Name: sperm collection and computer-assisted sperm analysis in the teleost model japanese medaka (oryzias latipes)
Uploaded: 2022-10-06T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes at JoVE.com

עבודה זו מומנה על ידי האוניברסיטה הנורבגית למדעי החיים ותוכנית פולברייט האמריקאית. המחברים רוצים להודות לאנתוני פלטייה וללורדס קאריון ג'י טאן מ-NMBU על תחזוקת מתקני הדגים ולגיום גורמלין מ-ISC LPGP ב-INRAE (צרפת) על כך שסיפקו לדגים ולמעבדה שטח לבדיקה נוספת של שיטות אלה.

כל הניסויים והטיפול בבעלי חיים נערכו בהתאם להמלצות על רווחת בעלי חיים ניסיוניים באוניברסיטה הנורבגית למדעי החיים (NMBU). הניסויים בוצעו באמצעות זכרי מדאקה (זן Hd-rR) זכרים בוגרים (בני 6-9 חודשים) שגודלו ב-NMBU (Ås, נורבגיה). השיטות נבדקו לזמן קצר גם במדאקה יפנית זכרית בת 9 חודשים (זן CAB) שגדלה במכון המח...

אוסמולליות היא גורם חשוב בהפעלת זרע דגים36,37. באופן כללי, זרעונים הם תנועתיים באשכים והופכים תנועתיים במדיה שהיא היפרוסמוטית ביחס לנוזל הזרע עבור דגים ימיים, והיפו-אוסמוטי ביחס לנוזל הזרע עבור דגי מים מתוקים37. בדומה לדם, פלזמת הזרע בדגי מים מתוק...

