Name: tyramide signal amplification for the immunofluorescent staining of zbp1-dependent phosphorylation of ripk3 and mlkl after hsv-1 infection in human cells
Uploaded: 2022-10-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells at J

نود أن نشكر VIB Bioimaging Core على التدريب والدعم والوصول إلى حديقة الأدوات. يتم دعم JN من خلال زمالة الدكتوراه من مؤسسة الأبحاث فلاندرز (FWO). تم دعم البحث في مجموعة JM من خلال منحة Odysseus II (G0H8618N) ، و EOS INFLADIS (40007512) ، ومنحة بحثية مبتدئة (G031022N) من مؤسسة الأبحاث فلاندرز (FWO) ، ومنحة إثبات المفهوم من CRIG للباحثين الشباب ، ومن جامعة غنت. تم دعم البحث في مجموعة P.V. من قبل EOS MODEL-IDI (30826052) و EOS INFLADIS (40007512) ومنح أبحاث FWO العليا (G.0C76.18N و G.0B71.18N و G.0B96.20N و G.0A9322N) و Methusalem (BOF16 / MET_V/007) و iBOF20 / IBF / 039 ATLANTIS و Foundation Against Cancer (F / 2016/865 و F / 2020/1505) واتحادات CRIG و GIGG و VIB.

1. إعداد تيراميد البيوتينيل
<ol><li>تحضير تيراميد البيوتينيل بدءا من البيوتين تيراميد. لعمل محلول مخزون 10 مللي متر ، قم بإذابة 3.6 مجم من البيوتين تيراميد في 1 مل من DMSO. قم بتخزين المنتج المذاب في حصص عند -20 درجة مئوية للحفاظ على الجودة.</li>
</ol>2. الحفاظ على خلايا HT-29 في الث?...

