Name: tyramide signal amplification for the immunofluorescent staining of zbp1-dependent phosphorylation of ripk3 and mlkl after hsv-1 infection in human cells
Uploaded: 2022-10-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells at J

Nous tenons à remercier le VIB Bioimaging Core pour la formation, le soutien et l’accès au parc d’instruments. J.N. est soutenu par une bourse de doctorat de la Fondation pour la recherche de Flandre (FWO). La recherche dans le groupe J.M. a été soutenue par une bourse Odysseus II (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), une subvention de recherche junior (G031022N) de la Fondation de recherche Flanders (FWO), une bourse de preuve de concept pour jeunes chercheurs du CRIG et par l’Université de Gand. La recherche dans le groupe P.V. a été soutenue par EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), les consortiums CRIG et GIGG et VIB.

1. Préparation du tyramide biotinylé
<ol><li>Préparer du tyramide biotinylé à partir de biotine-tyramide. Pour faire une solution mère de 10 mM, dissoudre 3,6 mg de biotine-tyramide dans 1 mL de DMSO. Conserver le produit dissous dans des aliquotes à −20 °C pour en préserver la qualité.</li>
</ol>2. Maintenir les cellules HT-29 en culture
NOTE: Les HT-29 exprimant ZBP1 ont été générés par transduction avec un lentivecte...

<ol>
	<li>Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+necroptosis+by+post-translational+modifications.">The regulation of necroptosis by post-translational modifications.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).</li><li>Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+necroptotic+cell+death+signaling.">The structural basis of necroptotic cell death signaling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).</li><li>Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis:+The+Trojan+horse+in+cell+autonomous+antiviral+host+defense.">Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense.</a> Virology. 479-480, 160-166 (2015).</li><li>Nailwal, H., Chan, F. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location,+location,+location:+A+compartmentalized+view+of+TNF-induced+necroptotic+signaling.">Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling.</a> Science Signalling. 14 (668), (2021).</li><li>Koehler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+E3+prevents+sensing+of+Z-RNA+to+block+ZBP1-dependent+necroptosis.">Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis.</a> Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).</li><li>Balachandran, S., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Z-RNA+triggers+ZBP1-dependent+cell+death.">Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death.</a> Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).</li><li>Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZBP1:+Innate+sensor+regulating+cell+death+and+inflammation.">ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation.</a> Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).</li><li>Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+sensors+and+programmed+cell+death.">Nucleic acid sensors and programmed cell death.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).</li><li>Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+manipulation+of+host+cell+necroptosis+and+pyroptosis.">Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis.</a> Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+suppresses+necroptosis+in+human+cells.">Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+(HSV-1)+and+HSV-2+mediate+species-specific+modulations+of+programmed+necrosis+through+the+viral+ribonucleotide+reductase+large+subunit+R1.">Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1.</a> Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP1/RIP3+binding+to+HSV-1+ICP6+initiates+necroptosis+to+restrict+virus+propagation+in+mice.">RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-independent+contribution+of+ZBP1/DAI/DLM-1-triggered+necroptosis+in+host+defense+against+HSV1.">Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (8), 816 (2018).</li><li>Devos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+of+endogenous+nucleic+acids+by+ZBP1+induces+keratinocyte+necroptosis+and+skin+inflammation.">Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).</li><li>Jiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Z-nucleic-acid+sensing+triggers+ZBP1-dependent+necroptosis+and+inflammation.">Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation.</a> Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).</li><li>de Reuver, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+prevents+autoinflammation+by+suppressing+spontaneous+ZBP1+activation.">ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation.</a> Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).</li><li>Jiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+averts+fatal+type+I+interferon+induction+by+ZBP1.">ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1.</a> Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).</li><li>Hubbard, N. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin+amplification+of+biotin+and+horseradish+peroxidase+signals+in+histochemical+stains.">Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).</li><li>Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+DNA+and+mRNA+in+situ+hybridization.">Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization.</a> Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).</li><li>Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+analysis+of+kinase+activity+by+intracellular+flow+cytometry.">Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry.</a> Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).</li><li>Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+mass+spectrometry+(TSA-MS)+ratio+identifies+nuclear+speckle+proteins.">Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).</li><li>Samson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+for+imaging+RIPK1,+RIPK3,+and+MLKL+in+mouse+and+human+cells.">A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells.</a> Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).</li><li>De Groote, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+new+gateway-compatible+inducible+lentiviral+vector+platform+allowing+easy+derivation+of+co-transduced+cells.">Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells.</a> Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).</li><li>Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+ICP6+impedes+TNF+receptor+1-induced+necrosome+assembly+during+compartmentalization+to+detergent-resistant+membrane+vesicles.">Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).</li><li>Mandal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP3+induces+apoptosis+independent+of+pronecrotic+kinase+activity.">RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity.</a> Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+Z-RNAs+induce+ZBP1-mediated+necroptosis.">Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis.</a> Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).</li><li>Garnish, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+interconversion+of+MLKL+and+disengagement+from+RIPK3+precede+cell+death+by+necroptosis.">Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis.</a> Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).</li><li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification.">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedural+requirements+and+recommendations+for+multiplex+immunofluorescence+tyramide+signal+amplification+assays+to+support+translational+oncology+studies.">Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies.</a> Cancers. 12 (2), 255 (2020).</li></ol>