מדאקה יפנית היא דג טלוסט קטן המטיל ביצים במים מתוקים שמקורו במזרח אסיה. מדאקה הפכה למערכת מודל מצוינת של בעלי חוליות עבור אקוטוקסיקולוגיה, גנטיקה התפתחותית, גנומיקה, ביולוגיה אבולוציונית ומחקרי פיזיולוגיה 1,2. בדומה לדגי הזברה הפופולריים, הם קלים יחסית לגידול ועמידים מאוד למחלות דגים נפוצות רבות 1,2. ישנם מספר יתרונות לשימוש במדאקה כמודל, כולל זמן דור קצר, עוברים שקופים 1,2 וגנום מרוצף3. שלא כמו דגי זברה, למדאקה יש גן הקובע את המין4 וכן טמפרטורה גבוהה (בין 4-40 מעלות צלזיוס) וסבילות מליחות (מינים אוריהלינים)5. כמו כן, כלים גנטיים ואנטומיים רבים, כמו גם פרוטוקולים 6,7,8,9,10,11,12, פותחו במדאקה כדי להקל על חקר הביולוגיה שלה.
רבייה היא פונקציה פיזיולוגית חיונית מכיוון שהיא מאפשרת למין להנציח. רבייה של בעלי חוליות דורשת מספר עצום של אירועים מתוזמרים במדויק, כולל ייצור ביציות אצל נקבות וייצור זרע אצל זכרים. זרע הם תאים ייחודיים, המיוצרים בתהליך מורכב של זרעונים, שבו ישנם מספר מחסומים במקום כדי להבטיח אספקה של מוצר באיכות גבוהה13. איכות הגמטה הפכה למוקד בחקלאות ימית ובחקר אוכלוסיות דגים בשל השפעתה על הצלחת ההפריה והישרדות הזחלים. איכות הזרע היא, אם כן, אינדיקטור חשוב לפוריות הגבר אצל בעלי חוליות.
שלושה גורמים שימושיים להערכת איכות זרע הדגים הם תנועתיות, התקדמות ואריכות ימים. תנועתיות באחוזים ותנועתיות פרוגרסיבית הם אינדיקטורים נפוצים לאיכות הזרע שכן תנועה פרוגרסיבית נחוצה ומתואמת מאוד עם הצלחת ההפריה14,15. משך התנועה הוא גם אינדיקטור חשוב בדגים שכן הזרע נשאר תנועתי באופן מלא במשך פחות מ -2 דקות ברוב מיני הטלוסט ומסלול הזרע הוא בדרך כלל פחות ליניארי מאשר ביונקים15. עם זאת, מחקרים רבים שהעריכו את תנועתיות הזרע בעבר הסתמכו על שיטות סובייקטיביות או כמותיות למחצה לניתוח זרע15,16. לדוגמה, תנועתיות הזרע במדאקה הוערכה בעבר באופן חזותי תחת מיקרוסקופ17. כמו כן, הוא הוערך על ידי רישום תנועת זרע ושימוש בתוכנת הדמיה למיזוג מסגרות ומדידת נתיב שחייה ומהירות18,19,20. גישות כאלה לעתים קרובות חסרות חוסן, ומספקות תוצאות שונות בהתאם לאדם המבצע את הניתוח 15,21.
ניתוח זרע בעזרת מחשב (CASA) פותח בתחילה עבור יונקים. CASA היא שיטה כמותית מהירה להערכת איכות הזרע על ידי הקלטה ומדידה של מהירות ומסלול באופן אוטומטי15. בדגים, הוא שימש במינים שונים כדי לפקח על ההשפעות של כמה מזהמי מים על איכות הזרע, לזיהוי אבות מעניינים כדי לשפר broodstock, כדי לשפר את היעילות של שימור בהקפאה ואחסון, כדי לייעל את התנאים להפריה15. לכן, זהו כלי רב עוצמה להערכה אמינה של איכות הזרע במינים שונים של בעלי חוליות. עם זאת, בשל המגוון החשוב באסטרטגיות הרבייה בין דגים, הזרע של דגי הטלוסט שונה מזה של יונקים וממין דג אחד למשנהו. לדגי טלוסט, המפרים בעיקר ביציות חיצונית על ידי שחרור גמטות למים, יש זרע מרוכז מאוד שהוא פשוט יחסית במבנה ללא אקרוזום, בניגוד ליונקים, אשר מפרים פנימית ולכן אינם צריכים לפצות על דילול במים, אך כן צריכים לעמוד בנוזלים צמיגים יותר14. בנוסף, זרע מרוב הדגים נע במהירות אך הוא תנועתי לחלוטין במשך פחות מ -2 דקות לאחר ההפעלה, אם כי ישנם מספר יוצאים מן הכלל15,22. מכיוון שהתנועתיות יכולה לרדת במהירות אצל רוב הדגים, יש לנקוט בזהירות רבה עם תזמון הניתוח לאחר ההפעלה בעת קביעת פרוטוקול ניתוח זרע לדגים.
