Name: tyramide signal amplification for the immunofluorescent staining of zbp1-dependent phosphorylation of ripk3 and mlkl after hsv-1 infection in human cells
Uploaded: 2022-10-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells at J

Wir danken dem VIB Bioimaging Core für die Schulung, den Support und den Zugang zum Instrumentenpark. J.N. wird durch ein Doktorandenstipendium der Forschungsstiftung Flandern (FWO) unterstützt. Die Forschung in der J.M.-Gruppe wurde durch ein Odysseus II Grant (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), ein Junior Research Grant (G031022N) der Research Foundation Flanders (FWO), ein CRIG Young Investigator Proof-of-Concept Grant und die Universität Gent unterstützt. Die Forschung in der P.V.-Gruppe wurde von EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO Senior Research Grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG und GIGG Konsortien und VIB unterstützt.

1. Herstellung von biotinyliertem Tyramid
<ol><li>Biotinyliertyramid ausgehend von Biotin-Tyramid herstellen. Um eine 10 mM Stammlösung herzustellen, lösen Sie 3,6 mg Biotin-Tyramid in 1 ml DMSO. Lagern Sie das gelöste Produkt aliquot bei −20 °C, um die Qualität zu erhalten.</li>
</ol>2. Aufrechterhaltung von HT-29-Zellen in Kultur
HINWEIS: ZBP1-exprimierende HT-29 wurden durch Transduktion mit einem Lentivektor...

<ol>
	<li>Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+necroptosis+by+post-translational+modifications.">The regulation of necroptosis by post-translational modifications.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).</li><li>Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+necroptotic+cell+death+signaling.">The structural basis of necroptotic cell death signaling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).</li><li>Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis:+The+Trojan+horse+in+cell+autonomous+antiviral+host+defense.">Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense.</a> Virology. 479-480, 160-166 (2015).</li><li>Nailwal, H., Chan, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+in+anti-viral+inflammation.">Necroptosis in anti-viral inflammation.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).</li><li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+RIPK3+maintains+MLKL+in+an+inactive+conformation+prior+to+cell+death+by+necroptosis.">Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis.</a> Nature Communications. 12 (1), 6783 (2021).</li><li>Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location,+location,+location:+A+compartmentalized+view+of+TNF-induced+necroptotic+signaling.">Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling.</a> Science Signalling. 14 (668), (2021).</li><li>Koehler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+E3+prevents+sensing+of+Z-RNA+to+block+ZBP1-dependent+necroptosis.">Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis.</a> Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).</li><li>Balachandran, S., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Z-RNA+triggers+ZBP1-dependent+cell+death.">Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death.</a> Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).</li><li>Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZBP1:+Innate+sensor+regulating+cell+death+and+inflammation.">ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation.</a> Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).</li><li>Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+sensors+and+programmed+cell+death.">Nucleic acid sensors and programmed cell death.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).</li><li>Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+manipulation+of+host+cell+necroptosis+and+pyroptosis.">Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis.</a> Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+suppresses+necroptosis+in+human+cells.">Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+(HSV-1)+and+HSV-2+mediate+species-specific+modulations+of+programmed+necrosis+through+the+viral+ribonucleotide+reductase+large+subunit+R1.">Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1.</a> Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP1/RIP3+binding+to+HSV-1+ICP6+initiates+necroptosis+to+restrict+virus+propagation+in+mice.">RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-independent+contribution+of+ZBP1/DAI/DLM-1-triggered+necroptosis+in+host+defense+against+HSV1.">Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (8), 816 (2018).</li><li>Devos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+of+endogenous+nucleic+acids+by+ZBP1+induces+keratinocyte+necroptosis+and+skin+inflammation.">Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).</li><li>Jiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Z-nucleic-acid+sensing+triggers+ZBP1-dependent+necroptosis+and+inflammation.">Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation.</a> Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).</li><li>de Reuver, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+prevents+autoinflammation+by+suppressing+spontaneous+ZBP1+activation.">ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation.</a> Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).</li><li>Jiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+averts+fatal+type+I+interferon+induction+by+ZBP1.">ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1.</a> Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).</li><li>Hubbard, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+mutation+causes+ZBP1-dependent+immunopathology.">ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology.</a> Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+masks+the+cancer+immunotherapeutic+promise+of+ZBP1-driven+necroptosis.">ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis.</a> Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).</li><li>Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin+amplification+of+biotin+and+horseradish+peroxidase+signals+in+histochemical+stains.">Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).</li><li>Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+DNA+and+mRNA+in+situ+hybridization.">Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization.</a> Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).</li><li>Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+analysis+of+kinase+activity+by+intracellular+flow+cytometry.">Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry.</a> Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).</li><li>Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+mass+spectrometry+(TSA-MS)+ratio+identifies+nuclear+speckle+proteins.">Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).</li><li>Samson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+for+imaging+RIPK1,+RIPK3,+and+MLKL+in+mouse+and+human+cells.">A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells.</a> Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).</li><li>De Groote, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+new+gateway-compatible+inducible+lentiviral+vector+platform+allowing+easy+derivation+of+co-transduced+cells.">Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells.</a> Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).</li><li>Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+ICP6+impedes+TNF+receptor+1-induced+necrosome+assembly+during+compartmentalization+to+detergent-resistant+membrane+vesicles.">Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).</li><li>Mandal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP3+induces+apoptosis+independent+of+pronecrotic+kinase+activity.">RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity.</a> Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+Z-RNAs+induce+ZBP1-mediated+necroptosis.">Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis.</a> Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).</li><li>Garnish, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+interconversion+of+MLKL+and+disengagement+from+RIPK3+precede+cell+death+by+necroptosis.">Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis.</a> Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).</li><li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification.">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedural+requirements+and+recommendations+for+multiplex+immunofluorescence+tyramide+signal+amplification+assays+to+support+translational+oncology+studies.">Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies.</a> Cancers. 12 (2), 255 (2020).</li></ol>

