in medaka extract milt (vis sperma) door het verpletteren van ontleed teelballen 17,28,29,30. Een paar studies gebruiken ook een gemodificeerde buikmassage om de milt direct uit te drukken in activerend medium 18,19,20; met deze methode is het echter moeilijk om de hoeveelheid en kleur van milt geëxtraheerd te visualiseren. Bij zebravissen wordt buikmassage vaak gebruikt om milt uit te drukken, dat onmiddellijk wordt verzameld in een capillaire buis 31,32,33. Deze methode maakt het mogelijk om het volume milt te schatten, evenals observatie van de ejaculaatkleur, wat een snelle en eenvoudige indicator is van de spermakwaliteit32,33. Daarom ontbreekt een duidelijk en goed beschreven protocol voor spermaverzameling en -analyse voor medaka.
Dit artikel beschrijft daarom twee methoden van spermaverzameling in de kleine modelvis Japanse medaka: teelballendissectie en buikmassage met capillaire buisjes. Het toont aan dat beide benaderingen haalbaar zijn voor medaka en laat zien dat buikmassage een herhaald aantal keren kan worden uitgevoerd, omdat de vis snel herstelt van de procedure. Het beschrijft ook een protocol voor computerondersteunde spermaanalyse in medaka om op betrouwbare wijze verschillende belangrijke indicatoren van medaka-spermakwaliteit te meten (beweeglijkheid, progressiviteit, levensduur en relatieve spermaconcentratie). Deze procedures, gespecificeerd voor dit nuttige kleine teleostmodel, zullen het begrip van de omgevings-, fysiologische en genetische factoren die de vruchtbaarheid bij gewervelde mannen beïnvloeden, aanzienlijk verbeteren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>Any standard brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>2-000-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x objective with phase contrast</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRP90100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-c-s</td>
			<td>Any standard brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt smooth forceps</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 20 micron counting chamber slide</td>
			<td>Microptic</td>
			<td>20.2.25&#160;</td>
			<td>Leja 2 chamber slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td>Any standard brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11253-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>H8264-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding sponge</td>
			<td>self-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ts2R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCA Evolution</td>
			<td>Microptic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small dissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop vortex</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>C1301B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sperm collection and computer-assisted sperm analysis in the teleost model japanese medaka (oryzias latipes)

Japanse medaka (Oryzias latipes) is een teleostvis en een opkomend gewerveld model voor ecotoxicologie, ontwikkelings-, genetica- en fysiologieonderzoek. Medaka wordt ook op grote schaal gebruikt om de voortplanting van gewervelde dieren te onderzoeken, wat een essentiële biologische functie is omdat het een soort in staat stelt om te bestendigen. De kwaliteit van het sperma is een belangrijke indicator voor de mannelijke vruchtbaarheid en dus het succes van de voortplanting. Technieken voor het extraheren van sperma- en spermaanalyse zijn goed gedocumenteerd voor veel soorten, waaronder teleostvissen. Het verzamelen van sperma is relatief eenvoudig in grotere vissen, maar kan ingewikkelder zijn in kleine modelvissen omdat ze minder sperma produceren en delicater zijn. Dit artikel beschrijft daarom twee methoden voor het verzamelen van sperma in de kleine modelvis, Japanse medaka: teelballendissectie en buikmassage. Dit artikel toont aan dat beide benaderingen haalbaar zijn voor medaka en laat zien dat buikmassage een herhaald aantal keren kan worden uitgevoerd, omdat de vissen snel herstellen van de procedure. Dit artikel beschrijft ook een protocol voor computerondersteunde spermaanalyse in medaka om objectief verschillende belangrijke indicatoren van medaka-spermakwaliteit te beoordelen (motiliteit, progressiviteit, duur van motiliteit, relatieve concentratie). Deze procedures, gespecificeerd voor dit nuttige kleine teleostmodel, zullen het begrip van de omgevings-, fysiologische en genetische factoren die de vruchtbaarheid bij gewervelde mannen beïnvloeden, aanzienlijk verbeteren.

