Name: tyramide signal amplification for the immunofluorescent staining of zbp1-dependent phosphorylation of ripk3 and mlkl after hsv-1 infection in human cells
Uploaded: 2022-10-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells at J

We willen de VIB Bioimaging Core bedanken voor training, ondersteuning en toegang tot het instrumentenpark. J.N. wordt ondersteund door een doctoraatsbeurs van het Fonds Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO). Het onderzoek in de J.M.-groep werd ondersteund door een Odysseus II Grant (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), een junior onderzoeksbeurs (G031022N) van het Fonds Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO), een CRIG young investigator proof-of-concept grant, en van de Universiteit Gent. Onderzoek in de P.V.-groep werd ondersteund door EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG en GIGG consortia en VIB.

1. Bereiding van gebiotinyleerd tyramide
<ol><li>Bereid gebiotinyleerd tyramide vanaf biotine-tyramide. Om een 10 mM stockoplossing te maken, lost u 3,6 mg biotine-tyramide op in 1 ml DMSO. Bewaar het opgeloste product in aliquots bij −20 °C om de kwaliteit te behouden.</li>
</ol>2. Behoud van HT-29 cellen in cultuur
OPMERKING: ZBP1-expresserende HT-29 werden gegenereerd door transductie met een lentivector27 ...

<ol>
	<li>Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+necroptosis+by+post-translational+modifications.">The regulation of necroptosis by post-translational modifications.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).</li><li>Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+necroptotic+cell+death+signaling.">The structural basis of necroptotic cell death signaling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).</li><li>Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis:+The+Trojan+horse+in+cell+autonomous+antiviral+host+defense.">Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense.</a> Virology. 479-480, 160-166 (2015).</li><li>Nailwal, H., Chan, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+in+anti-viral+inflammation.">Necroptosis in anti-viral inflammation.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).</li><li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+RIPK3+maintains+MLKL+in+an+inactive+conformation+prior+to+cell+death+by+necroptosis.">Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis.</a> Nature Communications. 12 (1), 6783 (2021).</li><li>Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location,+location,+location:+A+compartmentalized+view+of+TNF-induced+necroptotic+signaling.">Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling.</a> Science Signalling. 14 (668), (2021).</li><li>Koehler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+E3+prevents+sensing+of+Z-RNA+to+block+ZBP1-dependent+necroptosis.">Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis.</a> Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).</li><li>Balachandran, S., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Z-RNA+triggers+ZBP1-dependent+cell+death.">Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death.</a> Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).</li><li>Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZBP1:+Innate+sensor+regulating+cell+death+and+inflammation.">ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation.</a> Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).</li><li>Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+sensors+and+programmed+cell+death.">Nucleic acid sensors and programmed cell death.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).</li><li>Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+manipulation+of+host+cell+necroptosis+and+pyroptosis.">Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis.</a> Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+suppresses+necroptosis+in+human+cells.">Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+(HSV-1)+and+HSV-2+mediate+species-specific+modulations+of+programmed+necrosis+through+the+viral+ribonucleotide+reductase+large+subunit+R1.">Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1.</a> Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP1/RIP3+binding+to+HSV-1+ICP6+initiates+necroptosis+to+restrict+virus+propagation+in+mice.">RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-independent+contribution+of+ZBP1/DAI/DLM-1-triggered+necroptosis+in+host+defense+against+HSV1.">Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (8), 816 (2018).</li><li>Devos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+of+endogenous+nucleic+acids+by+ZBP1+induces+keratinocyte+necroptosis+and+skin+inflammation.">Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).</li><li>Jiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Z-nucleic-acid+sensing+triggers+ZBP1-dependent+necroptosis+and+inflammation.">Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation.</a> Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).</li><li>de Reuver, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+prevents+autoinflammation+by+suppressing+spontaneous+ZBP1+activation.">ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation.</a> Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).</li><li>Jiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+averts+fatal+type+I+interferon+induction+by+ZBP1.">ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1.</a> Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).</li><li>Hubbard, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+mutation+causes+ZBP1-dependent+immunopathology.">ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology.</a> Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+masks+the+cancer+immunotherapeutic+promise+of+ZBP1-driven+necroptosis.">ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis.</a> Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).</li><li>Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin+amplification+of+biotin+and+horseradish+peroxidase+signals+in+histochemical+stains.">Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).</li><li>Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+DNA+and+mRNA+in+situ+hybridization.">Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization.</a> Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).</li><li>Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+analysis+of+kinase+activity+by+intracellular+flow+cytometry.">Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry.</a> Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).</li><li>Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+mass+spectrometry+(TSA-MS)+ratio+identifies+nuclear+speckle+proteins.">Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).</li><li>Samson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+for+imaging+RIPK1,+RIPK3,+and+MLKL+in+mouse+and+human+cells.">A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells.</a> Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).</li><li>De Groote, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+new+gateway-compatible+inducible+lentiviral+vector+platform+allowing+easy+derivation+of+co-transduced+cells.">Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells.</a> Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).</li><li>Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+ICP6+impedes+TNF+receptor+1-induced+necrosome+assembly+during+compartmentalization+to+detergent-resistant+membrane+vesicles.">Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).</li><li>Mandal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP3+induces+apoptosis+independent+of+pronecrotic+kinase+activity.">RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity.</a> Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+Z-RNAs+induce+ZBP1-mediated+necroptosis.">Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis.</a> Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).</li><li>Garnish, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+interconversion+of+MLKL+and+disengagement+from+RIPK3+precede+cell+death+by+necroptosis.">Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis.</a> Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).</li><li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification.">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedural+requirements+and+recommendations+for+multiplex+immunofluorescence+tyramide+signal+amplification+assays+to+support+translational+oncology+studies.">Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies.</a> Cancers. 12 (2), 255 (2020).</li></ol>