רבייה היא אחד התחומים בביולוגיה שבהם טלאוסטים ומדאקה שימשו באופן נרחב כאורגניזמי מודל. ואכן, זכרי מדאקה מראים התנהגויות רבייה וחברתיות מעניינות, כגון שמירה עלהזדווגות 23,24. בנוסף, קיימים מספר קווים מהונדסים כדי לחקור את השליטה הנוירואנדוקרינית של רבייה במין זה25,26,27. דגימת זרע, הליך שהוא פשוט יחסית בדגים גדולים יותר, יכולה להיות מסובכת יותר בדגי מודל קטנים מכיוון שהם מייצרים פחות זרע והם עדינים יותר. מסיבה זו, רוב המחקרים הכוללים דגימת זרע בתמצית medaka milt (זרע דגים) על ידי ריסוק אשכים מנותחים 17,28,29,30. כמה מחקרים משתמשים גם בעיסוי בטן שונה כדי לבטא את המילט ישירות להפעלתמדיום 18,19,20; עם זאת, בשיטה זו קשה לדמיין את כמות וצבע של Milt שחולץ. אצל דגי זברה, עיסוי בטן משמש בדרך כלל כדי להביע milt, אשר נאסף מיד בצינור נימי31,32,33. שיטה זו מאפשרת להעריך את נפח המילט, כמו גם תצפית על צבע השפיכה, המהווה אינדיקטור מהיר ופשוט לאיכות הזרע32,33. לכן, פרוטוקול ברור ומתואר היטב לאיסוף וניתוח זרע חסר למדקה.
מאמר זה מתאר אפוא שתי שיטות לאיסוף זרע בדגם הקטן של דג מדאקה יפני: דיסקציה של האשכים ועיסוי בטן עם צינורות נימיים. הוא מדגים כי שתי הגישות אפשריות למדאקה ומראה כי ניתן לבצע עיסוי בטן מספר חוזר ונשנה של פעמים כאשר הדג מתאושש במהירות מההליך. הוא גם מתאר פרוטוקול לניתוח זרע בסיוע מחשב במדאקה כדי למדוד באופן מהימן מספר אינדיקטורים חשובים לאיכות הזרע של medaka (תנועתיות, התקדמות, אריכות ימים וריכוז זרע יחסי). הליכים אלה, המפורטים עבור מודל טלוסט קטן ושימושי זה, ישפרו מאוד את ההבנה של הגורמים הסביבתיים, הפיזיולוגיים והגנטיים המשפיעים על הפוריות אצל זכרים בעלי חוליות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>Any standard brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L disposable calibrated glass micropipette and aspirator tube assembly</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>2-000-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x objective with phase contrast</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRP90100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-c-s</td>
			<td>Any standard brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt smooth forceps</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable 20 micron counting chamber slide</td>
			<td>Microptic</td>
			<td>20.2.25&#160;</td>
			<td>Leja 2 chamber slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td>Any standard brand can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11253-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>H8264-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding sponge</td>
			<td>self-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ts2R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCA Evolution</td>
			<td>Microptic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small dissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop vortex</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>C1301B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigmaaldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sperm collection and computer-assisted sperm analysis in the teleost model japanese medaka (oryzias latipes)

