Name: tyramide signal amplification for the immunofluorescent staining of zbp1-dependent phosphorylation of ripk3 and mlkl after hsv-1 infection in human cells
Uploaded: 2022-10-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells at J

Vorremmo ringraziare il VIB Bioimaging Core per la formazione, il supporto e l'accesso al parco strumenti. J.N. è supportato da una borsa di dottorato della Research Foundation Flanders (FWO). La ricerca nel gruppo J.M. è stata sostenuta da un Odysseus II Grant (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), un junior research grant (G031022N) dalla Research Foundation Flanders (FWO), un CRIG young investigator proof-of-concept grant e dall'Università di Gand. La ricerca nel gruppo P.V. è stata sostenuta da EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG e GIGG consortia e VIB.

1. Preparazione di tiramide biotinilata
<ol><li>Preparare la tiramide biotinilata a partire dalla biotina-tiramide. Per preparare una soluzione madre da 10 mM, sciogliere 3,6 mg di biotina-tiramide in 1 ml di DMSO. Conservare il prodotto disciolto in aliquote a −20 °C per preservarne la qualità.</li>
</ol>2. Mantenimento delle cellule HT-29 in coltura
NOTA: Gli HT-29 che esprimono ZBP1 sono stati generati per trasduzione con un lent...

<ol>
	<li>Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+necroptosis+by+post-translational+modifications.">The regulation of necroptosis by post-translational modifications.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).</li><li>Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+necroptotic+cell+death+signaling.">The structural basis of necroptotic cell death signaling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).</li><li>Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis:+The+Trojan+horse+in+cell+autonomous+antiviral+host+defense.">Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense.</a> Virology. 479-480, 160-166 (2015).</li><li>Nailwal, H., Chan, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+in+anti-viral+inflammation.">Necroptosis in anti-viral inflammation.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).</li><li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+RIPK3+maintains+MLKL+in+an+inactive+conformation+prior+to+cell+death+by+necroptosis.">Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis.</a> Nature Communications. 12 (1), 6783 (2021).</li><li>Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location,+location,+location:+A+compartmentalized+view+of+TNF-induced+necroptotic+signaling.">Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling.</a> Science Signalling. 14 (668), (2021).</li><li>Koehler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+E3+prevents+sensing+of+Z-RNA+to+block+ZBP1-dependent+necroptosis.">Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis.</a> Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).</li><li>Balachandran, S., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Z-RNA+triggers+ZBP1-dependent+cell+death.">Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death.</a> Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).</li><li>Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZBP1:+Innate+sensor+regulating+cell+death+and+inflammation.">ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation.</a> Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).</li><li>Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+sensors+and+programmed+cell+death.">Nucleic acid sensors and programmed cell death.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).</li><li>Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+manipulation+of+host+cell+necroptosis+and+pyroptosis.">Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis.</a> Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+suppresses+necroptosis+in+human+cells.">Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+(HSV-1)+and+HSV-2+mediate+species-specific+modulations+of+programmed+necrosis+through+the+viral+ribonucleotide+reductase+large+subunit+R1.">Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1.</a> Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP1/RIP3+binding+to+HSV-1+ICP6+initiates+necroptosis+to+restrict+virus+propagation+in+mice.">RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-independent+contribution+of+ZBP1/DAI/DLM-1-triggered+necroptosis+in+host+defense+against+HSV1.">Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (8), 816 (2018).</li><li>Devos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+of+endogenous+nucleic+acids+by+ZBP1+induces+keratinocyte+necroptosis+and+skin+inflammation.">Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).</li><li>Jiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Z-nucleic-acid+sensing+triggers+ZBP1-dependent+necroptosis+and+inflammation.">Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation.</a> Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).</li><li>de Reuver, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+prevents+autoinflammation+by+suppressing+spontaneous+ZBP1+activation.">ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation.</a> Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).</li><li>Jiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+averts+fatal+type+I+interferon+induction+by+ZBP1.">ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1.</a> Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).</li><li>Hubbard, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+mutation+causes+ZBP1-dependent+immunopathology.">ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology.</a> Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+masks+the+cancer+immunotherapeutic+promise+of+ZBP1-driven+necroptosis.">ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis.</a> Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).</li><li>Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin+amplification+of+biotin+and+horseradish+peroxidase+signals+in+histochemical+stains.">Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).</li><li>Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+DNA+and+mRNA+in+situ+hybridization.">Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization.</a> Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).</li><li>Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+analysis+of+kinase+activity+by+intracellular+flow+cytometry.">Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry.</a> Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).</li><li>Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+mass+spectrometry+(TSA-MS)+ratio+identifies+nuclear+speckle+proteins.">Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).</li><li>Samson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+for+imaging+RIPK1,+RIPK3,+and+MLKL+in+mouse+and+human+cells.">A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells.</a> Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).</li><li>De Groote, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+new+gateway-compatible+inducible+lentiviral+vector+platform+allowing+easy+derivation+of+co-transduced+cells.">Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells.</a> Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).</li><li>Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+ICP6+impedes+TNF+receptor+1-induced+necrosome+assembly+during+compartmentalization+to+detergent-resistant+membrane+vesicles.">Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).</li><li>Mandal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP3+induces+apoptosis+independent+of+pronecrotic+kinase+activity.">RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity.</a> Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+Z-RNAs+induce+ZBP1-mediated+necroptosis.">Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis.</a> Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).</li><li>Garnish, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+interconversion+of+MLKL+and+disengagement+from+RIPK3+precede+cell+death+by+necroptosis.">Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis.</a> Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).</li><li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification.">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedural+requirements+and+recommendations+for+multiplex+immunofluorescence+tyramide+signal+amplification+assays+to+support+translational+oncology+studies.">Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies.</a> Cancers. 12 (2), 255 (2020).</li></ol>

