Name: tyramide signal amplification for the immunofluorescent staining of zbp1-dependent phosphorylation of ripk3 and mlkl after hsv-1 infection in human cells
Uploaded: 2022-10-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells at J

Vi vil gerne takke VIB Bioimaging Core for træning, support og adgang til instrumentparken. J.N. er støttet af et ph.d.-stipendium fra Research Foundation Flanders (FWO). Forskning i J.M.-gruppen blev støttet af et Odysseus II-tilskud (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), et juniorforskningsstipendium (G031022N) fra Research Foundation Flanders (FWO), et CRIG-tilskud til ung efterforsker proof-of-concept og af Gent Universitet. Forskning i P.V.-gruppen blev støttet af EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO seniorforskningsbevillinger (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG og GIGG konsortier og VIB.

1. Fremstilling af biotinyleret tyramid
<ol><li>Forbered biotinyleret tyramid startende fra biotin-tyramid. For at fremstille en 10 mM stamopløsning opløses 3,6 mg biotin-tyramid i 1 ml DMSO. Opbevar det opløste produkt i aliquoter ved -20 °C for at bevare kvaliteten.</li>
</ol>2. Vedligeholdelse af HT-29-celler i kultur
BEMÆRK: ZBP1-ekspressive HT-29 blev genereret ved transduktion med en lentivector27 , de...

<ol>
	<li>Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+necroptosis+by+post-translational+modifications.">The regulation of necroptosis by post-translational modifications.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).</li><li>Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+necroptotic+cell+death+signaling.">The structural basis of necroptotic cell death signaling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).</li><li>Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis:+The+Trojan+horse+in+cell+autonomous+antiviral+host+defense.">Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense.</a> Virology. 479-480, 160-166 (2015).</li><li>Nailwal, H., Chan, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+in+anti-viral+inflammation.">Necroptosis in anti-viral inflammation.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).</li><li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+RIPK3+maintains+MLKL+in+an+inactive+conformation+prior+to+cell+death+by+necroptosis.">Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis.</a> Nature Communications. 12 (1), 6783 (2021).</li><li>Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location,+location,+location:+A+compartmentalized+view+of+TNF-induced+necroptotic+signaling.">Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling.</a> Science Signalling. 14 (668), (2021).</li><li>Koehler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+E3+prevents+sensing+of+Z-RNA+to+block+ZBP1-dependent+necroptosis.">Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis.</a> Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).</li><li>Balachandran, S., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Z-RNA+triggers+ZBP1-dependent+cell+death.">Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death.</a> Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).</li><li>Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZBP1:+Innate+sensor+regulating+cell+death+and+inflammation.">ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation.</a> Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).</li><li>Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+sensors+and+programmed+cell+death.">Nucleic acid sensors and programmed cell death.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).</li><li>Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+manipulation+of+host+cell+necroptosis+and+pyroptosis.">Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis.</a> Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+suppresses+necroptosis+in+human+cells.">Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+(HSV-1)+and+HSV-2+mediate+species-specific+modulations+of+programmed+necrosis+through+the+viral+ribonucleotide+reductase+large+subunit+R1.">Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1.</a> Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP1/RIP3+binding+to+HSV-1+ICP6+initiates+necroptosis+to+restrict+virus+propagation+in+mice.">RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-independent+contribution+of+ZBP1/DAI/DLM-1-triggered+necroptosis+in+host+defense+against+HSV1.">Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (8), 816 (2018).</li><li>Devos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+of+endogenous+nucleic+acids+by+ZBP1+induces+keratinocyte+necroptosis+and+skin+inflammation.">Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).</li><li>Jiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Z-nucleic-acid+sensing+triggers+ZBP1-dependent+necroptosis+and+inflammation.">Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation.</a> Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).</li><li>de Reuver, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+prevents+autoinflammation+by+suppressing+spontaneous+ZBP1+activation.">ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation.</a> Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).</li><li>Jiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+averts+fatal+type+I+interferon+induction+by+ZBP1.">ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1.</a> Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).</li><li>Hubbard, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+mutation+causes+ZBP1-dependent+immunopathology.">ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology.</a> Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+masks+the+cancer+immunotherapeutic+promise+of+ZBP1-driven+necroptosis.">ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis.</a> Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).</li><li>Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin+amplification+of+biotin+and+horseradish+peroxidase+signals+in+histochemical+stains.">Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).</li><li>Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+DNA+and+mRNA+in+situ+hybridization.">Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization.</a> Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).</li><li>Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+analysis+of+kinase+activity+by+intracellular+flow+cytometry.">Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry.</a> Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).</li><li>Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+mass+spectrometry+(TSA-MS)+ratio+identifies+nuclear+speckle+proteins.">Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).</li><li>Samson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+for+imaging+RIPK1,+RIPK3,+and+MLKL+in+mouse+and+human+cells.">A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells.</a> Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).</li><li>De Groote, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+new+gateway-compatible+inducible+lentiviral+vector+platform+allowing+easy+derivation+of+co-transduced+cells.">Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells.</a> Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).</li><li>Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+ICP6+impedes+TNF+receptor+1-induced+necrosome+assembly+during+compartmentalization+to+detergent-resistant+membrane+vesicles.">Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).</li><li>Mandal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP3+induces+apoptosis+independent+of+pronecrotic+kinase+activity.">RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity.</a> Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+Z-RNAs+induce+ZBP1-mediated+necroptosis.">Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis.</a> Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).</li><li>Garnish, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+interconversion+of+MLKL+and+disengagement+from+RIPK3+precede+cell+death+by+necroptosis.">Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis.</a> Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).</li><li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification.">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedural+requirements+and+recommendations+for+multiplex+immunofluorescence+tyramide+signal+amplification+assays+to+support+translational+oncology+studies.">Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies.</a> Cancers. 12 (2), 255 (2020).</li></ol>

