Name: tyramide signal amplification for the immunofluorescent staining of zbp1-dependent phosphorylation of ripk3 and mlkl after hsv-1 infection in human cells
Uploaded: 2022-10-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells at J

VIBバイオイメージングコアのトレーニング、サポート、インストゥルメントパークへのアクセスに感謝します。J.N.は、フランダース研究財団(FWO)の博士号フェローシップによってサポートされています。JMグループの研究は、オデュッセウスII助成金(G0H8618N)、EOS INLADIS(40007512)、フランダース研究財団(FWO)からのジュニア研究助成金(G031022N)、CRIG若手研究者の概念実証助成金、およびゲント大学の支援を受けました。P.V.グループの研究は、EOS MODEL-IDI(30826052)、EOS INFLADIS (40007512)、FWOシニア研究助成金(G.0C76.18N、G.0B71.18N、G.0B96.20N、G.0A9322N)、メトサレム(BOF16/MET_V/007)、iBOF20/IBF/039 ATLANTIS、Foundation Against Cancer(F/2016/865、F/2020/1505)、CRIGおよびGIGGコンソーシアム、およびVIBの支援を受けました。

1.ビオチン化チラミドの調製
<ol><li>ビオチン-チラミドから始まるビオチン化チラミドを調製します。10 mMのストック溶液を作るには、3.6 mgのビオチン-チラミドを1 mLのDMSOに溶解します。溶解した製品を-20°Cでアリコートで保存し、品質を維持します。</li>
</ol>2. HT-29細胞の培養液の維持
注:ZBP1発現HT-29は、ヒトZBP1をコードするレ?...

<ol>
	<li>Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+necroptosis+by+post-translational+modifications.">The regulation of necroptosis by post-translational modifications.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).</li><li>Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+necroptotic+cell+death+signaling.">The structural basis of necroptotic cell death signaling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).</li><li>Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis:+The+Trojan+horse+in+cell+autonomous+antiviral+host+defense.">Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense.</a> Virology. 479-480, 160-166 (2015).</li><li>Nailwal, H., Chan, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+in+anti-viral+inflammation.">Necroptosis in anti-viral inflammation.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).</li><li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+RIPK3+maintains+MLKL+in+an+inactive+conformation+prior+to+cell+death+by+necroptosis.">Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis.</a> Nature Communications. 12 (1), 6783 (2021).</li><li>Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location,+location,+location:+A+compartmentalized+view+of+TNF-induced+necroptotic+signaling.">Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling.</a> Science Signalling. 14 (668), (2021).</li><li>Koehler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+E3+prevents+sensing+of+Z-RNA+to+block+ZBP1-dependent+necroptosis.">Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis.</a> Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).</li><li>Balachandran, S., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Z-RNA+triggers+ZBP1-dependent+cell+death.">Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death.</a> Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).</li><li>Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZBP1:+Innate+sensor+regulating+cell+death+and+inflammation.">ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation.</a> Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).</li><li>Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+sensors+and+programmed+cell+death.">Nucleic acid sensors and programmed cell death.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).</li><li>Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+manipulation+of+host+cell+necroptosis+and+pyroptosis.">Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis.</a> Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+suppresses+necroptosis+in+human+cells.">Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+(HSV-1)+and+HSV-2+mediate+species-specific+modulations+of+programmed+necrosis+through+the+viral+ribonucleotide+reductase+large+subunit+R1.">Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1.</a> Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP1/RIP3+binding+to+HSV-1+ICP6+initiates+necroptosis+to+restrict+virus+propagation+in+mice.">RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-independent+contribution+of+ZBP1/DAI/DLM-1-triggered+necroptosis+in+host+defense+against+HSV1.">Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (8), 816 (2018).</li><li>Devos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+of+endogenous+nucleic+acids+by+ZBP1+induces+keratinocyte+necroptosis+and+skin+inflammation.">Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).</li><li>Jiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Z-nucleic-acid+sensing+triggers+ZBP1-dependent+necroptosis+and+inflammation.">Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation.</a> Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).</li><li>de Reuver, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+prevents+autoinflammation+by+suppressing+spontaneous+ZBP1+activation.">ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation.</a> Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).</li><li>Jiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+averts+fatal+type+I+interferon+induction+by+ZBP1.">ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1.</a> Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).</li><li>Hubbard, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+mutation+causes+ZBP1-dependent+immunopathology.">ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology.</a> Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+masks+the+cancer+immunotherapeutic+promise+of+ZBP1-driven+necroptosis.">ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis.</a> Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).</li><li>Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin+amplification+of+biotin+and+horseradish+peroxidase+signals+in+histochemical+stains.">Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).</li><li>Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+DNA+and+mRNA+in+situ+hybridization.">Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization.</a> Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).</li><li>Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+analysis+of+kinase+activity+by+intracellular+flow+cytometry.">Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry.</a> Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).</li><li>Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+mass+spectrometry+(TSA-MS)+ratio+identifies+nuclear+speckle+proteins.">Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).</li><li>Samson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+for+imaging+RIPK1,+RIPK3,+and+MLKL+in+mouse+and+human+cells.">A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells.</a> Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).</li><li>De Groote, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+new+gateway-compatible+inducible+lentiviral+vector+platform+allowing+easy+derivation+of+co-transduced+cells.">Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells.</a> Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).</li><li>Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+ICP6+impedes+TNF+receptor+1-induced+necrosome+assembly+during+compartmentalization+to+detergent-resistant+membrane+vesicles.">Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).</li><li>Mandal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP3+induces+apoptosis+independent+of+pronecrotic+kinase+activity.">RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity.</a> Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+Z-RNAs+induce+ZBP1-mediated+necroptosis.">Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis.</a> Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).</li><li>Garnish, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+interconversion+of+MLKL+and+disengagement+from+RIPK3+precede+cell+death+by+necroptosis.">Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis.</a> Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).</li><li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification.">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedural+requirements+and+recommendations+for+multiplex+immunofluorescence+tyramide+signal+amplification+assays+to+support+translational+oncology+studies.">Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies.</a> Cancers. 12 (2), 255 (2020).</li></ol>