<ol>
	<li>Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+necroptosis+by+post-translational+modifications.">The regulation of necroptosis by post-translational modifications.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).</li><li>Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+necroptotic+cell+death+signaling.">The structural basis of necroptotic cell death signaling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).</li><li>Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis:+The+Trojan+horse+in+cell+autonomous+antiviral+host+defense.">Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense.</a> Virology. 479-480, 160-166 (2015).</li><li>Nailwal, H., Chan, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+in+anti-viral+inflammation.">Necroptosis in anti-viral inflammation.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).</li><li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+RIPK3+maintains+MLKL+in+an+inactive+conformation+prior+to+cell+death+by+necroptosis.">Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis.</a> Nature Communications. 12 (1), 6783 (2021).</li><li>Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location,+location,+location:+A+compartmentalized+view+of+TNF-induced+necroptotic+signaling.">Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling.</a> Science Signalling. 14 (668), (2021).</li><li>Koehler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+E3+prevents+sensing+of+Z-RNA+to+block+ZBP1-dependent+necroptosis.">Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis.</a> Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).</li><li>Balachandran, S., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Z-RNA+triggers+ZBP1-dependent+cell+death.">Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death.</a> Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).</li><li>Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZBP1:+Innate+sensor+regulating+cell+death+and+inflammation.">ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation.</a> Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).</li><li>Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+sensors+and+programmed+cell+death.">Nucleic acid sensors and programmed cell death.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).</li><li>Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+manipulation+of+host+cell+necroptosis+and+pyroptosis.">Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis.</a> Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+suppresses+necroptosis+in+human+cells.">Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+(HSV-1)+and+HSV-2+mediate+species-specific+modulations+of+programmed+necrosis+through+the+viral+ribonucleotide+reductase+large+subunit+R1.">Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1.</a> Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP1/RIP3+binding+to+HSV-1+ICP6+initiates+necroptosis+to+restrict+virus+propagation+in+mice.">RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-independent+contribution+of+ZBP1/DAI/DLM-1-triggered+necroptosis+in+host+defense+against+HSV1.">Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (8), 816 (2018).</li><li>Devos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+of+endogenous+nucleic+acids+by+ZBP1+induces+keratinocyte+necroptosis+and+skin+inflammation.">Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).</li><li>Jiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Z-nucleic-acid+sensing+triggers+ZBP1-dependent+necroptosis+and+inflammation.">Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation.</a> Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).</li><li>de Reuver, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+prevents+autoinflammation+by+suppressing+spontaneous+ZBP1+activation.">ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation.</a> Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).</li><li>Jiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+averts+fatal+type+I+interferon+induction+by+ZBP1.">ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1.</a> Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).</li><li>Hubbard, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+mutation+causes+ZBP1-dependent+immunopathology.">ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology.</a> Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+masks+the+cancer+immunotherapeutic+promise+of+ZBP1-driven+necroptosis.">ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis.</a> Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).</li><li>Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin+amplification+of+biotin+and+horseradish+peroxidase+signals+in+histochemical+stains.">Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).</li><li>Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+DNA+and+mRNA+in+situ+hybridization.">Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization.</a> Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).</li><li>Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+analysis+of+kinase+activity+by+intracellular+flow+cytometry.">Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry.</a> Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).</li><li>Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+mass+spectrometry+(TSA-MS)+ratio+identifies+nuclear+speckle+proteins.">Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).</li><li>Samson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+for+imaging+RIPK1,+RIPK3,+and+MLKL+in+mouse+and+human+cells.">A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells.</a> Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).</li><li>De Groote, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+new+gateway-compatible+inducible+lentiviral+vector+platform+allowing+easy+derivation+of+co-transduced+cells.">Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells.</a> Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).</li><li>Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+ICP6+impedes+TNF+receptor+1-induced+necrosome+assembly+during+compartmentalization+to+detergent-resistant+membrane+vesicles.">Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).</li><li>Mandal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP3+induces+apoptosis+independent+of+pronecrotic+kinase+activity.">RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity.</a> Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+Z-RNAs+induce+ZBP1-mediated+necroptosis.">Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis.</a> Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).</li><li>Garnish, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+interconversion+of+MLKL+and+disengagement+from+RIPK3+precede+cell+death+by+necroptosis.">Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis.</a> Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).</li><li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification.">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedural+requirements+and+recommendations+for+multiplex+immunofluorescence+tyramide+signal+amplification+assays+to+support+translational+oncology+studies.">Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies.</a> Cancers. 12 (2), 255 (2020).</li></ol>

يصف بروتوكول التلوين المناعي هذا استخدام تضخيم إشارة التيراميد (TSA) لزيادة الحساسية لأحداث الإشارات لمسار الإشارات النخرية البشرية التي يصعب اكتشافها ، بما في ذلك فسفرة RIPK3 و MLKL26. يؤدي تضمين خطوة TSA إلى تحسين عتبة الكشف بشكل كبير من p-RIPK3 (S227) و p-MLKL (S358) ويزيد من حساسية إجهاد p-MLKL (S3...