Soort verkregen gegevens Spermamotiliteitsanalyse van de SCA Evolution-software biedt gegevens over beweeglijkheid (percentage beweeglijk en immotiel sperma), evenals progressiviteit (percentage progressief en niet-progressief sperma) en snelheid (percentage snel, gemiddeld en langzaam bewegend sperma). Het combineert ook progressiviteit en snelheid (snel progressief, gemiddeld progressief, niet-progressief). Deze labels zijn gebaseerd op metingen (figuur 3A) en berekenin...

Watch this Scientific Journal Video about Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes at JoVE.com

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

Dit artikel beschrijft twee snelle en efficiënte methoden voor het verzamelen van sperma van het kleine modelvis medaka (Oryzias latipes), evenals een protocol voor het betrouwbaar beoordelen van de spermakwaliteit met behulp van computerondersteunde spermaanalyse (CASA).

Spermaverzameling en computerondersteunde spermaanalyse in het Teleost-model Japanse Medaka (Oryzias latipes)

Japanese medaka (Oryzias latipes) is a teleost fish and&#160;an emerging vertebrate model for ecotoxicology, developmental, genetics, and physiology ...

Deze techniek maakt het mogelijk om milt te bemonsteren van een kleine modelvis, Japanse Madaka, en de kwaliteit ervan op een consistente manier te onderzoeken. Specifiek spermaverzameling door buikmassage maakt herhaalde bemonstering op dezelfde vis mogelijk, omdat deze aanpak niet invasief is. Bovendien kan deze techniek worden toegepast voor Madaka sperma cryo conservering.Spermakwaliteit is een essentiële indicator voor bevruchtingssucces en daarom een belangrijke parameter om te analyseren in ecologische en hele productieve fysiologiestudies. Om te beginnen, bereid een zachte spons, door deze te snijden om zelfvoldaan in een petrischaaltje te passen. Knip een rechte lijn in het midden van de spons, die lang genoeg is om de vis op zijn ventrale kant omhoog te houden.Na het verdoven van de vis, droog de buik van de vis door deze voorzichtig af te vegen met een papieren handdoek. Plaats de vis in de trog van de vochtige spons met de ventrale kant naar boven, zodat de kieuwen worden blootgesteld aan de verdovingsoplossing in de spons. Als het gebied rond de cloaca nat is, droog dan voorzichtig de onderkant van de buik met een wegwerpdoekje.Plaats onder een ontleedmicroscoop de micropipet met een bijgevoegde aspiratorbuis tegen de cloaca van de vis. Masseer nu de buik van de vis door zachtjes te knijpen met een stompe gladde tang in een rostrale tot caudale beweging. Voor herstel van de vis, laat het los van de spons in het eerder voorbereide herstelwater voordat u de vis terugbrengt naar het aquariumsysteem.Breng de verzamelde milt meerdere keren over in een buis met voorverwarmde activeringsoplossing en pipetoplossing meerdere keren op en neer met behulp van de aspiratorbuis. Homogeniseer het verdunde sperma voorzichtig door vóór de analyse over de buisjes te vegen. Na het euthanaseren van de vis drogen zoals eerder aangetoond en plaats de vis onder een ontleedmicroscoop met de linker laterale kant naar boven gericht.Knip met behulp van een kleine ontleedschaar een flap dorsaal van de cloaca en vervolgens over de ribben naar de kieuwen om de inwendige organen bloot te leggen. Lokaliseer de teelballen en snijd het hulpstuk aan beide uiteinden met een fijne tang. Verwijder de teelballen en breng ze over in een voorbereide buis met voorverwarmde activeringsoplossing.Gebruik de tang om de teelballen meerdere keren tegen de zijkant van de buis te verpletteren om het sperma vrij te maken, wat kan worden gevisualiseerd door het enigszins troebele uiterlijk van de oplossing. Om de analyse te starten, opent u de spermaanalysesoftware en selecteert u de beweeglijkheidsmodule. Stel de configuraties in de software in voor alle parameters.Plaats een voorverwarmde wegwerpschuif van 20 micrometer telkamer onder de microscoop op een verwarmd podium, ingesteld op 27 graden Celsius. Pipetteer het monster in de kamer op de dia totdat het vol is, maar zonder overvulling. Veeg overtollige monsters voorzichtig weg van de ingang van de kamer om