Dit immunofluorescente kleuringsprotocol beschrijft het gebruik van tyramide signaalversterking (TSA) om de gevoeligheid te verhogen voor signaleringsgebeurtenissen van de menselijke necroptotische signaleringsroute die moeilijk te detecteren zijn, waaronder de fosforylering van RIPK3 en MLKL26. De opname van een TSA-stap verbetert de detectiedrempel van p-RIPK3 (S227) en p-MLKL (S358) aanzienlijk en verhoogt de gevoeligheid van p-MLKL (S358) overbelasting. TSA onthulde een p-RIPK3 (S227) signaal ...

Receptor-interagerende serine/threonine-eiwitkinase 3 (RIPK3) en mixed lineage kinase domain-like (MLKL) zijn centrale regulatoren van necroptotische celdood 1,2. Necroptose is een lytische en inflammatoire vorm van gereguleerde celdood die betrokken is bij antivirale immuniteit en auto-inflammatie. Necroptose van met virus geïnfecteerde cellen sluit onmiddellijk de virusreplicatie uit. Cellyse na necroptose-inductie geeft ook schadegerelateerde moleculaire patronen vrij, die antivirale immuniteit stimuleren 3,4. Necroptose wordt geïnitieerd door de activering van RIPK3 na RIP homotypische interactie motief (RHIM)-gemedieerde interacties met een van de drie upstream activerende moleculen: RIPK1 (bij TNF receptor 1 [TNFR1] engagement), TIR-domein-bevattende adapter-inducerende interferon-β (TRIF; op Toll-like receptor 3 en 4 engagement), of de antivirale nucleïnezuursensor Z-DNA binding protein 1 (ZBP1)1,2 . Necroptose signalering verloopt door een reeks fosforylering gebeurtenissen beginnend met de autofosforylering van RIPK3. De autofosforylering van humaan RIPK3 bij serine (S)227 binnen zijn kinasedomein is een voorwaarde voor necroptose door de interactie met MLKL mogelijk te maken en wordt vaak gebruikt als biochemische marker voor humane RIPK3-activering en necroptotische celdood 1,5. Eenmaal geactiveerd, fosforyleert RIPK3 de activeringslus van MLKL bij threonine (T) 357 en S3581. Dit veroorzaakt een verandering in MLKL-conformatie, wat resulteert in blootstelling van het N-terminal vier helixbundeldomein. MLKL oligomeriseert vervolgens en verkeert naar het celmembraan waar het een porie vormt door het inbrengen van de blootgestelde vier helixbundels in de lipide bilayer, wat uiteindelijk leidt tot celdood 2,6.
ZBP1 is een antivirale nucleïnezuursensor die linkshandige Z-vorm nucleïnezuren herkent, waaronder dubbelstrengs RNA in de Z-conformatie (Z-RNA). Z-RNA-binding vindt plaats via twee Zα-domeinen die zich op het N-eindpunt van ZBP1 bevinden. Van Z-RNA dat zich ophoopt tijdens RNA- en DNA-virusinfectie wordt verondersteld ZBP1 7,8 direct te betrekken. Geactiveerd zbp1 rekruteert RIPK3 via zijn centrale RHIMs en induceert gereguleerde celdood, waaronder necroptose 9,10. Virussen hebben tal van ontsnappingsmechanismen aangenomen om ZBP1-geïnduceerde gastheercelnederroptose tegen te gaan11. Bijvoorbeeld, het herpes simplex virus 1 (HSV-1) ribonucleotide reductase subunit 1, bekend als ICP6 en gecodeerd door UL39, herbergt RHIM op zijn N-terminus dat interfereert met ZBP1-gemedieerde RIPK3-activering in menselijke cellen 12,13,14,15. ZBP1 beperkt niet alleen virale replicatie, maar muisstudies hebben aangetoond dat ZBP1-activering ontstekingsziekten veroorzaakt en kankerimmuniteit stimuleert 16,17,18,19,20,21. Protocollen die signaleringsgebeurtenissen detecteren die optreden tijdens ZBP1-geïnduceerde necroptose in menselijke cellen zijn daarom waardevol om de rol van ZBP1 in deze processen te beoordelen.
Tyramide signaalversterking (TSA), ook wel katalyseerde reporter depositie (CARD) genoemd, is ontwikkeld om de detectiegrens en signaal-ruisverhouding in op antilichamen gebaseerde immunoassays te verbeteren. Tijdens TSA kan elk primair antilichaam worden gebruikt om het antigeen van belang te detecteren. Mierikswortelperoxidase (HRP), gekoppeld aan een secundair antilichaam, katalyseert de lokale opbouw van gebiotinyleerde tyramideradicalen in aanwezigheid van waterstofperoxide. Deze geactiveerde biotine-tyramideradicalen reageren vervolgens met proximale tyrosineresiduen om covalente bindingen te vormen. Potentiële tyramide-biotinesubstraten omvatten het antigeen zelf, de primaire en secundaire antilichamen en naburige eiwitten. Dus, terwijl TSA de gevoeligheid van de test aanzienlijk verbetert, gaat een deel van de ruimtelijke resolutie verloren. In een laatste stap worden biotinemoleculen gedetecteerd met behulp van fluorescerend gelabeld streptavidin. De HRP-reactie zet veel tyramide-biotinemoleculen af op of in de buurt van het antigeen van belang. Dit verhoogt het aantal streptavidin-fluorochrome bindingsplaatsen aanzienlijk, waardoor de gevoeligheid van de test aanzienlijk wordt versterkt (figuur 1). Als alternatief kan tyramide direct worden gekoppeld aan een fluorochroom, waardoor de noodzaak voor streptavidin-gekoppelde fluoroforen wordt geëlimineerd. Eiwitimmunohistochemie en DNA/RNA in situ hybridisatie behoorden tot de eerste methoden waarbij TSA werd gebruikt om de signaalintensiteiten te verbeteren22,23. Meer recent is TSA gecombineerd met intracellulaire flowcytometrie24 en massaspectrometrie25.