تفاعل مستقبلات سيرين / ثريونين بروتين كيناز 3 (RIPK3) ومجال كيناز السلالة المختلطة (MLKL) هي منظمات مركزية لموت الخلايا النخرية 1,2. Necroptosis هو شكل من أشكال lytic والتهابات من موت الخلايا المنظم تشارك في المناعة المضادة للفيروسات والتهاب ذاتي. يؤدي تنخر الخلايا المصابة بالفيروس إلى إيقاف تكاثر الفيروس على الفور. يؤدي تحلل الخلايا بعد تحريض التنخر أيضا إلى إطلاق أنماط جزيئية مرتبطة بالضرر ، والتي تحفز المناعة المضادة للفيروسات 3,4. يبدأ Necroptosis من خلال تنشيط RIPK3 بعد تفاعلات تفاعل RIP المتجانسة (RHIM) بوساطة واحد من ثلاثة جزيئات تنشيط المنبع: RIPK1 (عند مشاركة مستقبلات TNF 1 [TNFR1]) ، β الإنترفيرون الذي يحتوي على محول يحتوي على مجال TIR (TRIF ؛ عند اشتباك المستقبلات الشبيهة بالرقم 3 و 4) ، أو مستشعر الحمض النووي المضاد للفيروسات Z-DNA بروتين ملزم 1 (ZBP1) 1,2 . تستمر إشارات Necroptosis من خلال سلسلة من أحداث الفسفرة بدءا من الفسفرة الذاتية ل RIPK3. تعد الفسفرة الذاتية ل RIPK3 البشري في سيرين (S) 227 داخل مجال كيناز الخاص بها شرطا أساسيا للنخر من خلال تمكين التفاعل مع MLKL وتستخدم بشكل شائع كعلامة كيميائية حيوية لتنشيط RIPK3 البشري وموت الخلايا النخرية 1,5. بمجرد تنشيطه ، يقوم RIPK3 بفسفرة حلقة تنشيط MLKL عند ثريونين (T) 357 و S3581. يؤدي هذا إلى تغيير في تشكيل MLKL ، مما يؤدي إلى تعرض مجال حزمة الحلزون الأربعة N-terminal. ثم يقوم MLKL بقليل القلة والاتجار إلى غشاء الخلية حيث يشكل مسام من خلال إدخال الحزم الحلزونية الأربعة المكشوفة في طبقة الدهون المزدوجة ، مما يؤدي في النهاية إلى موت الخلية 2,6.
ZBP1 هو مستشعر حمض نووي مضاد للفيروسات يتعرف على الأحماض النووية اليسرى على شكل Z بما في ذلك الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل في تشكيل Z (Z-RNA). يحدث ارتباط Z-RNA عبر نطاقين Zα متمركزين في النهاية N ل ZBP1. يعتقد أن Z-RNA المتراكم أثناء الإصابة بفيروس الحمض النووي الريبي والحمض النووي يشرك مباشرة ZBP1 7,8. يقوم ZBP1 المنشط بتجنيد RIPK3 من خلال RHIMs المركزية الخاصة به ويحفز موت الخلايا المنظم ، بما في ذلك التنخر 9,10. اعتمدت الفيروسات العديد من آليات الهروب لمواجهة تنخر الخلية المضيفة11 الناجم عن ZBP1. على سبيل المثال ، تحتوي الوحدة الفرعية 1 لاختزال الريبونوكليوتيد 1 لفيروس الهربس البسيط 1 (HSV-1) ، والمعروفة باسم ICP6 والمشفرة بواسطة UL39 ، على RHIM في نهايتها N التي تتداخل مع تنشيط RIPK3 بوساطة ZBP1 في الخلايا البشرية12،13،14،15. لا يقيد ZBP1 تكاثر الفيروس فحسب ، بل أظهرت دراسات الفئران أن تنشيط ZBP1 يسبب أمراضا التهابية ويحفز مناعة السرطان16،17،18،19،20،21. وبالتالي ، فإن البروتوكولات التي تكتشف أحداث الإشارات التي تحدث أثناء التنخر الناجم عن ZBP1 في الخلايا البشرية هي قيمة لتقييم دور ZBP1 في هذه العمليات.
تم تطوير تضخيم إشارة التيراميد (TSA) ، الذي يشار إليه أيضا باسم ترسيب المراسل المحفز (CARD) ، لتحسين حد الكشف ونسبة الإشارة إلى الضوضاء في المقايسات المناعية القائمة على الأجسام المضادة. أثناء TSA ، يمكن استخدام أي جسم مضاد أولي للكشف عن المستضد محل الاهتمام. يحفز بيروكسيديز الفجل (HRP) ، إلى جانب جسم مضاد ثانوي ، التراكم المحلي لجذور التيراميد البيوتينيلات في وجود بيروكسيد الهيدروجين. ثم تتفاعل جذور البيوتين تيراميد المنشطة هذه مع بقايا التيروزين القريبة لتشكيل روابط تساهمية. تشمل ركائز التيراميد-البيوتين المحتملة المستضد نفسه ، والأجسام المضادة الأولية والثانوية ، والبروتينات المجاورة. وبالتالي ، في حين أن TSA يحسن بشكل كبير من حساسية الفحص ، يتم فقد بعض الدقة المكانية. في الخطوة الأخيرة ، يتم الكشف عن جزيئات البيوتين باستخدام الستربتافيدين المسمى بالفلورسنت. يودع تفاعل HRP العديد من جزيئات تيراميد-بيوتين على المستضد محل الاهتمام أو بالقرب منه. هذا يزيد بشكل كبير من عدد مواقع ربط الستربتافيدين فلوروكروم ، وبالتالي تضخيم حساسية الفحص بشكل كبير (الشكل 1). بدلا من ذلك ، يمكن أن يقترن التيراميد مباشرة بالفلوروكروم ، مما يلغي الحاجة إلى الفلوروفورات المقترنة بالستربتافيدين. كانت الكيمياء الهيستولوجية المناعية للبروتين والتهجين في الموقع DNA / RNA من بين الطرق الأولى التي تم من خلالها استخدام TSA لتحسين شدة الإشارة22,23. في الآونة الأخيرة ، تم دمج TSA مع قياس التدفق الخلوي داخل الخلايا24 وقياس الطيف الكتلي25.
هنا ، نقدم بروتوكولا للكشف عن سيرين 227 RIPK3 البشري المفسفر (p-RIPK3 [S227]) و MLKL البشري المفسفر (p-MLKL [S358]) عند تنشيط ZBP1 بواسطة عدوى HSV-1 باستخدام الفحص المجهري المناعي. نحن نستخدم خط خلايا سرطان القولون والمستقيم البشري HT-29 الحساس للنخر والذي تم تحويله للتعبير بثبات عن ZBP1 البشري. أصيبت هذه الخلايا بسلالة HSV-1 تعبر عن بروتين ICP6 الطافر (HSV-1 ICP6mutRHIM) حيث تم استبدال أربعة أحماض أمينية أساسية داخل RHIM الفيروسي (VQCG) بألانين (AAAA) ، مما يجعل ICP6 غير قادر على منع التنخر بوساطة ZBP113،14،15. للتغلب على مشكلة انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء للأجسام المضادة المتاحة تجاريا حاليا والموجهة ضد p-RIPK3 و p-MLKL في التلوين المناعي26 ، نقوم بإجراء خطوة تضخيم إشارة التيراميد (TSA) (الشكل 1) ، مما يؤدي إلى الكشف القوي عن p-RIPK3 البشري (S227) ويحسن حساسية الكشف عن p-MLKL البشري (S358) بترتيب من حيث الحجم.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP</td>
			<td>Agilent Technologies Belgium</td>
			<td>K4002</td>