Denne immunofluorescerende farvningsprotokol beskriver brugen af tyramidsignalforstærkning (TSA) for at øge følsomheden for signalhændelser af den humane nekrostotiske signalvej, der er vanskelige at detektere, herunder phosphorylering af RIPK3 og MLKL26. Inkluderingen af et TSA-trin forbedrer detektionstærsklen for p-RIPK3 (S227) og p-MLKL (S358) betydeligt og øger følsomheden af p-MLKL (S358) belastning. TSA afslørede et p-RIPK3 (S227) signal, der allerede var til stede i de mock-behandl...

Receptor-interagerende serin / threoninproteinkinase 3 (RIPK3) og blandet afstamningkinase domænelignende (MLKL) er centrale regulatorer af nekroptotisk celledød 1,2. Nekroptose er en lytisk og inflammatorisk form for reguleret celledød involveret i antiviral immunitet og autoinflammation. Nekroptose af virusinficerede celler lukker straks virusreplikation. Cellelyse efter nekroptoseinduktion frigiver også skadesrelaterede molekylære mønstre, som stimulerer antiviral immunitet 3,4. Nekroptose initieres ved aktivering af RIPK3 efter RIP homotypisk interaktionsmotiv (RHIM)-medierede interaktioner med et af tre opstrøms aktiverende molekyler: RIPK1 (ved TNF-receptor 1 [TNFR1] engagement), TIR-domæneholdig adapterinducerende interferon-β (TRIF; ved Toll-lignende receptor 3 og 4 engagement) eller den antivirale nukleinsyresensor Z-DNA-bindende protein 1 (ZBP1)1,2 . Nekroptose signalering fortsætter gennem en række fosforyleringshændelser, der begynder med autophosphorylering af RIPK3. Autophosphorylering af human RIPK3 ved serin (S)227 inde i dets kinasedomæne er en forudsætning for nekroptose ved at muliggøre interaktion med MLKL og anvendes almindeligvis som en biokemisk markør for human RIPK3-aktivering og nekrotaktisk celledød 1,5. Når den er aktiveret, phosphorylerer RIPK3 aktiveringssløjfen for MLKL ved threonin (T) 357 og S3581. Dette medfører en ændring i MLKL-konformation, hvilket resulterer i eksponering af det N-terminale fire helix-bundtdomæne. MLKL oligomeriserer derefter og trafikerer til cellemembranen, hvor den danner en pore gennem indsættelsen af de udsatte fire helixbundter i lipiddobbeltlaget, hvilket til sidst fører til celledød 2,6.
ZBP1 er en antiviral nukleinsyresensor, der genkender venstrehåndede Z-form nukleinsyrer, herunder dobbeltstrenget RNA i Z-konformationen (Z-RNA). Z-RNA-binding sker via to Zα-domæner placeret ved N-terminalen af ZBP1. Z-RNA akkumuleres under RNA- og DNA-virusinfektion menes at engagere ZBP1 7,8 direkte. Aktiveret ZBP1 rekrutterer RIPK3 gennem sine centrale RHIM'er og inducerer reguleret celledød, herunder nekroptose 9,10. Virus har vedtaget adskillige flugtmekanismer for at modvirke ZBP1-induceret værtscelle nekroptose11. For eksempel har herpes simplex virus 1 (HSV-1) ribonukleotidreduktaseunderenhed 1, kendt som ICP6 og kodet af UL39, RHIM ved sin N-terminal, der interfererer med ZBP1-medieret RIPK3-aktivering i humane celler12,13,14,15. ZBP1 begrænser ikke kun viral replikation, men museundersøgelser har vist, at ZBP1-aktivering forårsager inflammatoriske sygdomme og stimulerer kræftimmunitet 16,17,18,19,20,21. Protokoller, der detekterer signalhændelser, der forekommer under ZBP1-induceret nekroptose i humane celler, er derfor værdifulde til at vurdere ZBP1's rolle i disse processer.
Tyramidsignalforstærkning (TSA), også kaldet katalyseret reporteraflejring (CARD), er udviklet til at forbedre detektionsgrænsen og signal-støj-forholdet i antistofbaserede immunassays. Under TSA kan ethvert primært antistof bruges til at detektere antigenet af interesse. Peberrodsperoxidase (HRP), koblet til et sekundært antistof, katalyserer den lokale opbygning af biotinylerede tyramidradikaler i nærværelse af hydrogenperoxid. Disse aktiverede biotin-tyramidradikaler reagerer derefter med proksimale tyrosinrester for at danne kovalente bindinger. Potentielle tyramid-biotinsubstrater indbefatter selve antigenet, de primære og sekundære antistoffer og naboproteiner. Mens TSA forbedrer analysens følsomhed betydeligt, går noget af dets rumlige opløsning således tabt. I et sidste trin detekteres biotinmolekyler ved anvendelse af fluorescerende mærket streptavidin. HRP-reaktionen deponerer mange tyramid-biotinmolekyler på eller nær antigenet af interesse. Dette øger i høj grad antallet af streptavidin-fluorokrombindingssteder og forstærker derved i høj grad analysens følsomhed (figur 1). Alternativt kan tyramid kobles direkte til et fluorkrom, hvilket eliminerer behovet for streptavidin-koblede fluorophorer. Proteinimmunhistokemi og DNA/RNA in situ-hybridisering var blandt de første metoder, hvorved TSA blev anvendt til at forbedre signalintensiteten22,23. For nylig er TSA blevet kombineret med intracellulær flowcytometri24 og massespektrometri25.
Her præsenterer vi en protokol til påvisning af serin 227 phosphoryleret human RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) og phosphoryleret human MLKL (p-MLKL [S358]) ved aktivering af ZBP1 ved HSV-1-infektion ved anvendelse af immunfluorescensmikroskopi. Vi bruger en nekroptosefølsom HT-29 human kolorektal adenocarcinom cellelinje, der blev transduceret til stabilt at udtrykke human ZBP1. Disse celler blev inficeret med en HSV-1-stamme, der udtrykte et mutant ICP6-protein (HSV-1 ICP6mutRHIM), hvori fire kerneaminosyrer i den virale RHIM (VQCG) blev erstattet af alaniner (AAAA), hvilket gjorde ICP6 ude af stand til at blokere ZBP1-medieret nekroptose13,14,15. For at overvinde problemet med det lave signal/støj-forhold mellem de aktuelt kommercielt tilgængelige antistoffer rettet mod p-RIPK3 og p-MLKL i immunostaining26 udfører vi et tyramidsignalforstærkningstrin (TSA) (figur 1), hvilket resulterer i robust detektion af human p-RIPK3 (S227) og forbedrer detektionsfølsomheden af human p-MLKL (S358) med en størrelsesorden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP</td>