Questo protocollo di colorazione immunofluorescente descrive l'uso dell'amplificazione del segnale della tiramido (TSA) per aumentare la sensibilità agli eventi di segnalazione della via di segnalazione necroptotica umana che sono difficili da rilevare, compresa la fosforilazione di RIPK3 e MLKL26. L'inclusione di un gradino TSA migliora significativamente la soglia di rilevamento di p-RIPK3 (S227) e p-MLKL (S358) e aumenta la sensibilità dello sforzo p-MLKL (S358). TSA ha rivelato un segnale p-...

La proteina chinasi 3 serina/treonina interagente con recettore (RIPK3) e la chinasi mista (MLKL) sono regolatori centrali della morte cellulare necroptotica 1,2. La necroptosi è una forma litica e infiammatoria di morte cellulare regolata coinvolta nell'immunità antivirale e nell'autoinfiammazione. La necroptosi delle cellule infette da virus interrompe immediatamente la replicazione del virus. La lisi cellulare dopo induzione necroptosi rilascia anche modelli molecolari associati al danno, che stimolano l'immunità antivirale 3,4. La necroptosi è iniziata dall'attivazione di RIPK3 a seguito di interazioni mediate dal motivo di interazione omotipica (RHIM) RIP con una delle tre molecole attivanti a monte: RIPK1 (su coinvolgimento del recettore TNF 1 [TNFR1]), interferone-β che induce adattatori del dominio TIR (TRIF; su coinvolgimento dei recettori Toll-like 3 e 4) o la proteina legante il DNA 1 del sensore di acido nucleico antivirale (ZBP1)1,2 . La segnalazione della necroptosi procede attraverso una serie di eventi di fosforilazione a partire dall'autofosforilazione di RIPK3. L'autofosforilazione di RIPK3 umano alla serina (S)227 all'interno del suo dominio chinasico è un prerequisito per la necroptosi consentendo l'interazione con MLKL ed è comunemente usato come marcatore biochimico per l'attivazione di RIPK3 umano e la morte delle cellule necroptotiche 1,5. Una volta attivato, RIPK3 fosforila il ciclo di attivazione di MLKL a livello di treonina (T)357 e S3581. Ciò provoca un cambiamento nella conformazione MLKL, con conseguente esposizione del dominio del fascio a quattro eliche N-terminale. MLKL quindi oligomerizza e traffica verso la membrana cellulare dove forma un poro attraverso l'inserimento dei quattro fasci di eliche esposti nel doppio strato lipidico, portando infine alla morte cellulare 2,6.
ZBP1 è un sensore di acido nucleico antivirale che riconosce gli acidi nucleici sinistrorsi a forma Z, incluso l'RNA a doppio filamento nella conformazione Z (Z-RNA). Il legame Z-RNA avviene tramite due domini Zα posizionati al N-terminale di ZBP1. Si ritiene che lo Z-RNA che si accumula durante l'infezione da virus dell'RNA e del DNA coinvolga direttamente ZBP1 7,8. ZBP1 attivato recluta RIPK3 attraverso i suoi RHIM centrali e induce la morte cellulare regolata, inclusa la necroptosi 9,10. I virus hanno adottato numerosi meccanismi di fuga per contrastare la necroptosi delle cellule ospiti indotta da ZBP111. Ad esempio, la subunità 1 della ribonucleotide reduttasi del virus dell'herpes simplex 1 (HSV-1), nota come ICP6 e codificata da UL39, ospita RHIM al suo N-terminale che interferisce con l'attivazione di RIPK3 mediata da ZBP1 nelle cellule umane12,13,14,15. ZBP1 non solo limita la replicazione virale, ma studi sui topi hanno dimostrato che l'attivazione di ZBP1 causa malattie infiammatorie e stimola l'immunità al cancro 16,17,18,19,20,21. I protocolli che rilevano gli eventi di segnalazione che si verificano durante la necroptosi indotta da ZBP1 nelle cellule umane sono, quindi, preziosi per valutare il ruolo di ZBP1 in questi processi.
L'amplificazione del segnale di tiramido (TSA), nota anche come CARD (Catalyzed Reporter Deposition), è stata sviluppata per migliorare il limite di rilevazione e il rapporto segnale-rumore nei saggi immunologici basati su anticorpi. Durante la TSA, qualsiasi anticorpo primario può essere utilizzato per rilevare l'antigene di interesse. La perossidasi del rafano (HRP), accoppiata ad un anticorpo secondario, catalizza l'accumulo locale di radicali tiramidici biotinilati in presenza di perossido di idrogeno. Questi radicali biotina-tiramide attivati reagiscono quindi con residui di tirosina prossimale per formare legami covalenti. I potenziali substrati di tiramide-biotina includono l'antigene stesso, gli anticorpi primari e secondari e le proteine vicine. Pertanto, mentre la TSA migliora significativamente la sensibilità del test, parte della sua risoluzione spaziale viene persa. In una fase finale, le molecole di biotina vengono rilevate utilizzando streptavidina marcata con fluorescenza. La reazione HRP deposita molte molecole di tiramide-biotina sopra o vicino all'antigene di interesse. Ciò aumenta notevolmente il numero di siti di legame streptavidina-fluorocromo, amplificando così notevolmente la sensibilità del saggio (Figura 1). In alternativa, la tiramide può essere accoppiata direttamente a un fluorocromo, eliminando la necessità di fluorofori accoppiati a streptavidina. L'immunoistochimica delle proteine e l'ibridazione DNA/RNA in situ sono stati tra i primi metodi con cui la TSA è stata impiegata per migliorare l'intensità del segnale22,23. Più recentemente, la TSA è stata combinata con citometria a flusso intracellulare24 e spettrometria di massa25.