			<td>Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse DyLight 633</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>35513</td>
			<td>Secundary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 ICP0</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53070</td>
			<td>Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV-PR8 mouse serum</td>
			<td>In house production</td>
			<td>xx</td>
			<td>Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMLKL</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab187091</td>
			<td>Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRIPK3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab209384</td>
			<td>Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophores</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D21490</td>
			<td>To visualise the nucleus of the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>S11226</td>
			<td>To visulalise biotin molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compounds</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Oxidising substrate, necessary for HRP activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>SANBIO</td>
			<td>AR1068</td>
			<td>To fix/crosslink the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinyl-tyramide</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6241</td>
			<td>To amplify signal, HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV-6</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7597</td>
			<td>BV6 IAP Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>For cell culture: to detach the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>8.0 g/L NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.4 g/L disodium salt of EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.04%</td>
			<td>In house formulation</td>
			<td></td>
			<td>1.1 g/L Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>TICO</td>
			<td>FBS EU XXX</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSK&#39;840</td>
			<td>Aobious</td>
			<td>AOB0917</td>
			<td>RIPK3 kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10444402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td>In house production</td>
			<td>-</td>
			<td>Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td>To permeabilise the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11732</td>
			<td>For cell counting, used as live/dead marker at 0,1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4424</td>
			<td>For cell culture: to detach the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zVAD</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>BACE4026865.0005</td>
			<td>Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 well high glass bottom</td>
			<td>iBidi</td>
			<td>80807</td>
			<td>To culture the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Preping Balls-size medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71001-10</td>
			<td>To clean the objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518 F / 30 &#176;C</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>444970-9000-000</td>
			<td>To visualise the sample at high magnifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaner</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>000000-0105-200</td>
			<td>To clean the objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM880 Fast Airyscan confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To visualise the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Office</td>
			<td>xx</td>
			<td>To process the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>xx</td>
			<td>To analyse the data- statistical testing and graph generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Volocity</td>
			<td>xx</td>
			<td>To perform quantifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen black</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>xx</td>
			<td>To aquire and process images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen blue</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>xx</td>
			<td>To visualise images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viruses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 (mutRHIM) F strain</td>
			<td>produced by&#160; Dr. Jiahuai Han</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG&#62;AAAA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 (WT) F strain</td>
			<td>Produced by Dr. Jiahuai Han</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV PR8</td>
			<td>in house stock</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>IAV as a trigger for necroptosis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tyramide signal amplification for the immunofluorescent staining of zbp1-dependent phosphorylation of ripk3 and mlkl after hsv-1 infection in human cells