Dieses Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll beschreibt die Verwendung von Tyramid-Signalamplifikation (TSA), um die Empfindlichkeit für Signalereignisse des menschlichen nekrtotischen Signalwegs zu erhöhen, die schwer zu erkennen sind, einschließlich der Phosphorylierung von RIPK3 und MLKL26. Die Einbeziehung eines TSA-Schritts verbessert signifikant die Nachweisschwelle von p-RIPK3 (S227) und p-MLKL (S358) und erhöht die Empfindlichkeit der p-MLKL (S358) Dehnung. TSA enthüllte ein p-RIPK3 (S227)...

Rezeptor-interagierende Serin/Threonin-Proteinkinase 3 (RIPK3) und Mixed Lineage Kinase Domain-like (MLKL) sind zentrale Regulatoren des nekroptotischen Zelltods 1,2. Nekroptose ist eine lytische und entzündliche Form des regulierten Zelltods, die an der antiviralen Immunität und Autoentzündung beteiligt ist. Die Nekroptose von virusinfizierten Zellen stoppt sofort die Virusreplikation. Die Zelllyse nach Nekroptose-Induktion setzt auch schadensassoziierte molekulare Muster frei, die die antivirale Immunität stimulieren 3,4. Die Nekroptose wird durch die Aktivierung von RIPK3 nach RIP homotypic interaction motif (RHIM)-vermittelten Interaktionen mit einem von drei vorgeschalteten aktivierenden Molekülen eingeleitet: RIPK1 (bei TNF-Rezeptor 1 [TNFR1]-Engagement), TIR-Domänen-enthaltendes adapterinduzierendes Interferon-β (TRIF; bei Toll-like-Rezeptor-3- und 4-Engagement) oder dem antiviralen Nukleinsäuresensor Z-DNA-bindende Protein 1 (ZBP1)1,2 . Die Nekroptose-Signalisierung verläuft durch eine Reihe von Phosphorylierungsereignissen, beginnend mit der Autophosphorylierung von RIPK3. Die Autophosphorylierung von humanem RIPK3 an Serin (S)227 innerhalb seiner Kinasedomäne ist eine Voraussetzung für die Nekroptose, indem sie die Interaktion mit MLKL ermöglicht und wird üblicherweise als biochemischer Marker für die Aktivierung von humanem RIPK3 und den nekroptischen Zelltod verwendet 1,5. Nach der Aktivierung phosphoryliert RIPK3 die Aktivierungsschleife von MLKL an Threonin (T)357 und S3581. Dies führt zu einer Änderung der MLKL-Konformation, was zu einer Exposition der N-terminalen Vier-Helix-Bündeldomäne führt. MLKL oligomerisiert dann und transportiert zur Zellmembran, wo es durch das Einführen der exponierten vier Helixbündel in die Lipiddoppelschicht eine Pore bildet, was schließlich zum Zelltod führt 2,6.
ZBP1 ist ein antiviraler Nukleinsäuresensor, der linkshändige Z-Form-Nukleinsäuren einschließlich doppelsträngiger RNA in der Z-Konformation (Z-RNA) erkennt. Die Z-RNA-Bindung erfolgt über zwei Zα-Domänen, die am N-Terminus von ZBP1 positioniert sind. Es wird angenommen, dass Z-RNA, die sich während einer RNA- und DNA-Virusinfektion ansammelt, ZBP1 7,8 direkt angreift. Aktiviertes ZBP1 rekrutiert RIPK3 durch seine zentralen RHIMs und induziert einen regulierten Zelltod, einschließlich Nekroptose 9,10. Viren haben zahlreiche Fluchtmechanismen angenommen, um der ZBP1-induzierten Wirtszellnekroptoseentgegenzuwirken 11. Zum Beispiel beherbergt die Herpes-simplex-Virus 1 (HSV-1) Ribonukleotid-Reduktase-Untereinheit 1, bekannt als ICP6 und kodiert durch UL39, RHIM an seinem N-Terminus, der die ZBP1-vermittelte RIPK3-Aktivierung in menschlichen Zellenstört 12,13,14,15. ZBP1 schränkt nicht nur die Virusreplikation ein, sondern Mausstudien haben gezeigt, dass die ZBP1-Aktivierung entzündliche Erkrankungen verursacht und die Krebsimmunität stimuliert 16,17,18,19,20,21. Protokolle, die Signalereignisse erkennen, die während der ZBP1-induzierten Nekroptose in menschlichen Zellen auftreten, sind daher wertvoll, um die Rolle von ZBP1 in diesen Prozessen zu beurteilen.
Die Tyramid-Signalamplifikation (TSA), auch als katalysierte Reporterabscheidung (CARD) bezeichnet, wurde entwickelt, um die Nachweisgrenze und das Signal-Rausch-Verhältnis in Antikörper-basierten Immunoassays zu verbessern. Während der TSA kann jeder primäre Antikörper verwendet werden, um das interessierende Antigen nachzuweisen. Meerrettichperoxidase (HRP), gekoppelt an einen sekundären Antikörper, katalysiert den lokalen Aufbau von biotinylierten Tyramidradikalen in Gegenwart von Wasserstoffperoxid. Diese aktivierten Biotin-Tyramid-Radikale reagieren dann mit proximalen Tyrosinresten zu kovalenten Bindungen. Mögliche Tyramid-Biotin-Substrate umfassen das Antigen selbst, die primären und sekundären Antikörper und benachbarte Proteine. Während TSA die Empfindlichkeit des Assays signifikant verbessert, geht ein Teil seiner räumlichen Auflösung verloren. In einem letzten Schritt werden Biotinmoleküle mit fluoreszenzmarkiertem Streptavidin nachgewiesen. Die HRP-Reaktion lagert viele Tyramid-Biotin-Moleküle auf oder in der Nähe des interessierenden Antigens ab. Dies erhöht die Anzahl der Streptavidin-Fluorochrom-Bindungsstellen erheblich, wodurch die Empfindlichkeit des Assays stark verstärkt wird (Abbildung 1). Alternativ kann Tyramid direkt an ein Fluorochrom gekoppelt werden, wodurch die Notwendigkeit von Streptavidin-gekoppelten Fluorophoren entfällt. Proteinimmunhistochemie und DNA/RNA in situ Hybridisierung gehörten zu den ersten Methoden, bei denen TSA zur Verbesserung der Signalintensitäten eingesetzt wurde22,23. In jüngerer Zeit wurde TSA mit intrazellulärer Durchflusszytometrie24 und Massenspektrometrie25 kombiniert.
Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Nachweis von Serin 227 phosphoryliertem humanem RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) und phosphoryliertem humanem MLKL (p-MLKL [S358]) nach Aktivierung von ZBP1 durch HSV-1-Infektion mittels Immunfluoreszenzmikroskopie. Wir verwenden eine nekroptosesensitive HT-29 humane kolorektale Adenokarzinom-Zelllinie, die transduziert wurde, um menschliches ZBP1 stabil zu exprimieren. Diese Zellen wurden mit einem HSV-1-Stamm infiziert, der ein mutiertes ICP6-Protein (HSV-1 ICP6mutRHIM) exprimierte, in dem vier Kernaminosäuren innerhalb des viralen RHIM (VQCG) durch Alanine (AAAA) ersetzt wurden, wodurch das ICP6 nicht in der Lage war, die ZBP1-vermittelte Nekroptosezu blockieren 13,14,15. Um das Problem des niedrigen Signal-Rausch-Verhältnisses der derzeit kommerziell verfügbaren Antikörper gegen p-RIPK3 und p-MLKL bei der Immunfärbung26 zu überwinden, führen wir einen Tyramid-Signalamplifikationsschritt (TSA) durch (Abbildung 1), der zum robusten Nachweis von humanem p-RIPK3 (S227) führt und die Detektionsempfindlichkeit von humanem p-MLKL (S358) um eine Größenordnung verbessert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP</td>
			<td>Agilent Technologies Belgium</td>
			<td>K4002</td>
			<td>Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse DyLight 633</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>35513</td>
			<td>Secundary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 ICP0</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53070</td>
			<td>Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV-PR8 mouse serum</td>
			<td>In house production</td>
			<td>xx</td>
			<td>Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMLKL</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab187091</td>
			<td>Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRIPK3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab209384</td>
			<td>Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophores</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D21490</td>
			<td>To visualise the nucleus of the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>S11226</td>
			<td>To visulalise biotin molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compounds</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Oxidising substrate, necessary for HRP activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>SANBIO</td>
			<td>AR1068</td>
			<td>To fix/crosslink the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinyl-tyramide</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6241</td>
			<td>To amplify signal, HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV-6</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7597</td>
			<td>BV6 IAP Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>For cell culture: to detach the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>8.0 g/L NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.4 g/L disodium salt of EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.04%</td>
			<td>In house formulation</td>
			<td></td>
			<td>1.1 g/L Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>TICO</td>
			<td>FBS EU XXX</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSK&#39;840</td>
			<td>Aobious</td>
			<td>AOB0917</td>
			<td>RIPK3 kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10444402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td>In house production</td>
			<td>-</td>
			<td>Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td>To permeabilise the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11732</td>
			<td>For cell counting, used as live/dead marker at 0,1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4424</td>
			<td>For cell culture: to detach the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zVAD</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>BACE4026865.0005</td>
			<td>Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 well high glass bottom</td>
			<td>iBidi</td>
			<td>80807</td>
			<td>To culture the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Preping Balls-size medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71001-10</td>
			<td>To clean the objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518 F / 30 &#176;C</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>444970-9000-000</td>
			<td>To visualise the sample at high magnifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaner</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>000000-0105-200</td>
			<td>To clean the objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM880 Fast Airyscan confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To visualise the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Office</td>
			<td>xx</td>
			<td>To process the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>xx</td>
			<td>To analyse the data- statistical testing and graph generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Volocity</td>
			<td>xx</td>
			<td>To perform quantifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen black</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>xx</td>
			<td>To aquire and process images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen blue</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>xx</td>
			<td>To visualise images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viruses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 (mutRHIM) F strain</td>
			<td>produced by&#160; Dr. Jiahuai Han</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG&#62;AAAA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 (WT) F strain</td>
			<td>Produced by Dr. Jiahuai Han</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV PR8</td>
			<td>in house stock</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>IAV as a trigger for necroptosis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tyramide signal amplification for the immunofluorescent staining of zbp1-dependent phosphorylation of ripk3 and mlkl after hsv-1 infection in human cells