Qui, presentiamo un protocollo per rilevare la serina 227 fosforilata umana RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) e la MLKL umana fosforilata (p-MLKL [S358]) dopo l'attivazione di ZBP1 da infezione da HSV-1 utilizzando la microscopia a immunofluorescenza. Utilizziamo una linea cellulare di adenocarcinoma colorettale umano HT-29 sensibile alla necroptosi che è stata trasdotta per esprimere stabilmente ZBP1 umano. Queste cellule sono state infettate con un ceppo HSV-1 che esprime una proteina ICP6 mutante (HSV-1 ICP6mutRHIM) in cui quattro aminoacidi core all'interno del RHIM virale (VQCG) sono stati sostituiti da alanine (AAAA), rendendo così l'ICP6 incapace di bloccare la necroptosi 13,14,15 mediata da ZBP1. Per superare il problema del basso rapporto segnale-rumore degli anticorpi attualmente disponibili in commercio diretti contro p-RIPK3 e p-MLKL nell'immunocolorazione26, eseguiamo una fase di amplificazione del segnale del tiramide (TSA) (Figura 1), che si traduce nella robusta rilevazione di p-RIPK3 umano (S227) e migliora la sensibilità di rilevamento del p-MLKL umano (S358) di un ordine di grandezza.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP</td>
			<td>Agilent Technologies Belgium</td>
			<td>K4002</td>
			<td>Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse DyLight 633</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>35513</td>
			<td>Secundary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 ICP0</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53070</td>
			<td>Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV-PR8 mouse serum</td>
			<td>In house production</td>
			<td>xx</td>
			<td>Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMLKL</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab187091</td>
			<td>Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRIPK3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab209384</td>
			<td>Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophores</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D21490</td>
			<td>To visualise the nucleus of the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>S11226</td>
			<td>To visulalise biotin molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compounds</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Oxidising substrate, necessary for HRP activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>SANBIO</td>
			<td>AR1068</td>
			<td>To fix/crosslink the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinyl-tyramide</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6241</td>
			<td>To amplify signal, HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV-6</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7597</td>
			<td>BV6 IAP Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>For cell culture: to detach the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>8.0 g/L NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.4 g/L disodium salt of EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.04%</td>
			<td>In house formulation</td>
			<td></td>
			<td>1.1 g/L Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>TICO</td>
			<td>FBS EU XXX</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSK&#39;840</td>
			<td>Aobious</td>
			<td>AOB0917</td>
			<td>RIPK3 kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10444402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td>In house production</td>
			<td>-</td>
			<td>Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td>To permeabilise the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11732</td>
			<td>For cell counting, used as live/dead marker at 0,1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4424</td>
			<td>For cell culture: to detach the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zVAD</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>BACE4026865.0005</td>
			<td>Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 well high glass bottom</td>
			<td>iBidi</td>
			<td>80807</td>
			<td>To culture the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Preping Balls-size medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71001-10</td>
			<td>To clean the objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518 F / 30 &#176;C</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>444970-9000-000</td>
			<td>To visualise the sample at high magnifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaner</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>000000-0105-200</td>
			<td>To clean the objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM880 Fast Airyscan confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To visualise the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Office</td>
			<td>xx</td>
			<td>To process the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>xx</td>
			<td>To analyse the data- statistical testing and graph generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Volocity</td>
			<td>xx</td>
			<td>To perform quantifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen black</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>xx</td>
			<td>To aquire and process images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen blue</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>xx</td>
			<td>To visualise images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viruses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 (mutRHIM) F strain</td>
			<td>produced by&#160; Dr. Jiahuai Han</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG&#62;AAAA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 (WT) F strain</td>
			<td>Produced by Dr. Jiahuai Han</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV PR8</td>
			<td>in house stock</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>IAV as a trigger for necroptosis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tyramide signal amplification for the immunofluorescent staining of zbp1-dependent phosphorylation of ripk3 and mlkl after hsv-1 infection in human cells