Ce protocole de coloration immunofluorescente décrit l’utilisation de l’amplification du signal tyramide (TSA) pour augmenter la sensibilité aux événements de signalisation de la voie de signalisation nécroptotique humaine qui sont difficiles à détecter, y compris la phosphorylation de RIPK3 et MLKL26. L’inclusion d’une étape TSA améliore considérablement le seuil de détection de p-RIPK3 (S227) et p-MLKL (S358) et augmente la sensibilité de la contrainte p-MLKL (S358). La TSA a...

La protéine kinase 3 sérine/thréonine interagissant avec les récepteurs (RIPK3) et le domaine mixte de la kinase de lignée (MLKL) sont des régulateurs centraux de la mort cellulaire nécroptotique 1,2. La nécroptose est une forme lytique et inflammatoire de mort cellulaire régulée impliquée dans l’immunité antivirale et l’autoinflammation. La nécroptose des cellules infectées par le virus arrête immédiatement la réplication du virus. La lyse cellulaire après induction de la nécroptose libère également des schémas moléculaires associés aux dommages, qui stimulent l’immunité antivirale 3,4. La nécroptose est initiée par l’activation de RIPK3 à la suite d’interactions médiées par le motif d’interaction homotypique (RHIM) RIP avec l’une des trois molécules activatrices en amont : RIPK1 (lors de l’engagement du récepteur TNF 1 [TNFR1]), l’interféron-β induisant un adaptateur contenant le domaine TIR (TRIF; lors de l’engagement des récepteurs de type Toll 3 et 4), ou le capteur d’acide nucléique antiviral Protéine de liaison à l’ADN-Z 1 (ZBP1)1,2 . La signalisation de la nécroptose se déroule par une série d’événements de phosphorylation commençant par l’autophosphorylation de RIPK3. L’autophosphorylation de RIPK3 humain à la sérine (S)227 à l’intérieur de son domaine kinase est une condition préalable à la nécroptose en permettant l’interaction avec MLKL et est couramment utilisée comme marqueur biochimique de l’activation humaine de RIPK3 et de la mort cellulaire nécroptotique 1,5. Une fois activé, RIPK3 phosphoryle la boucle d’activation de MLKL à la thréonine (T)357 et S3581. Cela provoque une modification de la conformation MLKL, entraînant une exposition du domaine du faisceau à quatre hélices N-terminal. MLKL s’oligomérise ensuite et se dirige vers la membrane cellulaire où il forme un pore par l’insertion des quatre faisceaux hélicoïdaux exposés dans la bicouche lipidique, conduisant finalement à la mort cellulaire 2,6.
ZBP1 est un capteur d’acide nucléique antiviral qui reconnaît les acides nucléiques gauchers de forme Z, y compris l’ARN double brin dans la conformation Z (ARN-Z). La liaison de l’ARN-Z se produit via deux domaines Zα positionnés à l’extrémité N de ZBP1. On pense que l’ARN-Z s’accumulant lors de l’infection par l’ARN et le virus de l’ADN engage directement ZBP1 7,8. ZBP1 activé recrute RIPK3 par le biais de ses RHIM centraux et induit une mort cellulaire régulée, y compris la nécroptose 9,10. Les virus ont adopté de nombreux mécanismes d’échappement pour contrer la nécroptose de la cellule hôte induite par ZBP11. Par exemple, la sous-unité 1 de la ribonucléotide réductase du virus de l’herpès simplex 1 (HSV-1), connue sous le nom de ICP6 et codée par UL39, héberge RHIM à son extrémité N qui interfère avec l’activation de RIPK3 médiée par ZBP1 dans les cellules humaines12,13,14,15. ZBP1 non seulement restreint la réplication virale, mais des études sur la souris ont montré que l’activation de ZBP1 provoque des maladies inflammatoires et stimule l’immunité contre le cancer 16,17,18,19,20,21. Les protocoles qui détectent les événements de signalisation se produisant pendant la nécroptose induite par ZBP1 dans les cellules humaines sont donc utiles pour évaluer le rôle de ZBP1 dans ces processus.
L’amplification du signal tyramide (TSA), également appelée dépôt de rapporteur catalysé (CARD), a été développée pour améliorer la limite de détection et le rapport signal sur bruit dans les immunoessais à base d’anticorps. Au cours de la TSA, n’importe quel anticorps primaire peut être utilisé pour détecter l’antigène d’intérêt. La peroxydase de raifort (HRP), couplée à un anticorps secondaire, catalyse l’accumulation locale de radicaux tyramide biotinylés en présence de peroxyde d’hydrogène. Ces radicaux biotine-tyramide activés réagissent ensuite avec les résidus de tyrosine proximale pour former des liaisons covalentes. Les substrats potentiels tyramide-biotine comprennent l’antigène lui-même, les anticorps primaires et secondaires et les protéines voisines. Ainsi, alors que la TSA améliore considérablement la sensibilité du test, une partie de sa résolution spatiale est perdue. Dans une dernière étape, les molécules de biotine sont détectées à l’aide de streptavidine marquée par fluorescence. La réaction HRP dépose de nombreuses molécules de tyramide-biotine sur ou à proximité de l’antigène d’intérêt. Cela augmente considérablement le nombre de sites de liaison streptavidine-fluorochrome, amplifiant ainsi considérablement la sensibilité du test (Figure 1). Alternativement, le tyramide peut être directement couplé à un fluorochrome, éliminant ainsi le besoin de fluorophores couplés à la streptavidine. L’immunohistochimie des protéines et l’hybridation in situ ADN/ARN ont été parmi les premières méthodes par lesquelles la TSA a été utilisée pour améliorer l’intensité du signal22,23. Plus récemment, la TSA a été combinée avec la cytométrie de flux intracellulaire24 et la spectrométriede masse 25.