Die Kinase-Rezeptor-interagierende Serin/Threonin-Proteinkinase 3 (RIPK3) und ihre substratgemischte Linie Kinase Domain-like (MLKL) sind kritische Regulatoren der Nekroptose, einer entzündlichen Form des Zelltods mit wichtigen antiviralen Funktionen. Die Autophosphorylierung von RIPK3 induziert die Phosphorylierung und Aktivierung des porenbildenden Henkerproteins der Nekroptose MLKL. Der Transport und die Oligomerisierung von phosphoryliertem MLKL an der Zellmembran führt zur Zelllyse, die für den nekroptotischen Zelltod charakteristisch ist. Der Nukleinsäuresensor ZBP1 wird durch Bindung an linkshändige Z-Form doppelsträngige RNA (Z-RNA) nach Infektion mit RNA- und DNA-Viren aktiviert. Die ZBP1-Aktivierung schränkt die Virusinfektion ein, indem sie den regulierten Zelltod, einschließlich Nekroptose, infizierter Wirtszellen induziert. Die Immunfluoreszenzmikroskopie erlaubt die Visualisierung verschiedener Signalschritte nach ZBP1-vermittelter Nekroptose pro Zelle. Die Empfindlichkeit der Standard-Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung derzeit kommerziell verfügbarer Phospho-spezifischer Antikörper gegen humanes RIPK3 und MLKL schließt jedoch eine reproduzierbare Bildgebung dieser Marker aus. Hier beschreiben wir ein optimiertes Färbeverfahren für Serin (S) phosphoryliertes RIPK3 (S227) und MLKL (S358) in humanen HT-29-Zellen, die mit Herpes-simplex-Virus 1 (HSV-1) infiziert sind. Die Aufnahme eines Tyramid-Signalamplifikationsschritts (TSA) in das Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll ermöglicht den spezifischen Nachweis von S227 phosphoryliertem RIPK3. Darüber hinaus erhöht TSA die Empfindlichkeit der Detektion von S358 phosphoryliertem MLKL erheblich. Zusammen ermöglicht diese Methode die Visualisierung dieser beiden kritischen Signalereignisse während der Induktion der ZBP1-induzierten Nekroptose.