מדאקה יפנית (Oryzias latipes) היא דג טלוסט ומודל מתפתח של בעלי חוליות למחקר אקוטוקסיקולוגיה, התפתחות, גנטיקה ופיזיולוגיה. מדאקה משמשת באופן נרחב גם כדי לחקור רבייה של בעלי חוליות, שהיא פונקציה ביולוגית חיונית מכיוון שהיא מאפשרת למין להנציח. איכות הזרע היא אינדיקטור חשוב לפוריות הגבר, ובכך להצלחת הרבייה. טכניקות להפקת זרע וניתוח זרע מתועדות היטב עבור מינים רבים, כולל דגי טלוסט. איסוף זרע הוא פשוט יחסית בדגים גדולים יותר, אך יכול להיות מסובך יותר בדגים קטנים מכיוון שהם מייצרים פחות זרע והם עדינים יותר. מאמר זה, אם כן, מתאר שתי שיטות לאיסוף זרע בדג המודל הקטן, מדאקה יפנית: דיסקציה של האשכים ועיסוי בטן. מאמר זה מדגים כי שתי הגישות אפשריות עבור medaka ומראה כי עיסוי בטן יכול להתבצע מספר חוזר של פעמים כאשר הדגים מתאוששים במהירות מההליך. מאמר זה מתאר גם פרוטוקול לניתוח זרע בעזרת מחשב במדאקה כדי להעריך באופן אובייקטיבי מספר אינדיקטורים חשובים לאיכות הזרע של medaka (תנועתיות, התקדמות, משך תנועתיות, ריכוז יחסי). הליכים אלה, המפורטים עבור מודל טלוסט קטן ושימושי זה, ישפרו מאוד את ההבנה של הגורמים הסביבתיים, הפיזיולוגיים והגנטיים המשפיעים על הפוריות אצל זכרים בעלי חוליות.

סוג הנתונים שהתקבלו ניתוח תנועתיות זרע מתוכנת SCA Evolution מספק נתונים על תנועתיות (אחוז הזרע התנועתי והלא תנועתי), כמו גם על התקדמות (אחוז הזרע המתקדם והלא פרוגרסיבי), ומהירות (אחוז הזרע המהיר, הבינוני והאיטי). הוא גם משלב התקדמות ומהירות (פרוגרסיבי מהיר, פרוגרסיבי בינוני, לא פרוגרסיב...