Hier presenteren we een protocol om serine 227 gefosforyleerde humane RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) en gefosforyleerde humane MLKL (p-MLKL [S358]) te detecteren bij de activering van ZBP1 door HSV-1-infectie met behulp van immunofluorescentiemicroscopie. We gebruiken een necroptose-gevoelige HT-29 menselijke colorectale adenocarcinoom cellijn die werd getransduceerd om stabiel menselijk ZBP1 tot expressie te brengen. Deze cellen werden geïnfecteerd met een HSV-1-stam die een mutant ICP6-eiwit (HSV-1 ICP6mutRHIM) tot expressie bracht waarin vier kernaminozuren binnen het virale RHIM (VQCG) werden vervangen door alanines (AAAA), waardoor de ICP6 niet in staat was om ZBP1-gemedieerde necroptose te blokkeren 13,14,15. Om het probleem van de lage signaal-ruisverhouding van de momenteel in de handel verkrijgbare antilichamen gericht tegen p-RIPK3 en p-MLKL in immunostaining26 te overwinnen, voeren we een tyramide signaalversterking (TSA) stap uit (Figuur 1), die resulteert in de robuuste detectie van humane p-RIPK3 (S227) en de detectiegevoeligheid van menselijke p-MLKL (S358) met een orde van grootte verbetert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP</td>
			<td>Agilent Technologies Belgium</td>
			<td>K4002</td>
			<td>Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse DyLight 633</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>35513</td>
			<td>Secundary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 ICP0</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53070</td>
			<td>Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV-PR8 mouse serum</td>
			<td>In house production</td>
			<td>xx</td>
			<td>Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMLKL</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab187091</td>
			<td>Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRIPK3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab209384</td>
			<td>Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophores</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D21490</td>
			<td>To visualise the nucleus of the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>S11226</td>
			<td>To visulalise biotin molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compounds</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Oxidising substrate, necessary for HRP activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>SANBIO</td>
			<td>AR1068</td>
			<td>To fix/crosslink the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinyl-tyramide</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6241</td>
			<td>To amplify signal, HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV-6</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7597</td>
			<td>BV6 IAP Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>For cell culture: to detach the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>8.0 g/L NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.4 g/L disodium salt of EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.04%</td>
			<td>In house formulation</td>
			<td></td>
			<td>1.1 g/L Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>TICO</td>
			<td>FBS EU XXX</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSK&#39;840</td>
			<td>Aobious</td>
			<td>AOB0917</td>
			<td>RIPK3 kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10444402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td>In house production</td>
			<td>-</td>
			<td>Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td>To permeabilise the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11732</td>
			<td>For cell counting, used as live/dead marker at 0,1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4424</td>
			<td>For cell culture: to detach the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zVAD</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>BACE4026865.0005</td>
			<td>Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 well high glass bottom</td>
			<td>iBidi</td>
			<td>80807</td>
			<td>To culture the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Preping Balls-size medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71001-10</td>
			<td>To clean the objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518 F / 30 &#176;C</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>444970-9000-000</td>
			<td>To visualise the sample at high magnifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaner</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>000000-0105-200</td>
			<td>To clean the objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM880 Fast Airyscan confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To visualise the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Office</td>
			<td>xx</td>
			<td>To process the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>xx</td>
			<td>To analyse the data- statistical testing and graph generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Volocity</td>
			<td>xx</td>
			<td>To perform quantifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen black</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>xx</td>
			<td>To aquire and process images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen blue</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>xx</td>
			<td>To visualise images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viruses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 (mutRHIM) F strain</td>
			<td>produced by&#160; Dr. Jiahuai Han</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG&#62;AAAA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 (WT) F strain</td>
			<td>Produced by Dr. Jiahuai Han</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV PR8</td>
			<td>in house stock</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>IAV as a trigger for necroptosis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tyramide signal amplification for the immunofluorescent staining of zbp1-dependent phosphorylation of ripk3 and mlkl after hsv-1 infection in human cells

De kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) en zijn substraat mixed lineage kinase domain-like (MLKL) zijn kritische regulatoren van necroptose, een inflammatoire vorm van celdood met belangrijke antivirale functies. Autofosforylering van RIPK3 induceert fosforylering en activering van het porievormende beulseiwit van necroptosis MLKL. Handel en oligomerisatie van gefosforyleerde MLKL aan het celmembraan resulteert in cellyse, kenmerkend voor necroptotische celdood. De nucleïnezuursensor ZBP1 wordt geactiveerd door binding aan linkshandig Z-vormig dubbelstrengs RNA (Z-RNA) na infectie met RNA- en DNA-virussen. ZBP1-activering beperkt virusinfectie door gereguleerde celdood, inclusief necroptose, van geïnfecteerde gastheercellen te induceren. Immunofluorescentiemicroscopie maakt de visualisatie van verschillende signaalstappen stroomafwaarts van ZBP1-gemedieerde necroptose per cel mogelijk. De gevoeligheid van standaard fluorescentiemicroscopie, met behulp van de huidige in de handel verkrijgbare fosfo-specifieke antilichamen tegen humane RIPK3 en MLKL, sluit reproduceerbare beeldvorming van deze markers echter uit. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde kleuringsprocedure voor serine (S) gefosforyleerde RIPK3 (S227) en MLKL (S358) in menselijke HT-29-cellen die zijn geïnfecteerd met herpes simplex-virus 1 (HSV-1). De opname van een tyramide signaal amplificatie (TSA) stap in het immunofluorescente kleuring protocol maakt de specifieke detectie van S227 gefosforyleerde RIPK3 mogelijk. Bovendien verhoogt TSA de gevoeligheid van de detectie van S358 gefosforyleerde MLKL aanzienlijk. Samen maakt deze methode de visualisatie van deze twee kritieke signaleringsgebeurtenissen mogelijk tijdens de inductie van ZBP1-geïnduceerde necroptose.