Der Immunfluoreszenznachweis der MLKL-Phosphorylierung und insbesondere der RIPK3-Phosphorylierung in menschlichen Zellen ist technisch anspruchsvoll26. Wir präsentieren hier ein verbessertes Färbeprotokoll für humanes p-RIPK3 (S227) und p-MLKL (S358) nach der Aktivierung von ZBP1. Das Protokoll beinhaltet einen TSA-Schritt zur Verbesserung der Nachweisgrenze und Empfindlichkeit der Fluoreszenzsignale. Um die Methode zu validieren, wurde ein Side-by-Side-Vergleich der TSA-vermittelten Immunfluo...

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Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells

Die Tyramid-Signalverstärkung während der Immunfluoreszenzfärbung ermöglicht den sensitiven Nachweis von phosphoryliertem RIPK3 und MLKL während der ZBP1-induzierten Nekroptose nach HSV-1-Infektion.

Tyramid-Signalamplifikation zur Immunfluoreszenzfärbung der ZBP1-abhängigen Phosphorylierung von RIPK3 und MLKL nach HSV-1-Infektion in menschlichen Zellen

The kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) and its substrate mixed lineage kinase domain-like (MLKL) are critical ...

Die robuste Visualisierung von phosphoryliertem RIPK3 und MLKL, zwei wichtigen Signalereignissen während der Nekroptose-Induktion, war eine technische Herausforderung. Das vorgestellte Tyramid-Amplifikationsprotokoll ermöglicht einen sensitiven Nachweis dieser beiden Moleküle. Der Signalverstärkungsschritt senkt die Detektionsschwelle und ermöglicht eine robuste und reproduzierbare Detektion von phosphoryliertem RIPK3 und MLKL.Beginnen Sie mit der Aussaat der 90.000 ZBP1-exprimierenden HT-29-Zellen im 5A-Medium von McCoy in voller Stärke in einer Vertiefungsplatte mit einer Fläche von einem Zentimeter, die eine High-End-Mikroskopie ermöglicht. Verwenden Sie ein Endvolumen von 200 Mikrolitern pro Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.Sobald die Zellen 70 bis 80% Konfluenz erreichen, infizieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern vorgewärmtem, vollwertigem McCoy's 5A-Medium, das Herpes-simplex-Virus eins enthält und eine Randmutante ICP6 bei einer Vielzahl von Infektionen von fünf kodiert. Inkubieren Sie die Zellen neun Stunden lang mit dem Virus, um eine Nekroptose zu induzieren. Als Positivkontrolle für die Nekroptose-Induktion stimulieren Sie die Zellen vier Stunden lang mit 200 Mikrolitern vorgewärmtem Nekroptose-induzierenden Cocktail.Als Negativkontrolle fügen Sie 22 Mikroliter 10 Mikromolare GSK840 hinzu, die bei 37 Grad Celsius vorgewärmt sind, um die RIPK3-Kinaseaktivität zu hemmen. Schließen Sie diesen Inhibitor in einem unbehandelten Zustand und nach Nekroptosestimulation ein, um die Autophosphorylierung von Serin 227 zu verhindern. Um die Zellen zu fixieren, entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern PBS.Dann entfernen Sie das PBS und fügen Sie 150 Mikroliter 4% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Entfernen Sie nach der Fixierung die 4% Paraformaldehyd und waschen Sie die Zellen dreimal mit 200 Mikrolitern PBS.Die Proben können über PBS bei vier Grad Celsius über Nacht bis zur Weiterverarbeitung gelagert werden. Entfernen Sie das PBS von der Platte und inkubieren Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern Permeationspuffer bei Raumtemperatur für 30 Minuten auf einem kippbaren Laborshaker. Entfernen Sie nach der Inkubation den Permeabilisierungspuffer und waschen Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern Waschpuffer.Inkubieren Sie die Bildgebungskammer mit Waschpuffer für fünf Minuten bei Raumtemperatur auf einem kippbaren