Watch this Scientific Journal Video about Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes at JoVE.com

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

מאמר זה מתאר שתי שיטות מהירות ויעילות לאיסוף זרע מדאקה דג מודל קטן (Oryzias latipes), כמו גם פרוטוקול להערכה אמינה של איכות הזרע באמצעות ניתוח זרע בעזרת מחשב (CASA).

איסוף זרע וניתוח זרע בעזרת מחשב במודל הטלוסט מדאקה היפנית (Oryzias latipes)

Japanese medaka (Oryzias latipes) is a teleost fish and&#160;an emerging vertebrate model for ecotoxicology, developmental, genetics, and physiology ...

טכניקה זו מאפשרת דגימה של דג מדוגמנית קטנה, מדאקה יפנית, ולחקור את איכותו באופן עקבי. באופן ספציפי איסוף זרע על ידי עיסוי בטן מאפשר דגימה חוזרת על אותו דג כמו גישה זו אינה פולשנית. יתר על כן, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת עבור שימור זרע קריו מאדאקה.איכות הזרע היא אינדיקטור חיוני להצלחת ההפריה, ולכן פרמטר חשוב לניתוח במחקרים פיזיולוגיים אקולוגיים ויצרניים שלמים. כדי להתחיל, הכינו ספוג אחיזה רך, על ידי חיתוך שלו כך שיתאים לצלחת פטרי. חותכים קו ישר באמצע הספוג, שהוא ארוך מספיק כדי להחזיק את הדג בצד הגחון שלו למעלה.לאחר הרדמת הדג, יבשו את בטן הדג על ידי ניגוב עדין במגבת נייר. הניחו את הדג בשוקת של ספוג ההחזקה הלח כשצד הגחון כלפי מעלה, כך שהזימים שלו נחשפים לתמיסת ההרדמה שבספוג. אם האזור סביב הקלואקה רטוב, יבשו בעדינות את החלק התחתון של הבטן עם מגבון טישו חד פעמי.תחת מיקרוסקופ מנתח, מניחים את המיקרו פיפטה עם צינור שואב שואב מחובר כנגד הקלואקה של הדג. כעת עסו את בטן הדג על ידי סחיטה עדינה עם מלקחיים חלקים בקצה קהה בתנועה רוסטרלית עד קאודלית. להתאוששות הדג, שחררו אותו מהספוג למי ההתאוששות שהוכנו קודם לכן לפני החזרת הדג למערכת האקווריום.העבירו את המילט שנאסף לתוך צינור המכיל תמיסת הפעלה מחוממת מראש ותמיסת פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים באמצעות מכלול צינור השואף. הומוגניזציה של הזרע המדולל בעדינות על ידי הזזת הצינורות לפני הניתוח. לאחר הרדמת הדג ייבשו אותו כפי שהוכח קודם לכן והניחו את הדג תחת מיקרוסקופ מנתח כאשר צדו השמאלי הצדדי פונה כלפי מעלה.באמצעות מספריים קטנים לנתח, לחתוך דש dorsally מן cloaca ולאחר מכן על פני הצלעות אל הזימים כדי לחשוף את האיברים הפנימיים. מאתרים את האשכים וחותכים את החיבור בשני הקצוות בעזרת מלקחיים עדינים. הסר את האשכים והעבר אותם לצינור מוכן המכיל תמיסת הפעלה מחוממת מראש.השתמש מלקחיים כדי למחוץ את האשכים מספר פעמים נגד הצד של הצינור כדי לשחרר את הזרע, אשר ניתן לדמיין על ידי המראה מעונן מעט של הפתרון. כדי להתחיל בניתוח, פתח את תוכנת ניתוח הזרע ובחר את מודול התנועתיות. הגדר את התצורות בתוכנה עבור כל הפרמטרים.הניחו שקופית חד פעמית של 20 מיקרומטר שחוממה מראש מתחת למיקרוסקופ על במה מחוממת, בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס. צמחו את הדגימה לתוך התא בשקופית עד שהיא מתמלאת, אך ללא מילוי יתר. נגבו בזהירות דגימות עודפות מכניסת החדר כדי למנוע תנועת סחף של תאים בתמיסה.בחר נתח כדי להסתכל על הדגימה מתחת למיקרוסקופ. ודא שהמיקרוסקופ ממוקד ובחר לנתח שוב כדי להקליט את הזרע בשדה. העבר את השקופית לאזור חדש של הדגימה במסגרת וחזור על ההליך עבור שלושה עד חמישה שדות ראייה שונים, תוך הימנעות מבועות אוויר, מסות תאים או לכלוכים.כדי להציג את התוצאות, בחר תוצאות ולחץ פעמיים על שדה כדי להציג באופן חזותי את השדה הבודד או כדי לבדוק באופן ידני אם קיימים זרעונים עם תווית שגויה או ללא מעקב. במידת הצורך, לחץ לחיצה ימנית על זרעונים בודדים כדי לתייג מחדש את התנועתיות. במחקר הנוכחי, ניתוח זרע בסיוע מחשב שימש לרישום פרמטרים שונים של מהירות ותנועה.הערכים המחושבים כוללים את מדד הישרות, מדד הלינאריות והתנדנדות. האוסמולריות של פתרונות ההפעלה השפיעה על תנועתיות הזרע מנתיחת האשכים. הזרע היה תנועתי במי האקווריום, אך תנועתי ב- HBSS עם אוסמולריות גבוהה ונמוכה.עם זאת, תנועתיות מופחתת באופן משמעותי ב 36 מילי אוסמול לקילוגרם, לעומת פתרונות osmolality גבוה יותר. תנועתיות הושפעה גם משיטת איסוף הזרע, שבה הזרע תנועתי יותר באופן משמעותי בשיטת ניתוח האשכים בהשוואה לעיסוי בטן. כמו כן, אחוז גבוה יותר מהתאים היו פרוגרסיביים ויותר תאים היו בינוניים או מהירים.אחוז התנועתיות וההתקדמות גבוה משמעותית בזרע המאוחסן בארבע מעלות צלזיוס או על קרח, בהשוואה לאחסון של 27 מעלות צלזיוס. גם תנאי הסביבה והדיור השפיעו מעט על תנועתיות הזרע. לא נצפה הבדל משמעותי בתנועתיות הזרע שנאסף לאחר ההשרצה ולפניה.זכרים ששוכנו ללא נקבות במשך חודש הראו תנועתיות גבוהה, אך ההבדל לא היה משמעותי. לאיסוף זרע על ידי עיסוי בטן, יש צורך באימון כדי ללמוד את הלחץ והתנועה הנכונים של מלקחיים ולמנוע זיהום צואה. טכניקה זו תהיה שימושית מאוד כדי לחקור למשל, את ההשפעות של מזהמים מגוונים על פוריות הגבר במחקרים אקוטוקסיקולוגיים, שבהם מדאקה היא מודל נפוץ.

Research

JoVE Journal

Biology

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

קצירת הזרע והזרעה מלאכותית של עכברים

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals.  Peromyscus species are used in a wide range of research ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

שיטת תפוקה גבוהה עבור cryopreservation זרע דג הזברה במבחנה הפריה

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

פלואורסצנציה באתרו הכלאה (FISH) פרוטוקול של זרע אדם

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

טכניקות הדמיה Ca 2 + איתות זרע אנושי

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

בידוד במבחנה הפעלת Caenorhabditis elegans זרע

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

בסיוע מחשב ויזואליזציה בקנה מידה גדול כימות המוניים הלבלב איילט, התפלגות גודל ואדריכלות

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

שני סוגים של מבחני עבור Chemoattraction גילוי זרע צפרדע

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

הזרע עכבר cryopreservation ושחזור באמצעות · אני cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

הבדלי שומה ביכולת תחרותית בזרע<em&gt; דרוזופילה</em

Competition among conspecific males for fertilizing the ova is one of the mechanisms of sexual selection, i.e. selection that operates on maximizing the ...

Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

אוסף העופות זרע על ידי עיסוי Cloacal ובידוד של ה-DNA של הזרע

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...