Ici, nous présentons un protocole pour détecter la sérine 227 humaine phosphorylée RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) et la MLKL humaine phosphorylée (p-MLKL [S358]) lors de l’activation de ZBP1 par infection à HSV-1 par microscopie d’immunofluorescence. Nous utilisons une lignée cellulaire d’adénocarcinome colorectal humain HT-29 sensible à la nécroptose qui a été transduite pour exprimer de manière stable ZBP1 humain. Ces cellules ont été infectées par une souche HSV-1 exprimant une protéine mutante ICP6 (HSV-1ICP6 mutRHIM) dans laquelle quatre acides aminés centraux du RHIM viral (VQCG) ont été remplacés par des alanines (AAAA), rendant ainsi l’ICP6 incapable de bloquer la nécroptose médiée par ZBP113,14,15. Pour surmonter le problème du faible rapport signal/bruit des anticorps actuellement disponibles dans le commerce dirigés contre p-RIPK3 et p-MLKL dans l’immunomarquage26, nous effectuons une étape d’amplification du signal tyramide (TSA) (Figure 1), qui se traduit par une détection robuste de p-RIPK3 humain (S227) et améliore la sensibilité de détection du p-MLKL humain (S358) d’un ordre de grandeur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP</td>
			<td>Agilent Technologies Belgium</td>
			<td>K4002</td>
			<td>Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse DyLight 633</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>35513</td>
			<td>Secundary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 ICP0</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53070</td>
			<td>Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV-PR8 mouse serum</td>
			<td>In house production</td>
			<td>xx</td>
			<td>Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMLKL</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab187091</td>
			<td>Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRIPK3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab209384</td>
			<td>Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophores</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D21490</td>
			<td>To visualise the nucleus of the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>S11226</td>
			<td>To visulalise biotin molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compounds</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Oxidising substrate, necessary for HRP activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>SANBIO</td>
			<td>AR1068</td>
			<td>To fix/crosslink the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinyl-tyramide</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6241</td>
			<td>To amplify signal, HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV-6</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7597</td>
			<td>BV6 IAP Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>For cell culture: to detach the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>8.0 g/L NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.4 g/L disodium salt of EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.04%</td>
			<td>In house formulation</td>
			<td></td>
			<td>1.1 g/L Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>TICO</td>
			<td>FBS EU XXX</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSK&#39;840</td>
			<td>Aobious</td>
			<td>AOB0917</td>
			<td>RIPK3 kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10444402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td>In house production</td>
			<td>-</td>
			<td>Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td>To permeabilise the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11732</td>
			<td>For cell counting, used as live/dead marker at 0,1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4424</td>
			<td>For cell culture: to detach the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zVAD</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>BACE4026865.0005</td>
			<td>Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 well high glass bottom</td>
			<td>iBidi</td>
			<td>80807</td>
			<td>To culture the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Preping Balls-size medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71001-10</td>
			<td>To clean the objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518 F / 30 &#176;C</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>444970-9000-000</td>
			<td>To visualise the sample at high magnifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaner</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>000000-0105-200</td>
			<td>To clean the objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM880 Fast Airyscan confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To visualise the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Office</td>
			<td>xx</td>
			<td>To process the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>xx</td>
			<td>To analyse the data- statistical testing and graph generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Volocity</td>
			<td>xx</td>
			<td>To perform quantifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen black</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>xx</td>
			<td>To aquire and process images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen blue</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>xx</td>
			<td>To visualise images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viruses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 (mutRHIM) F strain</td>
			<td>produced by&#160; Dr. Jiahuai Han</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG&#62;AAAA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 (WT) F strain</td>
			<td>Produced by Dr. Jiahuai Han</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV PR8</td>
			<td>in house stock</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>IAV as a trigger for necroptosis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tyramide signal amplification for the immunofluorescent staining of zbp1-dependent phosphorylation of ripk3 and mlkl after hsv-1 infection in human cells