			<td>Agilent Technologies Belgium</td>
			<td>K4002</td>
			<td>Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse DyLight 633</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>35513</td>
			<td>Secundary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 ICP0</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53070</td>
			<td>Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV-PR8 mouse serum</td>
			<td>In house production</td>
			<td>xx</td>
			<td>Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMLKL</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab187091</td>
			<td>Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRIPK3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab209384</td>
			<td>Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophores</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D21490</td>
			<td>To visualise the nucleus of the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>S11226</td>
			<td>To visulalise biotin molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compounds</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Oxidising substrate, necessary for HRP activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>SANBIO</td>
			<td>AR1068</td>
			<td>To fix/crosslink the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinyl-tyramide</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6241</td>
			<td>To amplify signal, HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV-6</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7597</td>
			<td>BV6 IAP Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>For cell culture: to detach the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>8.0 g/L NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.4 g/L disodium salt of EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.04%</td>
			<td>In house formulation</td>
			<td></td>
			<td>1.1 g/L Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>TICO</td>
			<td>FBS EU XXX</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSK&#39;840</td>
			<td>Aobious</td>
			<td>AOB0917</td>
			<td>RIPK3 kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10444402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td>In house production</td>
			<td>-</td>
			<td>Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td>To permeabilise the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11732</td>
			<td>For cell counting, used as live/dead marker at 0,1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4424</td>
			<td>For cell culture: to detach the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zVAD</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>BACE4026865.0005</td>
			<td>Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 well high glass bottom</td>
			<td>iBidi</td>
			<td>80807</td>
			<td>To culture the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Preping Balls-size medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71001-10</td>
			<td>To clean the objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518 F / 30 &#176;C</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>444970-9000-000</td>
			<td>To visualise the sample at high magnifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaner</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>000000-0105-200</td>
			<td>To clean the objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM880 Fast Airyscan confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To visualise the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Office</td>
			<td>xx</td>
			<td>To process the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>xx</td>
			<td>To analyse the data- statistical testing and graph generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Volocity</td>
			<td>xx</td>
			<td>To perform quantifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen black</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>xx</td>
			<td>To aquire and process images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen blue</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>xx</td>
			<td>To visualise images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viruses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 (mutRHIM) F strain</td>
			<td>produced by&#160; Dr. Jiahuai Han</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG&#62;AAAA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 (WT) F strain</td>
			<td>Produced by Dr. Jiahuai Han</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV PR8</td>
			<td>in house stock</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>IAV as a trigger for necroptosis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tyramide signal amplification for the immunofluorescent staining of zbp1-dependent phosphorylation of ripk3 and mlkl after hsv-1 infection in human cells