يعد كيناز بروتين سيرين / ثريونين المتفاعل مع مستقبلات الكيناز 3 (RIPK3) ومجاله المختلط المختلط (MLKL) من المنظمين المهمين لمرض التنخر ، وهو شكل التهابي من موت الخلايا له وظائف مهمة مضادة للفيروسات. الفسفرة الذاتية ل RIPK3 تحفز الفسفرة وتفعيل بروتين الجلاد المكون للمسام من necroptosis MLKL. يؤدي الاتجار وقلة الغلومير من MLKL المفسفرة في غشاء الخلية إلى تحلل الخلية ، وهو سمة من سمات موت الخلايا النخرية. يتم تنشيط مستشعر الحمض النووي ZBP1 عن طريق الارتباط بالحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل على شكل Z (Z-RNA) بعد الإصابة بفيروسات الحمض النووي الريبي والحمض النووي. يقيد تنشيط ZBP1 الإصابة بالفيروس عن طريق إحداث موت الخلايا المنظم ، بما في ذلك التنخر ، للخلايا المضيفة المصابة. يسمح الفحص المجهري المناعي بتصور خطوات إشارات مختلفة في اتجاه مجرى التنخر بوساطة ZBP1 على أساس كل خلية. ومع ذلك ، فإن حساسية الفحص المجهري الفلوري القياسي ، باستخدام الأجسام المضادة الحالية المتاحة تجاريا ضد RIPK3 و MLKL البشري ، تمنع التصوير القابل للتكرار لهذه العلامات. هنا ، نصف إجراء تلطيخ محسن لسيرين (S) المفسفر RIPK3 (S227) و MLKL (S358) في خلايا HT-29 البشرية المصابة بفيروس الهربس البسيط 1 (HSV-1). يسمح إدراج خطوة تضخيم إشارة التيراميد (TSA) في بروتوكول تلطيخ الفلورسنت المناعي بالكشف المحدد عن RIPK3 المفسفر S227. علاوة على ذلك ، يزيد TSA بشكل كبير من حساسية الكشف عن MLKL المفسفر S358. معا ، تتيح هذه الطريقة تصور هذين الحدثين الحرجين للإشارات أثناء تحريض التنخر الناجم عن ZBP1.