La kinase RIPK3 (RIPK3) qui interagit avec le récepteur de la kinase et son substrat mixte de type domaine kinase (MLKL) sont des régulateurs essentiels de la nécroptose, une forme inflammatoire de mort cellulaire ayant d’importantes fonctions antivirales. L’autophosphorylation de RIPK3 induit la phosphorylation et l’activation de la protéine bourreau formant les pores de la nécroptose MLKL. Le trafic et l’oligomérisation du MLKL phosphorylé au niveau de la membrane cellulaire entraînent une lyse cellulaire, caractéristique de la mort cellulaire nécroptotique. Le capteur d’acide nucléique ZBP1 est activé en se liant à l’ARN double brin (ARN-Z) gaucher de forme Z après infection par des virus à ARN et à ADN. L’activation de ZBP1 limite l’infection virale en induisant la mort cellulaire régulée, y compris la nécroptose, des cellules hôtes infectées. La microscopie par immunofluorescence permet de visualiser différentes étapes de signalisation en aval de la nécroptose médiée par ZBP1 sur une base cellulaire. Cependant, la sensibilité de la microscopie à fluorescence standard, utilisant actuellement des anticorps phospho-spécifiques disponibles dans le commerce contre RIPK3 et MLKL humains, empêche l’imagerie reproductible de ces marqueurs. Ici, nous décrivons une procédure de coloration optimisée pour la sérine (S) phosphorylée RIPK3 (S227) et MLKL (S358) dans les cellules humaines HT-29 infectées par le virus de l’herpès simplex 1 (HSV-1). L’inclusion d’une étape d’amplification du signal tyramide (TSA) dans le protocole de coloration immunofluorescente permet la détection spécifique de S227 phosphorylé RIPK3. De plus, la TSA augmente considérablement la sensibilité de la détection de MLKL phosphorylé S358. Ensemble, cette méthode permet de visualiser ces deux événements de signalisation critiques lors de l’induction de la nécroptose induite par ZBP1.

La détection par immunofluorescence de la phosphorylation MLKL et en particulier de la phosphorylation RIPK3 dans les cellules humaines est techniquement difficile26. Nous présentons ici un protocole de coloration amélioré pour p-RIPK3 (S227) et p-MLKL (S358) humains lors de l’activation de ZBP1. Le protocole comprend une étape TSA pour améliorer la limite de détection et la sensibilité des signaux fluorescents. Pour valider la méthode, une comparaison côte à côte de l’immunofluore...