La proteina chinasi 3 (RIPK3) e la sua linea mista di substrato (MLKL) sono regolatori critici della necroptosi, una forma infiammatoria di morte cellulare con importanti funzioni antivirali. L'autofosforilazione di RIPK3 induce fosforilazione e attivazione della proteina boia che forma i pori della necroptosi MLKL. Il traffico e l'oligomerizzazione di MLKL fosforilato sulla membrana cellulare provocano la lisi cellulare, caratteristica della morte cellulare necroptotica. Il sensore di acido nucleico ZBP1 viene attivato legandosi all'RNA a doppio filamento sinistrorso a forma Z (Z-RNA) dopo l'infezione da virus a RNA e DNA. L'attivazione di ZBP1 limita l'infezione virale inducendo la morte cellulare regolata, compresa la necroptosi, delle cellule ospiti infette. La microscopia a immunofluorescenza consente la visualizzazione di diverse fasi di segnalazione a valle della necroptosi mediata da ZBP1 su base cellulare. Tuttavia, la sensibilità della microscopia a fluorescenza standard, che utilizza gli attuali anticorpi fosfo-specifici disponibili in commercio contro RIPK3 e MLKL umani, preclude l'imaging riproducibile di questi marcatori. Qui, descriviamo una procedura di colorazione ottimizzata per la serina (S) fosforilata RIPK3 (S227) e MLKL (S358) in cellule umane HT-29 infettate da herpes simplex virus 1 (HSV-1). L'inclusione di una fase di amplificazione del segnale di tiramide (TSA) nel protocollo di colorazione immunofluorescente consente la rilevazione specifica di RIPK3 fosforilato S227. Inoltre, TSA aumenta notevolmente la sensibilità del rilevamento di MLKL fosforilato S358. Insieme, questo metodo consente la visualizzazione di questi due eventi di segnalazione critici durante l'induzione della necroptosi indotta da ZBP1.

La rilevazione immunofluorescente della fosforilazione di MLKL e in particolare della fosforilazione di RIPK3 nelle cellule umane è tecnicamente impegnativa26. Presentiamo qui un protocollo di colorazione migliorato per p-RIPK3 (S227) e p-MLKL (S358) umani dopo l'attivazione di ZBP1. Il protocollo include una fase TSA per migliorare il limite di rilevamento e la sensibilità dei segnali fluorescenti. Per convalidare il metodo, è stato eseguito un confronto fianco a fianco dell'immunofluorescenza...