إن الكشف المناعي عن فسفرة MLKL وخاصة فسفرة RIPK3 في الخلايا البشرية يمثل تحديا تقنيا26. نقدم هنا بروتوكول تلطيخ محسن ل p-RIPK3 البشري (S227) و p-MLKL (S358) عند تنشيط ZBP1. يتضمن البروتوكول خطوة TSA لتحسين حد الكشف وحساسية إشارات الفلورسنت. للتحقق من صحة الطريقة ، تم إجراء مقارنة جنبا إلى جنب بين ال...

Watch this Scientific Journal Video about Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells at J

Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells

يتيح تضخيم إشارة التيراميد أثناء تلطيخ الفلورسنت المناعي الكشف الحساس عن RIPK3 و MLKL المفسفر أثناء التنخر الناجم عن ZBP1 بعد الإصابة بفيروس HSV-1.

تضخيم إشارة التيراميد للتلطيخ المناعي للفسفرة المعتمدة على ZBP1 ل RIPK3 و MLKL بعد عدوى HSV-1 في الخلايا البشرية

The kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) and its substrate mixed lineage kinase domain-like (MLKL) are critical ...

كان التصور القوي ل RIPK3 و MLKL المفسفرين ، وهما حدثان رئيسيان للإشارة أثناء تحريض التنخر ، تحديا تقنيا. يتيح بروتوكول تضخيم التيراميد المقدم الكشف الحساس عن هذين الجزيئين. تعمل خطوة تضخيم الإشارة على خفض عتبة الكشف ، مما يسمح بالكشف القوي والقابل للتكرار عن RIPK3 و MLKL المفسفر.ابدأ في بذر 90،000 خلية HBP1 معبرة عن HT-29 في وسط McCoy 5A كامل القوة في لوحة بئر بمساحة سطح مربعة واحدة ، مما يسمح بإجراء الفحص المجهري المتطور. استخدم حجما نهائيا يبلغ 200 ميكرولتر لكل بئر. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.بمجرد أن تصل الخلايا إلى 70 إلى 80٪ من التقاء، تصيب الخلايا في 200 ميكرولتر مسخن مسبقا، كامل القوة مكوي 5A المتوسطة التي تحتوي على فيروس الهربس البسيط واحد، ترميز حافة متحولة ICP6 في تعدد العدوى من خمسة. احتضان الخلايا مع الفيروس لمدة تسع ساعات للحث على التنخر. كعنصر تحكم إيجابي في تحريض التنخر ، قم بتحفيز الخلايا لمدة أربع ساعات باستخدام 200 ميكرولتر من الكوكتيل المسخن مسبقا الذي يسبب التنخر.كعنصر تحكم سلبي ، أضف 22 ميكرولتر من 10 ميكرومولار GSK840 مسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية لمنع نشاط كيناز RIPK3. قم بتضمين هذا المانع في حالة غير معالجة وبعد تحفيز التنخر لمنع الفسفرة الذاتية لسيرين 227. لإصلاح الخلايا ، قم بإزالة الوسط وغسل الخلايا ب 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.ثم قم بإزالة PBS وإضافة 150 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد متوازن في درجة حرارة الغرفة. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد التثبيت ، قم بإزالة 4٪ بارافورمالدهيد ، واغسل الخلايا ثلاث مرات ب 200 ميكرولتر من PBS.يمكن تخزين العينات بما يزيد عن PBS عند أربع درجات مئوية طوال الليل حتى مزيد من المعالجة. قم بإزالة PBS من اللوحة ، واحتضان الخلايا ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتخلل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على شاكر مختبر مائل. بعد الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت للنفاذية ، واغسل الخلايا ب 100 ميكرولتر من محلول الغسيل.احتضان غرفة التصوير مع مخزن الغسيل لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر مختبر مائل. لمنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة الأولية ، احتضن اللوحة ب 100 ميكرولتر من وسط الحجب في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين على شاكر مختبر مائل. بعد ذلك ، اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من محلول الغسيل مع خمس دقائق من الحضانة في درجة حرارة الغرفة على شاكر مختبر مائل.