De immunofluorescentiedetectie van MLKL-fosforylering en vooral RIPK3-fosforylering in menselijke cellen is technisch uitdagend26. We presenteren hier een verbeterd kleuringsprotocol voor humane p-RIPK3 (S227) en p-MLKL (S358) bij de activering van ZBP1. Het protocol bevat een TSA-stap om de detectielimiet en gevoeligheid van de fluorescerende signalen te verbeteren. Om de methode te valideren, werd een zij-aan-zij vergelijking van de TSA-gemedieerde immunofluorescentie met standaard indirecte flu...

Watch this Scientific Journal Video about Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells at J

Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells

Tyramide signaalversterking tijdens immunofluorescente kleuring maakt de gevoelige detectie van gefosforyleerde RIPK3 en MLKL mogelijk tijdens ZBP1-geïnduceerde necroptose na HSV-1-infectie.

Tyramide signaalversterking voor de immunofluorescente kleuring van ZBP1-afhankelijke fosforylering van RIPK3 en MLKL na HSV-1-infectie in menselijke cellen

The kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) and its substrate mixed lineage kinase domain-like (MLKL) are critical ...

Robuuste visualisatie van gefosforyleerde RIPK3 en MLKL, twee belangrijke signaleringsgebeurtenissen tijdens necroptose-inductie, is technisch uitdagend geweest. Het gepresenteerde tyramide-amplificatieprotocol maakt gevoelige detectie van deze twee moleculen mogelijk. De signaalversterkingsstap verlaagt de detectiedrempel, waardoor robuuste en reproduceerbare detectie van gefosforyleerde RIPK3 en MLKL mogelijk is.Begin met het zaaien van de 90.000 ZBP1-expresserende HT-29-cellen in het McCoy's 5A-medium op volle sterkte in een vierkante oppervlakteplaat van één centimeter, waardoor high-end microscopie mogelijk is. Gebruik een eindvolume van 200 microliter per put. Incubeer de cellen 's nachts bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.Zodra de cellen 70 tot 80% samenvloeiing bereiken, infecteert u de cellen in 200 microliter voorverwarmde, full-strength McCoy's 5A-medium met herpes simplex-virus één, coderend voor een rim mutant ICP6 bij een veelvoud van infectie van vijf. Incubeer de cellen met het virus gedurende negen uur om necroptose te induceren. Als een positieve controle voor necroptose-inductie, stimuleer de cellen gedurende vier uur met 200 microliter voorverwarmde necroptose-inducerende cocktail.Voeg als negatieve controle 22 microliter 10 micromolaire GSK840 toe, voorverwarmd bij 37 graden Celsius om de RIPK3-kinaseactiviteit te remmen. Neem deze remmer op in een onbehandelde toestand en na necroptosestimulatie om de autofosforylering van serine 227 te voorkomen. Om de cellen te fixeren, verwijdert u het medium en wast u de cellen met 200 microliter PBS.Verwijder vervolgens de PBS en voeg 150 microliter 4% paraformaldehyde toe, gebalanceerd bij kamertemperatuur. Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Verwijder na fixatie de 4% paraformaldehyde en was de cellen drie keer met 200 microliter PBS.De monsters kunnen 's nachts meer dan PBS bij vier graden Celsius worden bewaard tot verdere verwerking. Verwijder de PBS van de plaat en incubeer de cellen met 100 microliter permeatiebuffer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten op een kantelbare laboratoriumschudder. Verwijder na incubatie de permeabilisatiebuffer en was de cellen met 100 microliter wasbuffer.Incubeer de beeldkamer met wasbuffer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op een kantelbare laboratoriumschudder. Om