この免疫蛍光染色プロトコルでは、RIPK3およびMLKL26のリン酸化など、検出が困難なヒトネクロトーシスシグナル伝達経路のシグナル伝達イベントの感度を高めるためのチラミドシグナル増幅(TSA)の使用について説明しています。TSAステップを含めることで、p-RIPK3(S227)およびp-MLKL(S358)の検出閾値が大幅に向上し、p-MLKL(S358)ひずみの感度が向上します。TSAは、模擬処理されたサ?...

受容体相互作用セリン/スレオニンプロテインキナーゼ3(RIPK3)および混合系統キナーゼドメイン様(MLKL)は、ネクロトーシス細胞死の中心的な調節因子です1,2。ネクロトーシスは、抗ウイルス免疫と自己炎症に関与する調節された細胞死の溶解性および炎症性形態です。ウイルス感染細胞のネクロトーシスは、ウイルス複製を直ちにシャットダウンします。ネクロトーシス誘導後の細胞溶解は、抗ウイルス免疫を刺激する損傷関連の分子パターンも放出します3,4。ネクロトーシスは、RIPホモタイプ相互作用モチーフ(RHIM)を介した3つの上流活性化分子のうちの1つとのRIPK3の活性化によって開始されます:RIPK1(TNF受容体1[TNFR1]の関与時)、TIRドメイン含有アダプター誘導インターフェロンβ(TRIF;Toll様受容体3および4の関与時)、または抗ウイルス核酸センサーZ-DNA結合タンパク質1(ZBP1)1,2。.ネクロトーシスシグナル伝達は、RIPK3の自己リン酸化から始まる一連のリン酸化イベントを通じて進行します。キナーゼドメイン内のセリン(S)227でのヒトRIPK3の自己リン酸化は、MLKLとの相互作用を可能にすることによるネクロトーシスの前提条件であり、ヒトRIPK3活性化およびネクロトーシス細胞死の生化学的マーカーとして一般的に使用されています1,5。活性化されると、RIPK3はスレオニン(T)357およびS3581でMLKLの活性化ループをリン酸化します。これにより、MLKL立体構造が変化し、N末端4ヘリックスバンドルドメインが露出します。その後、MLKLはオリゴマー化して細胞膜に輸送し、脂質二重層に露出した4つのらせん束を挿入することで細孔を形成し、最終的に細胞死につながります2,6。
ZBP1は、Z立体構造中の二本鎖RNA(Z-RNA)を含む左巻きのZ型核酸を認識する抗ウイルス核酸センサーです。Z-RNA結合は、ZBP1のN末端に位置する2つのZαドメインを介して起こる。RNAおよびDNAウイルス感染中に蓄積するZ-RNAは、ZBP1 7,8に直接関与すると考えられている。活性化されたZBP1は、その中央RHIMを介してRIPK3をリクルートし、ネクロトーシスを含む調節された細胞死を誘導します9,10。ウイルスは、ZBP1誘導宿主細胞ネクロトーシスに対抗するために、数多くのエスケープメカニズムを採用しています11。例えば、単純ヘルペスウイルス1(HSV-1)リボヌクレオチドレダクターゼサブユニット1は、ICP6として知られ、UL39によってコードされ、そのN末端にRIMを有し、ヒト細胞におけるZBP1媒介RIPK3活性化を妨害する12,13,14,15。ZBP1はウイルス複製を制限するだけでなく、マウス研究はZBP1活性化が炎症性疾患を引き起こし、癌免疫を刺激することを示しています16、17、18、19、20、21。したがって、ヒト細胞におけるZBP1誘発ネクロトーシス中に発生するシグナル伝達イベントを検出するプロトコルは、これらのプロセスにおけるZBP1の役割を評価するために価値があります。
チラミドシグナル増幅(TSA)は、触媒レポーターデポジション(CARD)とも呼ばれ、抗体ベースのイムノアッセイにおける検出限界とS/N比を改善するために開発されました。TSAの際には、任意の一次抗体を使用して目的の抗原を検出することができます。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)は、二次抗体と結合し、過酸化水素の存在下でビオチン化チラミドラジカルの局所的な蓄積を触媒します。これらの活性化されたビオチン-チラミドラジカルは、近位チロシン残基と反応して共有結合を形成します。潜在的なチラミド-ビオチン基質には、抗原自体、一次抗体と二次抗体、および隣接タンパク質が含まれます。したがって、TSAはアッセイの感度を有意に向上させるが、その空間分解能の一部は失われる。最終ステップでは、蛍光標識ストレプトアビジンを使用してビオチン分子を検出します。HRP反応は、目的の抗原上または抗原の近くに多くのチラミド-ビオチン分子を沈着させます。これにより、ストレプトアビジン-蛍光色素結合部位の数が大幅に増加し、アッセイの感度が大幅に増幅されます(図1)。あるいは、チラミドを蛍光色素に直接結合させることができるため、ストレプトアビジン共役蛍光色素が不要になります。タンパク質免疫組織化学とDNA/RNAin situハイブリダイゼーションは、TSAがシグナル強度を改善するために採用された最初の方法の1つでした22,23。最近では、TSAは細胞内フローサイトメトリー24および質量分析25と組み合わされています。
ここでは、免疫蛍光顕微鏡を用いて、HSV-1感染によるZBP1の活性化時にセリン227リン酸化ヒトRIPK3(p-RIPK3[S227])およびリン酸化ヒトMLKL(p-MLKL [S358])を検出するためのプロトコルを提示する。ヒトZBP1を安定発現するように形質導入したネクロプトーシス感受性HT-29ヒト大腸腺癌細胞株を使用します。これらの細胞は、ウイルスRHIM(VQCG)内の4つのコアアミノ酸がアラニン(AAAA)に置換された変異ICP6タンパク質(HSV-1 ICP6mutRHIM)を発現するHSV-1株に感染し、それによってICP6がZBP1を介したネクロトーシスをブロックできないようにしました13,14,15。免疫染色26において、現在市販されているp-RIPK3およびp-MLKLに対する抗体のシグナル対ノイズ比が低いという問題を克服するために、チラミドシグナル増幅(TSA)ステップ(図1)を実行し、その結果、ヒトp-RIPK3の検出がロバストになり(S227)、ヒトp-MLKL(S358)の検出感度が桁違いに向上します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP</td>
			<td>Agilent Technologies Belgium</td>
			<td>K4002</td>
			<td>Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse DyLight 633</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>35513</td>