Laborshaker. Um die unspezifische Bindung von primären Antikörpern zu verhindern, inkubieren Sie die Platte mit 100 Mikrolitern Blockmedium bei Raumtemperatur für zwei Stunden auf einem kippbaren Laborschüttler. Als nächstes waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit 100 Mikrolitern Waschpuffer mit fünf Minuten Inkubation bei Raumtemperatur auf einem kippbaren Laborshaker.Nach dem Entfernen des Waschpuffers 100 Mikroliter der primären Antikörper in die Bildgebungskammer geben. Stellen Sie sicher, dass keine primäre Antikörperbedingung enthalten ist, um den potenziellen Hintergrund der Tyramidsignalverstärkung zu visualisieren und die Maskierungsschwelle festzulegen. Die Kammer über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.Entfernen Sie die primäre Antikörpermischung und waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit 100 Mikrolitern Waschpuffer mit fünf Minuten Inkubation bei Raumtemperatur auf einem kippbaren Laborschüttler. Nach dem Entfernen des Waschpuffers inkubieren Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern HRP-markiertem sekundären Antikörper und erkennen Sie die Spezies des primären Antikörpers, die für 30 Minuten auf einem kippbaren Laborschüttler amplifiziert werden sollen. Während der Antikörperinkubation die biotinylierte Tyramidmischung vorbereiten.Um die enzymatische Aktivität von HRP auszulösen, fügen Sie dem TSA-Puffer vor Gebrauch frisch ein oxidierendes Substrat hinzu. Anschließend wird das biotinylierte Tyramid im vorbereiteten TSA-Puffer unter Verwendung der optimierten Verdünnung verdünnt. Nach der Inkubation mit HRP-markierten sekundären Antikörpern waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit Waschpuffer mit fünf Minuten Inkubation auf einem kippbaren Laborschüttler.Nach dem Entfernen des Waschpuffers aus der Vertiefung wird verdünntes Biotin-Tyramid zu einem Endvolumen von 100 Mikrolitern in die Vertiefung gegeben. Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für 10 Minuten auf einem kippbaren Laborschüttler, gefolgt von drei Waschpufferwäschen. Bereiten Sie die Färbemischung vor, die den sekundären Antikörper, gekoppeltes Streptavidin und Kernfärbung und Waschpuffer enthält.Entfernen Sie den Waschpuffer und inkubieren Sie die Platte mit 100 Mikrolitern Färbemischung bei Raumtemperatur für eine Stunde auf einem kippbaren Laborschüttler. Halten Sie die Bildkammern ab diesem Schritt lichtgeschützt. Nach dem Färben zweimal nacheinander mit Waschpuffer waschen und die Vertiefungen zweimal mit PBS abspülen.Lagern Sie die Proben über PBS hinaus bei vier Grad Celsius, um die Färbung bis zur Bildgebung zu erhalten. Die Bildgebungskammer kann nun auf einem konfokalen Mikroskop visualisiert werden. Die Einbeziehung der Tyramid-Signalverstärkung ermöglichte den robusten Nachweis von RIPK3, das an Serin 227 im Zytosol des Herpes-simplex-Virus one phosphoryliert wurde, das für eine mit der Felgenmutante ICP6 infizierte Zellen kodiert.Eine Laserleistung von 2% war für die empfindliche Detektion ausreichend. Bei der indirekten Standard-Immunfluoreszenz reichte eine höhere Laserleistung für den Nachweis von Phospho-RIPK3 nicht aus. Bei der Quantifizierung der dreidimensionalen Z-Stack-Bilder zeigten die infizierten Zellen einen etwa 20-fachen Anstieg der Voxel, die positiv für phosphoryliertes RIPK3 waren, gegenüber pseudobehandelten Zellen.Eine erhöhte Phospho-RIPK3-Färbung von Wildtyp-Herpes-simplex-Virus-eins-infizierten Zellen im Vergleich zu nachgebildeten behandelten Zellen zeigte, dass die Randdomäne von ICP6 nicht in der Lage ist, die