Den kinase Receptor-interagerende serin / threonin protein kinase 3 (RIPK3) og dens substrat blandet afstamning kinase domæne-lignende (MLKL) er kritiske regulatorer af nekroptose, en inflammatorisk form for celledød med vigtige antivirale funktioner. Autophosphorylering af RIPK3 inducerer phosphorylering og aktivering af det poredannende bøddelprotein af nekroptose MLKL. Handel og oligomerisering af phosphoryleret MLKL ved cellemembranen resulterer i cellelyse, der er karakteristisk for nekroptotisk celledød. Nukleinsyresensoren ZBP1 aktiveres ved binding til venstrehåndet Z-form dobbeltstrenget RNA (Z-RNA) efter infektion med RNA- og DNA-vira. ZBP1-aktivering begrænser virusinfektion ved at inducere reguleret celledød, herunder nekroptose, af inficerede værtsceller. Immunofluorescensmikroskopi tillader visualisering af forskellige signaltrin nedstrøms for ZBP1-medieret nekroptose pr. Cellebasis. Følsomheden af standardfluorescensmikroskopi ved hjælp af nuværende kommercielt tilgængelige fosfospecifikke antistoffer mod human RIPK3 og MLKL udelukker imidlertid reproducerbar billeddannelse af disse markører. Her beskriver vi en optimeret farvningsprocedure for serin (S) phosphoryleret RIPK3 (S227) og MLKL (S358) i humane HT-29-celler inficeret med herpes simplex virus 1 (HSV-1). Inkluderingen af et tyramidsignalforstærkningstrin (TSA) i den immunfluorescerende farvningsprotokol muliggør specifik påvisning af S227 phosphoryleret RIPK3. Desuden øger TSA i høj grad følsomheden ved påvisning af S358 phosphoryleret MLKL. Sammen muliggør denne metode visualisering af disse to kritiske signalhændelser under induktionen af ZBP1-induceret nekroptose.