driftbeweging van cellen in de oplossing te voorkomen.Selecteer analyseren om het monster onder de microscoop te bekijken. Zorg ervoor dat de microscoop gefocust is en selecteer opnieuw analyseren om het sperma in het veld op te nemen. Verplaats de dia naar een nieuw gebied van het monster in het frame en herhaal de procedure voor drie tot vijf verschillende gezichtsvelden, waarbij luchtbellen, celmassa's of artefacten worden vermeden.Om de resultaten te bekijken, selecteert u de resultaten en dubbelklikt u op een veld om het individuele veld te visualiseren of om handmatig te controleren op verkeerd gelabelde of niet-gevolgde spermatozoa. Klik indien nodig met de rechtermuisknop op individuele spermatozoa om de beweeglijkheid opnieuw te labelen. In de huidige studie werd computerondersteunde spermaanalyse gebruikt om verschillende snelheids- en bewegingsparameters vast te leggen.De berekende waarden omvatten de rechtheidsindex, lineariteitsindex en wiebel. De osmolariteit van de activeringsoplossingen had invloed op de beweeglijkheid van het sperma door de dissectie van de teelballen. Het sperma was immoreel in aquariumwater, maar beweeglijk in HBSS met hoge en lage osmolariteit.De beweeglijkheid is echter aanzienlijk verminderd met 36 milli osmol per kilogram, vergeleken met oplossingen met een hogere osmolaliteit. Motiliteit werd ook beïnvloed door de spermaverzamelingsmethode, waarbij het sperma aanzienlijk beweeglijker is in de testisdissectiemethode in vergelijking met buikmassage. Ook was een hoger percentage van de cellen progressief en meer cellen waren gemiddeld of snel bewegend.Het percentage beweeglijkheid en progressiviteit zijn aanzienlijk hoger in het sperma dat is opgeslagen bij vier graden Celsius of op ijs, vergeleken met 27 graden Celsius opslag. De omgevings- en huisvestingsomstandigheden hadden ook een lichte invloed op de beweeglijkheid van het sperma. Er werd geen significant verschil in beweeglijkheid van het sperma gezien in het sperma dat na en vóór het paaien werd verzameld.Mannetjes die een maand zonder vrouwtjes werden gehuisvest, vertoonden een hoge beweeglijkheid, maar het verschil was onbeduidend. Voor spermaverzameling door buikmassage is training nodig om de juiste tangdruk en beweging te leren en om feced besmetting te voorkomen. Deze techniek zal zeer nuttig zijn om bijvoorbeeld de effecten van verschillende verontreinigende stoffen op de mannelijke vruchtbaarheid te onderzoeken in ecotoxicologial studies, waar Medaka een veelgebruikt model is.

Research

JoVE Journal

Biology

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

Oogsten Sperma en kunstmatige inseminatie van Muizen

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals.  Peromyscus species are used in a wide range of research ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

Een high-throughput-methode voor zebravis sperma cryopreservatie en In Vitro Bevruchting

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Fluorescentie In situ Hybridisatie (FISH) Protocol in menselijk sperma

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Technieken voor Imaging Ca 2 + Signalering in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolatie en In vitro Activering van Caenorhabditis elegans Sperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

Computer-assisted Grootschalige visualisatie en kwantificering van eilandjes van Langerhans massa, afmetingen Distributie en Architectuur

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Twee Soorten Assays voor het detecteren van Kikker Sperma chemoattractie

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Muis Sperma Cryopreservatie en herstel met behulp van de I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Het beoordelen van verschillen in sperma concurrerend vermogen in<em&gt; Drosophila</em

Competition among conspecific males for fertilizing the ova is one of the mechanisms of sexual selection, i.e. selection that operates on maximizing the ...

Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

Aviaire-sperma door cloaca Massage en isolatie van DNA van sperma

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...