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Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells

L'amplificazione del segnale della tiramido durante la colorazione immunofluorescente consente la rilevazione sensibile di RIPK3 e MLKL fosforilati durante la necroptosi indotta da ZBP1 dopo infezione da HSV-1.

Amplificazione del segnale tiramido per la colorazione immunofluorescente della fosforilazione ZBP1-dipendente di RIPK3 e MLKL dopo infezione da HSV-1 in cellule umane

The kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) and its substrate mixed lineage kinase domain-like (MLKL) are critical ...

La visualizzazione robusta di RIPK3 e MLKL fosforilati, due eventi di segnalazione chiave durante l'induzione della necroptosi, è stata tecnicamente impegnativa. Il protocollo di amplificazione della tiramido presentato consente il rilevamento sensibile di queste due molecole. La fase di amplificazione del segnale abbassa la soglia di rilevamento, consentendo un rilevamento robusto e riproducibile di RIPK3 e MLKL fosforilati.Inizia a seminare le 90.000 cellule HT-29 che esprimono ZBP1 nel mezzo 5A di McCoy a piena forza in una piastra di superficie di un centimetro quadrato, consentendo la microscopia di fascia alta. Utilizzare un volume finale di 200 microlitri per pozzetto. Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.Una volta che le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza, infettare le cellule in 200 microlitri preriscaldati, mezzo McCoy's 5A a piena forza contenente herpes simplex virus one, codificando un rim mutante ICP6 a una molteplicità di infezione di cinque. Incubare le cellule con il virus per nove ore per indurre necroptosi. Come controllo positivo per l'induzione della necroptosi, stimolare le cellule per quattro ore con 200 microlitri di cocktail preriscaldato che induce necroptosi.Come controllo negativo, aggiungere 22 microlitri di GSK840 micromolari preriscaldati a 37 gradi Celsius per inibire l'attività della chinasi RIPK3. Includere questo inibitore in una condizione non trattata e dopo la stimolazione necroptosi per prevenire l'autofosforilazione della serina 227. Per fissare le cellule, rimuovere il mezzo e lavare le celle con 200 microlitri di PBS.Quindi rimuovere il PBS e aggiungere 150 microlitri di paraformaldeide al 4% equilibrata a temperatura ambiente. Incubare le cellule a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo la fissazione, rimuovere il 4% di paraformaldeide e lavare le cellule tre volte con 200 microlitri di PBS.I campioni possono essere conservati in eccesso di PBS a quattro gradi Celsius durante la notte fino a ulteriore elaborazione. Rimuovere il PBS dalla piastra e incubare le cellule con 100 microlitri di tampone di permeazione a temperatura ambiente per 30 minuti su uno shaker da laboratorio inclinabile. Dopo l'incubazione, rimuovere il tampone di permeabilizzazione e lavare le cellule con 100 microlitri di tampone di lavaggio.Incubare la camera di imaging con tampone di lavaggio per cinque minuti a temperatura ambiente su uno shaker da laboratorio inclinabile. Per evitare il legame non specifico degli anticorpi primari, incubare la piastra con 100 microlitri di mezzo bloccante a temperatura ambiente per due ore su uno shaker da laboratorio inclinabile. Quindi, lavare i pozzetti tre volte con 100 microlitri di tampone di lavaggio con cinque minuti di incubazione a temperatura ambiente su uno shaker da laboratorio inclinabile.Dopo aver rimosso il tampone di lavaggio, aggiungere 100 microlitri di anticorpi primari alla camera di imaging. Assicurarsi di includere una condizione anticorpale non primaria per visualizzare il potenziale sfondo dell'amplificazione del segnale tyramide e impostare la soglia di mascheramento. Incubare la camera durante la notte a quattro gradi Celsius.Rimuovere la miscela di anticorpi primari e lavare i pozzetti tre volte con 100 microlitri di tampone di lavaggio con cinque minuti di incubazione a temperatura ambiente su uno shaker da laboratorio inclinabile. Dopo aver rimosso il tampone di lavaggio, incubare le cellule con 100 microlitri di anticorpo secondario marcato con HRP, riconoscendo la specie dell'anticorpo primario da amplificare per 30 minuti su uno shaker da laboratorio inclinabile. Durante l'incubazione degli anticorpi, preparare la miscela di tiramide biotinilata.Per innescare l'attività enzimatica della HRP, aggiungere un substrato ossidante al tampone TSA appena prima dell'uso. Quindi diluire la tiramide biotinilata nel tampone TSA preparato utilizzando la diluizione ottimizzata. Dopo l'incubazione con anticorpi secondari marcati con HRP, lavare i pozzetti tre volte con tampone di lavaggio con cinque minuti di incubazione su uno shaker da laboratorio inclinabile.Dopo aver rimosso il tampone di lavaggio dal pozzetto, aggiungere biotina-tiramide diluita al pozzetto fino a un volume finale di 100 microlitri. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 10 minuti su uno shaker da laboratorio inclinabile, seguito da tre lavaggi tampone di lavaggio. Preparare la miscela colorante contenente l'anticorpo secondario, la streptavidina accoppiata e la colorazione nucleare e il tampone di lavaggio.Rimuovere il tampone di lavaggio e incubare la piastra con 100 microlitri di miscela colorante a temperatura ambiente per un'ora su uno shaker da laboratorio inclinabile. Tenere le camere di imaging al riparo dalla luce da questo passaggio in poi. Dopo la colorazione, lavare consecutivamente due volte con tampone di lavaggio e sciacquare i pozzetti due volte con PBS.Conservare i campioni in eccesso di PBS a quattro gradi Celsius per preservare la colorazione fino all'imaging. La camera di imaging è ora pronta per essere visualizzata su un microscopio confocale. L'inclusione dell'amplificazione del segnale del tiramido ha permesso la robusta rilevazione di RIPK3 fosforilato alla serina 227 nel citosol del virus dell'herpes simplex uno che codifica per cellule infette da ICP6 mutante del rim.Una potenza laser del 2% era sufficiente per il rilevamento sensibile. Nell'immunofluorescenza indiretta standard, una maggiore potenza laser è rimasta insufficiente per la rilevazione di phospho-RIPK3. Nella quantificazione delle immagini tridimensionali Z-stack, le cellule infette hanno mostrato un aumento di circa 20 volte dei voxel positivi per RIPK3 fosforilato rispetto alle cellule trattate con finzione.L'aumento della colorazione fosfo-RIPK3 delle cellule infettate da herpes simplex virus wild-type one rispetto alle cellule trattate con simulazione ha indicato che il dominio rim di ICP6 non è in grado di bloccare completamente la fosforilazione di RIPK3 alla serina 227. GSK840 si lega al dominio chinasico di RIPK3 e previene la fosforilazione di RIPK3 alla serina 227 dopo l'attivazione di ZBP1, confermando la specificità del metodo di rilevazione fosfo-RIPK3 mediato dall'amplificazione del segnale della tiramide. Le cellule trattate con simulazione hanno mostrato una bassa colorazione citosolica leggermente punteggiata della fosforilazione di MLKL alla serina 358, mentre una forte colorazione è stata rilevata nel citosol, nel nucleo e nella membrana plasmatica delle cellule infette.L'immunofluorescenza indiretta standard richiedeva una potenza laser del 40% per la rilevazione specifica di un segnale fosfo-MLKL nelle cellule infette. Al contrario, l'amplificazione del segnale tyramide ha aumentato la sensibilità di rilevamento del fosfo-MLKL, riducendo così la potenza laser necessaria al 6%La quantificazione dell'immagine Z-stack 3D ha mostrato un aumento di circa 90 volte del numero di voxel positivi per fosfo-MLKL utilizzando l'amplificazione del segnale tyramide, rispetto a un aumento di sette volte utilizzando il metodo standard, indicando una migliore soglia di rilevamento e sensibilità per phospho-MLKL. Simile al virus dell'herpes simplex, l'infezione da virus dell'influenza A ha innescato la necroptosi dipendente da ZBP1.L'amplificazione del segnale Tyramide ha permesso la robusta rilevazione di phospho-RIPK3 e phospho-MLKL, indicando necroptosi. Per interpretare la colorazione confocale, è necessario includere diversi controlli di colorazione. Ciò comporta una condizione non primaria, singole macchie e un controllo positivo.Adattando questo protocollo, è possibile amplificare più target utilizzando TSA sequenziale. Ciò consentirebbe la rilevazione di RIPK3 e MLKL fosforilati all'interno della stessa cella. Il rilevamento sensibile dei biomarcatori della necroptosi può essere utile per la ricerca ZBP1 in corso sull'autoinfiammazione o l'infezione virale in cui le vie di morte cellulare ZBP1-dipendenti eseguite devono ancora essere confermate come necroptosi, apoptosi o piroptosi.

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