بعد إزالة المخزن المؤقت للغسيل ، أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية إلى غرفة التصوير. تأكد من تضمين حالة عدم وجود جسم مضاد أولي لتصور الخلفية المحتملة لتضخيم إشارة التيراميد ، وتعيين عتبة التقنيع. احتضان الغرفة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.قم بإزالة مزيج الأجسام المضادة الأساسي ، واغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من محلول الغسيل مع خمس دقائق من الحضانة في درجة حرارة الغرفة على شاكر مختبر مائل. بعد إزالة المخزن المؤقت للغسيل ، قم باحتضان الخلايا ب 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المسمى HRP ، مع التعرف على أنواع الجسم المضاد الأساسي المراد تضخيمه لمدة 30 دقيقة على شاكر مختبر مائل. أثناء حضانة الأجسام المضادة ، قم بإعداد مزيج تيراميد البيوتينيل.لتحفيز النشاط الأنزيمي ل HRP ، أضف ركيزة مؤكسدة إلى المخزن المؤقت TSA طازجا قبل الاستخدام. ثم قم بتخفيف التيراميد البيوتينيل في المخزن المؤقت TSA المحضر باستخدام التخفيف الأمثل. بعد الحضانة بجسم مضاد ثانوي يحمل علامة HRP ، اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام عازل الغسيل مع خمس دقائق من الحضانة على شاكر مختبر مائل.بعد إزالة المخزن المؤقت للغسيل من البئر ، أضف البيوتين تيراميد المخفف إلى البئر إلى حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر. احتضان التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق على شاكر مختبر مائل ، متبوعا بثلاث غسلات عازلة للغسيل. تحضير مزيج تلطيخ يحتوي على الجسم المضاد الثانوي ، والستربتافيدين إلى جانب ، والبقع النووية وغسل العازلة .قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل واحتضان اللوحة ب 100 ميكرولتر من مزيج التلوين في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على شاكر مختبر مائل. حافظ على غرف التصوير محمية من الضوء من هذه الخطوة فصاعدا. بعد تلطيخ ، يغسل مرتين على التوالي مع غسل عازلة ، وشطف الآبار مرتين مع PBS.قم بتخزين العينات التي تزيد عن PBS عند أربع درجات مئوية للحفاظ على التلوين حتى التصوير. غرفة التصوير جاهزة الآن للتصور على مجهر متحد البؤر. مكن تضمين تضخيم إشارة التيراميد من الكشف القوي عن RIPK3 المفسفر في سيرين 227 في السيتوسول لفيروس الهربس البسيط الأول الذي يشفر الخلايا المصابة ب ICP6 الطافرة الحافة.كانت قوة الليزر بنسبة 2٪ كافية للكشف الحساس. في التألق المناعي غير المباشر القياسي ، ظلت طاقة الليزر الأعلى غير كافية للكشف عن الفوسفو-RIPK3. في القياس الكمي لصور Z-stack ثلاثية الأبعاد ، أظهرت الخلايا المصابة زيادة بمقدار 20 ضعفا تقريبا في voxels الإيجابية ل RIPK3 المفسفرة على الخلايا المعالجة الوهمية.أشارت زيادة تلطيخ الفوسفو-RIPK3 لفيروس الهربس البسيط من النوع البري إلى خلايا مصابة بخلايا وهمية مقارنة بالخلايا المعالجة الوهمية إلى أن مجال حافة ICP6 غير قادر على منع فسفرة RIPK3 عند سيرين 227 تماما. يرتبط GSK840 بمجال كيناز RIPK3 ، ويمنع فسفرة RIPK3 عند سيرين 227 عند تنشيط ZBP1 ، مما يؤكد خصوصية طريقة الكشف عن phospho-RIPK3 بوساطة تضخيم إشارة التيراميد. أظهرت الخلايا المعالجة الوهمية انخفاضا في تلطيخ خلوي متقطع قليلا لفسفرة MLKL عند سيرين 358 ، بينما تم اكتشاف تلطيخ قوي في السيتوسول والنواة وغشاء البلازما للخلايا المصابة.