Den immunfluorescerende påvisning af MLKL-phosphorylering og især RIPK3-phosphorylering i humane celler er teknisk udfordrende26. Vi præsenterer her en forbedret farvningsprotokol for human p-RIPK3 (S227) og p-MLKL (S358) ved aktivering af ZBP1. Protokollen indeholder et TSA-trin for at forbedre detektionsgrænsen og følsomheden af de fluorescerende signaler. For at validere metoden blev der udført en sammenligning side om side af den TSA-medierede immunfluorescens med standard indirekte fluo...

Watch this Scientific Journal Video about Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells at J

Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells

Tyramidsignalforstærkning under immunfluorescerende farvning muliggør følsom påvisning af phosphoryleret RIPK3 og MLKL under ZBP1-induceret nekroptose efter HSV-1-infektion.

Tyramidsignalforstærkning til immunfluorescerende farvning af ZBP1-afhængig phosphorylering af RIPK3 og MLKL efter HSV-1-infektion i humane celler

The kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) and its substrate mixed lineage kinase domain-like (MLKL) are critical ...

Robust visualisering af phosphoryleret RIPK3 og MLKL, to vigtige signalhændelser under nekroptoseinduktion, har været teknisk udfordrende. Den præsenterede tyramidforstærkningsprotokol muliggør følsom detektion af disse to molekyler. Signalforstærkningstrin sænker detektionstærsklen, hvilket muliggør robust og reproducerbar detektion af phosphoryleret RIPK3 og MLKL.Begynd at så de 90.000 ZBP1-ekspressive HT-29-celler i fuld styrke McCoys 5A-medium i en en centimeter kvadratisk overfladeareal brøndplade, hvilket tillader avanceret mikroskopi. Brug et slutvolumen på 200 mikroliter pr. Brønd. Inkubere cellerne natten over ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid.Når cellerne når 70 til 80% sammenløb, inficere cellerne i 200 mikroliter forvarmet, fuld styrke McCoys 5A-medium indeholdende herpes simplex virus en, der koder for en rimmutant ICP6 ved en infektionsgrad på fem. Inkuber cellerne med virussen i ni timer for at fremkalde nekroptose. Som en positiv kontrol for nekroptoseinduktion stimuleres cellerne i fire timer med 200 mikroliter forvarmet nekroptosefremkaldende cocktail.Som en negativ kontrol tilsættes 22 mikroliter 10 mikromolære GSK840 forvarmet ved 37 grader Celsius for at hæmme RIPK3 kinaseaktivitet. Medtag denne hæmmer i en ubehandlet tilstand og efter nekroptosestimulering for at forhindre autophosphorylering af serin 227. For at fiksere cellerne skal du fjerne mediet og vaske cellerne med 200 mikroliter PBS.Fjern derefter PBS og tilsæt 150 mikroliter 4% paraformaldehyd ækvilibreret ved stuetemperatur. Inkuber cellerne ved stuetemperatur i 30 minutter. Efter fiksering fjernes 4% paraformaldehyd, og cellerne vaskes tre gange med 200 mikroliter PBS.Prøverne kan opbevares ud over PBS ved fire grader Celsius natten over indtil videre behandling. PBS fjernes fra pladen, og cellerne inkuberes med 100 mikroliter permeationsbuffer ved stuetemperatur i 30 minutter på en vippende laboratorieryster. Efter inkubation fjernes permeabiliseringsbufferen, og cellerne vaskes med 100 mikroliter vaskebuffer.Inkuber billedkammeret med vaskebuffer i fem