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Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells

L’amplification du signal tyramide lors de la coloration par immunofluorescence permet la détection sensible de RIPK3 et MLKL phosphorylés lors de la nécroptose induite par ZBP1 après une infection à HSV-1.

Amplification du signal tyramide pour la coloration immunofluorescente de la phosphorylation dépendante de ZBP1 de RIPK3 et MLKL après infection à HSV-1 dans des cellules humaines

The kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) and its substrate mixed lineage kinase domain-like (MLKL) are critical ...

La visualisation robuste de RIPK3 et MLKL phosphorylés, deux événements de signalisation clés lors de l’induction de la nécroptose, a été techniquement difficile. Le protocole d’amplification tyramide présenté permet une détection sensible de ces deux molécules. L’étape d’amplification du signal abaisse le seuil de détection, permettant une détection robuste et reproductible des RIPK3 et MLKL phosphorylés.Commencez à ensemencer les 90 000 cellules HT-29 exprimant ZBP1 dans le milieu 5A de McCoy pleine puissance dans une plaque de puits d’une surface carrée d’un centimètre, permettant une microscopie haut de gamme. Utilisez un volume final de 200 microlitres par puits. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.Une fois que les cellules atteignent 70 à 80% de confluence, infectez les cellules dans 200 microlitres préchauffés, milieu 5A de McCoy contenant le virus de l’herpès simplex un, codant un mutant de bord ICP6 à une multiplicité d’infection de cinq. Incuber les cellules avec le virus pendant neuf heures pour induire la nécroptose. Comme contrôle positif de l’induction de la nécroptose, stimulez les cellules pendant quatre heures avec 200 microlitres de cocktail préchauffé induisant la nécroptose.Comme témoin négatif, ajoutez 22 microlitres de 10 micromolaires GSK840 préchauffés à 37 degrés Celsius pour inhiber l’activité de la kinase RIPK3. Inclure cet inhibiteur dans une condition non traitée et après la stimulation par nécroptose pour empêcher l’autophosphorylation de la sérine 227. Pour fixer les cellules, retirez le milieu et lavez les cellules avec 200 microlitres de PBS.Retirez ensuite le PBS et ajoutez 150 microlitres de paraformaldéhyde à 4% équilibré à température ambiante. Incuber les cellules à température ambiante pendant 30 minutes. Après la fixation, retirez le paraformaldéhyde à 4% et lavez les cellules trois fois avec 200 microlitres de PBS.Les échantillons peuvent être conservés en excès de PBS à quatre degrés Celsius pendant la nuit jusqu’à un traitement ultérieur. Retirer le PBS de la plaque et incuber les cellules avec 100 microlitres de tampon de perméation à température ambiante pendant 30 minutes sur un agitateur de laboratoire basculant. Après l’incubation, retirez le tampon de perméabilisation et lavez les cellules avec 100 microlitres de tampon de lavage.Incuber la chambre d’imagerie avec un tampon de lavage pendant cinq minutes à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant. Pour éviter la liaison non spécifique des anticorps primaires, incuber la plaque avec 100 microlitres de milieu bloquant à température ambiante pendant deux heures sur un agitateur de laboratoire basculant. Ensuite, lavez les puits trois fois avec 100 microlitres de tampon de lavage avec cinq minutes d’incubation à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant.Après avoir retiré le tampon de lavage, ajoutez 100 microlitres d’anticorps primaires dans la chambre d’imagerie. Assurez-vous d’inclure une condition d’absence d’anticorps primaire pour visualiser le fond potentiel de l’amplification du signal tyramide et pour définir le seuil de masquage. Incuber la chambre pendant la nuit à quatre degrés Celsius.Retirez le mélange d’anticorps primaires et lavez les puits trois fois avec 100 microlitres de tampon de lavage avec cinq minutes d’incubation à température ambiante sur un agitateur de laboratoire basculant. Après avoir retiré le tampon de lavage, incuber les cellules avec 100 microlitres d’anticorps secondaire marqué HRP, en reconnaissant l’espèce de l’anticorps primaire à amplifier pendant 30 minutes sur un agitateur de laboratoire inclinable. Pendant l’incubation des anticorps, préparer le mélange de tyramide biotinylé.Pour déclencher l’activité enzymatique du HRP, ajouter un substrat oxydant au