يتطلب التألق المناعي غير المباشر القياسي طاقة ليزر بنسبة 40٪ للكشف المحدد عن إشارة phospho-MLKL في الخلايا المصابة. في المقابل ، أدى تضخيم إشارة التيراميد إلى زيادة حساسية الكشف عن فوسفو-MLKL ، وبالتالي خفض طاقة الليزر اللازمة إلى 6٪ 3D أظهر القياس الكمي لصورة Z-stack زيادة بنحو 90 ضعفا في عدد الفوكسل الإيجابي لفوسفو-MLKL باستخدام تضخيم إشارة التيراميد ، مقارنة بزيادة سبعة أضعاف باستخدام الطريقة القياسية ، مما يشير إلى تحسين عتبة الكشف والحساسية لفوسفو-MLKL. على غرار فيروس الهربس البسيط الأول ، تسببت عدوى فيروس الأنفلونزا A في حدوث نخر يعتمد على ZBP1.سمح تضخيم إشارة التيراميد بالكشف القوي عن phospho-RIPK3 و phospho-MLKL ، مما يشير إلى تنخر. لتفسير التلوين البؤري ، يجب تضمين العديد من عناصر التحكم في التلطيخ. هذا يستلزم عدم وجود حالة أساسية ، بقع واحدة ، بالإضافة إلى التحكم الإيجابي.من خلال تكييف هذا البروتوكول ، يمكن تضخيم أهداف متعددة باستخدام TSA المتسلسل. هذا من شأنه أن يسمح بالكشف عن RIPK3 و MLKL المفسفرة داخل نفس الخلية. يمكن أن يكون الكشف الحساس عن المؤشرات الحيوية للنخر ثاقبا لأبحاث ZBP1 المستمرة حول الالتهاب الذاتي أو عدوى الفيروس التي لا تزال فيها مسارات موت الخلايا المعتمدة على ZBP1 المنفذة بحاجة إلى تأكيد إما على أنها تنخر أو موت الخلايا المبرمج أو بيروبتوسيس.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Alloantigen-specific Anergy in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells by Alloantigen Stimulation with Co-stimulatory Signal Blockade

تحريض مستضد خيفي محددة استعطال الإنسان في خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى التي تحفيز مستضد خيفي مع حصار العلامة المشارك تنشيطية

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) offers the best chance of cure for many patients with congenital and acquired hematologic ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

اختيار المتصورة المنجلية الطفيليات لCytoadhesion لخلايا المخ البشري غشائي

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

بعد الخلوي في مصير<em&gt; E. القولونية</em&gt; بعد الإصابة التي كتبها لامدا بالعاثية

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac تعديل النظام الأساسي للخلايا ينقول T الإنسان

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

كشف الجليكوجين في خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى مع الدوري حمض شيف تلطيخ

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

تطوير بوساطة حلقة-المجففة بالتبريد متساوي التضخيم الكواشف للكشف عن<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

تقييم للسآمة للخلايا وإيمونومودولاتوري آثار المواد في شرائح البشرية دقة قطع الرئة

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

التحديد الكمي افيروسيتوسيس بالفحص المجهري Fluorescence خلية واحدة

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue

شارك تلطيخ الأوعية الدموية والألياف العصبية في الأنسجة الدهنية

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

عدوي المكورات الرئوية من خلايا بطانة الإنسان الاساسيه في التدفق المستمر

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...