RIPK3-Phosphorylierung an Serin 227 vollständig zu blockieren. GSK840 bindet an die Kinasedomäne von RIPK3 und verhindert die RIPK3-Phosphorylierung bei Serin 227 nach ZBP1-Aktivierung, was die Spezifität der Tyramid-Signalamplifikations-vermittelten Phospho-RIPK3-Detektionsmethode bestätigt. Die simulierten Zellen zeigten eine geringe leicht punktierte zytosolische Färbung der MLKL-Phosphorylierung bei Serin 358, während eine starke Färbung im Zytosol, im Zellkern und in der Plasmamembran der infizierten Zellen nachgewiesen wurde.Die standardmäßige indirekte Immunfluoreszenz benötigte 40% Laserleistung für den spezifischen Nachweis eines Phospho-MLKL-Signals in den infizierten Zellen. Im Gegensatz dazu erhöhte die Tyramid-Signalverstärkung die Detektionsempfindlichkeit von Phospho-MLKL, wodurch die erforderliche Laserleistung auf 6% gesenkt wurde. Die 3D-Z-Stack-Bildquantifizierung zeigte einen etwa 90-fachen Anstieg der Anzahl der Voxel, die mit Tyramid-Signalverstärkung positiv für Phospho-MLKL waren, verglichen mit einer siebenfachen Erhöhung mit der Standardmethode, was auf eine verbesserte Nachweisschwelle und Empfindlichkeit für Phospho-MLKL hinweist. Ähnlich wie Herpes-simplex-Virus löste die Influenza-A-Virusinfektion eine ZBP1-abhängige Nekroptose aus.Die Tyramid-Signalverstärkung ermöglichte den robusten Nachweis von Phospho-RIPK3 und Phospho-MLKL, was auf eine Nekroptose hindeutet. Um die konfokale Färbung zu interpretieren, müssen mehrere Färbekontrollen einbezogen werden. Dies beinhaltet eine keine primäre Bedingung, einzelne Flecken sowie eine Positivkontrolle.Durch die Anpassung dieses Protokolls können mehrere Ziele mithilfe sequentieller TSA verstärkt werden. Dies würde den Nachweis von phosphoryliertem RIPK3 und MLKL innerhalb derselben Zelle ermöglichen. Der empfindliche Nachweis von Nekroptose-Biomarkern kann für die laufende ZBP1-Forschung zu Autoinflammation oder Virusinfektion aufschlussreich sein, bei der die ausgeführten ZBP1-abhängigen Zelltodwege noch als Nekroptose, Apoptose oder Pyroptose bestätigt werden müssen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Alloantigen-specific Anergy in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells by Alloantigen Stimulation with Co-stimulatory Signal Blockade

Induktion von Alloantigen-spezifische Anergie in humanen peripheren mononukleären Zellen durch Alloantigen Stimulation mit Co-stimulatorische Signal Blockade

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) offers the best chance of cure for many patients with congenital and acquired hematologic ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Auswahl der Plasmodium falciparum Parasiten für Cytoadhesion zu Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Nach Cell-Schicksal<em&gt; E. coli</em&gt; Nach Infektion mit Phagen

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Erkennen von Glykogen in peripheren mononukleären Blutzellen mit Perjodsäure-Schiff-Färbung

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Die Entwicklung der Lyophilisierte Loop-mediated Isothermal Amplification Reagenzien zum Nachweis von<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Bewertung der zytotoxischen und immunmodulatorische Wirkung von Substanzen im menschlichen Precision-Cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue

Co Färbung Blutgefäße und Nervenfasern im Fettgewebe

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Pneumokokken-Infektion von primären humanen Endothelzellen im konstanten Fluss

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...