de niet-specifieke binding van primaire antilichamen te voorkomen, incubeert u de plaat met 100 microliter blokkerend medium bij kamertemperatuur gedurende twee uur op een kantelbare laboratoriumschudder. Was vervolgens de putjes drie keer met 100 microliter wasbuffer met vijf minuten incubatie bij kamertemperatuur op een kantelbare laboratoriumschudder.Voeg na het verwijderen van de wasbuffer 100 microliter van de primaire antilichamen toe aan de beeldvormende kamer. Zorg ervoor dat u een voorwaarde zonder primair antilichaam opneemt om de potentiële achtergrond van de tyramidesignaalversterking te visualiseren en om de maskeringsdrempel in te stellen. Incubeer de kamer 's nachts bij vier graden Celsius.Verwijder het primaire antilichaammengsel en was de putjes drie keer met 100 microliter wasbuffer met vijf minuten incubatie bij kamertemperatuur op een kantelbare laboratoriumschudder. Na het verwijderen van de wasbuffer, incubeer de cellen met 100 microliter HRP-gelabeld secundair antilichaam, waarbij de soort van het primaire antilichaam wordt herkend dat gedurende 30 minuten moet worden versterkt op een kantelbare laboratoriumschudder. Bereid tijdens de incubatie van antilichamen de gebiotinyleerde tyramidemix voor.Om de enzymatische activiteit van HRP te activeren, voegt u voor gebruik een oxiderend substraat toe aan de TSA-buffer. Verdun vervolgens het gebiotinyleerde tyramide in de bereide TSA-buffer met behulp van de geoptimaliseerde verdunning. Na incubatie met HRP-gelabeld secundair antilichaam, was de putten drie keer met wasbuffer met vijf minuten incubatie op een kantelbare laboratoriumschudder.Nadat u de wasbuffer uit de put hebt verwijderd, voegt u verdund biotine-tyramide toe aan de put tot een eindvolume van 100 microliter. Incubeer de reactie bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten op een kantelbare laboratoriumschudder, gevolgd door drie wasbufferwasbeurten. Bereid het kleuringsmengsel voor dat het secundaire antilichaam, gekoppelde streptavidin en nucleaire vlek en wasbuffer bevat.Verwijder de wasbuffer en incubeer de plaat met 100 microliter kleuringsmengsel bij kamertemperatuur gedurende een uur op een kantelbare laboratoriumschudder. Houd de beeldkamers vanaf deze stap afgeschermd van licht. Na het beitsen, tweemaal tweemaal wassen met wasbuffer en de putjes twee keer spoelen met PBS.Bewaar de monsters boven PBS bij vier graden Celsius om de kleuring te behouden totdat ze worden afgebeeld. De beeldkamer is nu klaar om te worden gevisualiseerd op een confocale microscoop. De opname van tyramide signaalversterking maakte de robuuste detectie mogelijk van RIPK3 gefosforyleerd bij serine 227 in het cytosol van herpes simplex virus één dat codeert voor een rim mutant ICP6 geïnfecteerde cellen.Een laservermogen van 2% was voldoende voor gevoelige detectie. In standaard indirecte immunofluorescentie bleef een hoger laservermogen onvoldoende voor de detectie van fosfo-RIPK3. Bij de kwantificering van de driedimensionale Z-stack-beelden vertoonden de geïnfecteerde cellen een ongeveer 20-voudige toename van voxels die positief zijn voor gefosforyleerde RIPK3 ten opzichte van met mock behandelde cellen.Verhoogde fosfo-RIPK3-kleuring van wild-type herpes simplex virus één geïnfecteerde cellen in vergelijking met nep-behandelde cellen gaf aan dat het randdomein van ICP6 niet in staat is om RIPK3 fosforylering bij serine 227 volledig te blokkeren. GSK840 bindt aan het kinasedomein van RIPK3 en voorkomt RIPK3-fosforylering