minutter ved stuetemperatur på en vippende laboratorieryster. For at forhindre uspecifik binding af primære antistoffer inkuberes pladen med 100 mikroliter blokeringsmedium ved stuetemperatur i to timer på en vippende laboratorieryster. Vask derefter brøndene tre gange med 100 mikroliter vaskebuffer med fem minutters inkubation ved stuetemperatur på en vippende laboratorieryster.Efter fjernelse af vaskebufferen tilsættes 100 mikroliter af de primære antistoffer til billeddannelseskammeret. Sørg for at inkludere en ikke-primær antistoftilstand for at visualisere den potentielle baggrund for tyramidsignalforstærkningen og for at indstille maskeringstærsklen. Inkuber kammeret natten over ved fire grader Celsius.Fjern den primære antistofblanding, og vask brøndene tre gange med 100 mikroliter vaskebuffer med fem minutters inkubation ved stuetemperatur på en vippende laboratorieryster. Efter fjernelse af vaskebufferen inkuberes cellerne med 100 mikroliter HRP-mærket sekundært antistof og genkender arten af det primære antistof, der skal forstærkes i 30 minutter på en vippende laboratorieryster. Under antistofinkubation fremstilles den biotinylerede tyramidblanding.For at udløse den enzymatiske aktivitet af HRP tilsættes et oxiderende substrat til TSA-bufferen frisk før brug. Derefter fortyndes det biotinylerede tyramid i den fremstillede TSA-buffer ved hjælp af den optimerede fortynding. Efter inkubation med HRP-mærket sekundært antistof vaskes brøndene tre gange med vaskebuffer med fem minutters inkubation på en vippende laboratorieryster.Efter fjernelse af vaskebufferen fra brønden tilsættes fortyndet biotin-tyramid til brønden til et slutvolumen på 100 mikroliter. Inkuber reaktionen ved stuetemperatur i 10 minutter på en vippende laboratorieryster efterfulgt af tre vaskebuffervaske. Forbered farvningsblandingen indeholdende det sekundære antistof, koblet streptavidin og nuklear plet og vaskebuffer.Fjern vaskebufferen, og inkuber pladen med 100 mikroliter farvningsblanding ved stuetemperatur i en time på en vippende laboratorieryster. Hold billedkamrene afskærmet fra lys fra dette trin og fremefter. Efter farvning vaskes to gange fortløbende med vaskebuffer, og brøndene skylles to gange med PBS.Lagre prøverne ud over PBS ved fire grader Celsius for at bevare farvningen indtil billeddannelse. Billedkammeret er nu klar til at blive visualiseret på et konfokalmikroskop. Inkluderingen af tyramidsignalforstærkning muliggjorde robust påvisning af RIPK3 phosphoryleret ved serin 227 i cytosolen af herpes simplex-virus, der koder for en randmutant ICP6-inficerede celler.En lasereffekt på 2% var tilstrækkelig til følsom detektion. I standard indirekte immunfluorescens forblev en højere lasereffekt utilstrækkelig til påvisning af phospho-RIPK3. Ved kvantificering af de tredimensionelle Z-stack-billeder viste de inficerede celler en ca. 20 gange stigning i voxels, der var positive for phosphoryleret RIPK3 i forhold til mock-behandlede celler.