tampon TSA fraîchement avant utilisation. Diluer ensuite le tyramide biotinylé dans le tampon TSA préparé en utilisant la dilution optimisée. Après l’incubation avec un anticorps secondaire marqué HRP, laver les puits trois fois avec un tampon de lavage avec cinq minutes d’incubation sur un agitateur de laboratoire basculant.Après avoir retiré le tampon de lavage du puits, ajouter de la biotine-tyramide diluée au puits jusqu’à un volume final de 100 microlitres. Incuber la réaction à température ambiante pendant 10 minutes sur un agitateur de laboratoire basculant, suivi de trois lavages tampons de lavage. Préparer le mélange de coloration contenant l’anticorps secondaire, la streptavidine couplée et la coloration nucléaire et le tampon de lavage.Retirez le tampon de lavage et incuber la plaque avec 100 microlitres de mélange de coloration à température ambiante pendant une heure sur un agitateur de laboratoire basculant. Gardez les chambres d’imagerie à l’abri de la lumière à partir de cette étape. Après la coloration, laver deux fois consécutivement avec un tampon de lavage et rincer les puits deux fois avec du PBS.Conservez les échantillons en excès de PBS à quatre degrés Celsius pour préserver la coloration jusqu’à l’imagerie. La chambre d’imagerie est maintenant prête à être visualisée au microscope confocal. L’inclusion de l’amplification du signal tyramide a permis la détection robuste de RIPK3 phosphorylé à la sérine 227 dans le cytosol du virus de l’herpès simplex un codant pour une mutant de bord ICP6 cellules infectées.Une puissance laser de 2% était suffisante pour la détection sensible. Dans l’immunofluorescence indirecte standard, une puissance laser plus élevée est restée insuffisante pour la détection du phospho-RIPK3. Dans la quantification des images tridimensionnelles de la pile Z, les cellules infectées ont montré une augmentation d’environ 20 fois des voxels positifs pour RIPK3 phosphorylé par rapport aux cellules simulées traitées.L’augmentation de la coloration phospho-RIPK3 des cellules infectées par le virus de l’herpès simplex de type sauvage par rapport aux cellules simulées a indiqué que le domaine de bord de l’ICP6 est incapable de bloquer complètement la phosphorylation de RIPK3 à la sérine 227. GSK840 se lie au domaine kinase de RIPK3 et empêche la phosphorylation de RIPK3 à la sérine 227 lors de l’activation de ZBP1, confirmant la spécificité de la méthode de détection phospho-RIPK3 médiée par l’amplification du signal tyramide. Les cellules simulées traitées ont montré une coloration cytosolique faible en légère ponctuation de la phosphorylation MLKL à la sérine 358, tandis qu’une forte coloration a été détectée dans le cytosol, le noyau et la membrane plasmique des cellules infectées.L’immunofluorescence indirecte standard nécessitait une puissance laser de 40% pour la détection spécifique d’un signal phospho-MLKL dans les cellules infectées. En revanche, l’amplification du signal tyramide a augmenté la sensibilité de détection du phospho-MLKL, abaissant ainsi la puissance laser nécessaire à 6%La quantification de l’image Z-stack 3D a montré une augmentation d’environ 90 fois du nombre de voxels positifs pour phospho-MLKL en utilisant l’amplification du signal tyramide, par rapport à une multiplication par sept avec la méthode standard, indiquant une amélioration du seuil de détection et de la sensibilité pour phospho-MLKL. Semblable au virus de l’herpès simplex un, l’infection par le virus de la grippe A a déclenché une nécroptose dépendante de ZBP1.L’amplification du signal tyramide a permis la détection robuste de phospho-RIPK3 et phospho-MLKL, indiquant une nécroptose. Pour interpréter la coloration confocale, plusieurs contrôles de coloration doivent être inclus. Cela implique une condition non primaire, des taches uniques, ainsi qu’un contrôle positif.En adaptant ce protocole, plusieurs cibles peuvent être amplifiées à l’aide de TSA séquentielle. Cela permettrait la détection de RIPK3 et MLKL phosphorylés dans la même cellule. La détection sensible des biomarqueurs de la nécroptose peut être utile pour la recherche ZBP1 en cours sur l’auto-inflammation ou l’infection virale dans laquelle les voies de mort cellulaire dépendantes de ZBP1 exécutées doivent encore être confirmées comme nécroptose, apoptose ou pyroptose.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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