bij serine 227 bij ZBP1-activering, wat de specificiteit van de tyramidesignaalversterkingsgemedieerde fosfo-RIPK3-detectiemethode bevestigt. De met mock behandelde cellen vertoonden een lage licht onderbroken cytosolische kleuring van MLKL-fosforylering bij serine 358, terwijl sterke kleuring werd gedetecteerd in het cytosol, de kern en het plasmamembraan van de geïnfecteerde cellen.De standaard indirecte immunofluorescentie vereiste 40% laservermogen voor de specifieke detectie van een fosfo-MLKL-signaal in de geïnfecteerde cellen. Tyramide signaalversterking daarentegen verhoogde de detectiegevoeligheid van fosfo-MLKL, waardoor het benodigde laservermogen werd verlaagd tot 6%3D Z-stack beeldkwantificering toonde een ongeveer 90-voudige toename van het aantal voxels positief voor fosfo-MLKL met behulp van tyramide signaalversterking, vergeleken met een zevenvoudige toename met behulp van de standaardmethode, wat wijst op een verbeterde detectiedrempel en gevoeligheid voor fosfo-MLKL. Net als bij herpes simplex virus één, influenza A virus infectie veroorzaakt ZBP1-afhankelijke necroptose.Tyramide signaalversterking maakte de robuuste detectie van fosfo-RIPK3 en fosfo-MLKL mogelijk, wat wijst op necroptose. Om de confocale kleuring te interpreteren, moeten verschillende kleuringscontroles worden opgenomen. Dit brengt een geen primaire voorwaarde, enkele vlekken en een positieve controle met zich mee.Door dit protocol aan te passen, kunnen meerdere doelen worden versterkt met behulp van sequentiële TSA. Dit zou de detectie van gefosforyleerde RIPK3 en MLKL binnen dezelfde cel mogelijk maken. Gevoelige detectie van necroptose biomarkers kan inzichtelijk zijn voor lopend ZBP1-onderzoek naar auto-inflammatie of virusinfectie waarbij de uitgevoerde ZBP1-afhankelijke celdoodroutes nog steeds moeten worden bevestigd als necroptose, apoptose of pyroptose.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Alloantigen-specific Anergy in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells by Alloantigen Stimulation with Co-stimulatory Signal Blockade

Inductie van allogeen-specifieke anergie in humane perifere bloed mononucleaire cellen door allogeen stimulatie met Co-stimulerende signaal blokkade

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) offers the best chance of cure for many patients with congenital and acquired hematologic ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selectie van Plasmodium falciparum Parasieten voor Cytoadhesion Human Brain endotheelcellen

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Na Cell-lot in<em&gt; E. coli</em&gt; Na Infectie door Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon Systeem Wijziging van primaire menselijke T-cellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Detecteren Glycogeen in perifeer bloed mononucleaire cellen met Periodic Acid Schiff kleuring

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

De ontwikkeling van gevriesdroogde Loop-gemedieerde Isotherme Amplification reagentia voor de detectie van<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Beoordeling van de cytotoxische en immunomodulerende effecten van stoffen in menselijke precisie-cut Lung plakjes

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue

Co kleuring bloedvaten en zenuwvezels in adipeus weefsel

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Pneumococcus-infectie van primaire humane endotheliale cellen in constante stroming

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...