Øget phospho-RIPK3-farvning af vildtype herpes simplex virus one inficerede celler sammenlignet med mock-behandlede celler indikerede, at ICP6's randdomæne ikke er i stand til at blokere RIPK3-phosphorylering ved serin 227 fuldstændigt. GSK840 binder til kinasedomænet RIPK3 og forhindrer RIPK3-phosphorylering ved serin 227 ved ZBP1-aktivering, hvilket bekræfter specificiteten af tyramidsignalforstærkningsmedieret phospho-RIPK3-detektionsmetode. De mock-behandlede celler viste lav i let punkteret cytosolisk farvning af MLKL-phosphorylering ved serin 358, mens stærk farvning blev detekteret i cytosol, kerne og plasmamembran af de inficerede celler.Standard indirekte immunfluorescens krævede 40% laserkraft til specifik påvisning af et phospho-MLKL-signal i de inficerede celler. I modsætning hertil øgede tyramidsignalforstærkning detektionsfølsomheden af phospho-MLKL og sænkede derved den nødvendige lasereffekt til 6% 3D Z-stack-billedkvantificering en ca. 90 gange stigning i antallet af voxels, der var positive for phospho-MLKL ved anvendelse af tyramidsignalforstærkning, sammenlignet med en syv gange stigning ved hjælp af standardmetoden, hvilket indikerer forbedret detektionstærskel og følsomhed for phospho-MLKL. I lighed med herpes simplex virus en udløste influenza A-virusinfektion ZBP1-afhængig nekroptose.Tyramidsignalforstærkning tillod robust påvisning af phospho-RIPK3 og phospho-MLKL, hvilket indikerer nekroptose. For at fortolke den konfokale farvning skal der inkluderes flere farvningskontroller. Dette medfører en ingen primær tilstand, enkeltpletter samt en positiv kontrol.Ved at tilpasse denne protokol kan flere mål forstærkes ved hjælp af sekventiel TSA. Dette ville gøre det muligt at påvise phosphoryleret RIPK3 og MLKL inden for samme celle. Følsom påvisning af nekroptose biomarkører kan være indsigtsfulde for igangværende ZBP1-forskning om autoinflammation eller virusinfektion, hvor de udførte ZBP1-afhængige celledødsveje stadig skal bekræftes som enten nekroptose, apoptose eller pyroptose.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Alloantigen-specific Anergy in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells by Alloantigen Stimulation with Co-stimulatory Signal Blockade

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) offers the best chance of cure for many patients with congenital and acquired hematologic ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Valg af Plasmodium falciparum Parasitter for Cytoadhesion Human Brain endotelceller

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Ændring af primære humane T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Afsløring glykogen i perifere mononukleære blodceller med Periodic Acid Schiff Farvning

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Udviklingen af ​​Frysetørret Loop-medierede Isotermiske Amplification reagenser til påvisning af<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Vurdering af den cytotoksiske og immunmodulerende virkninger af stoffer i menneskelige præcision-cut lunge skiver

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Kvantificering af Efferocytosis af encellede Fluorescens mikroskopi

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue

Co farvning blodkar og Nerve fibre i fedtvæv

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Pneumococcus infektion af primære humane endotelceller i konstant flow

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...