			<td>Secundary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 ICP0</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53070</td>
			<td>Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV-PR8 mouse serum</td>
			<td>In house production</td>
			<td>xx</td>
			<td>Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMLKL</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab187091</td>
			<td>Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRIPK3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab209384</td>
			<td>Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophores</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D21490</td>
			<td>To visualise the nucleus of the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>S11226</td>
			<td>To visulalise biotin molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compounds</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Oxidising substrate, necessary for HRP activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>SANBIO</td>
			<td>AR1068</td>
			<td>To fix/crosslink the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinyl-tyramide</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6241</td>
			<td>To amplify signal, HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV-6</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7597</td>
			<td>BV6 IAP Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>For cell culture: to detach the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>8.0 g/L NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.4 g/L disodium salt of EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.04%</td>
			<td>In house formulation</td>
			<td></td>
			<td>1.1 g/L Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>TICO</td>
			<td>FBS EU XXX</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSK&#39;840</td>
			<td>Aobious</td>
			<td>AOB0917</td>
			<td>RIPK3 kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10444402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td>In house production</td>
			<td>-</td>
			<td>Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td>To permeabilise the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11732</td>
			<td>For cell counting, used as live/dead marker at 0,1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4424</td>
			<td>For cell culture: to detach the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zVAD</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>BACE4026865.0005</td>
			<td>Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 well high glass bottom</td>
			<td>iBidi</td>
			<td>80807</td>
			<td>To culture the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Preping Balls-size medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71001-10</td>
			<td>To clean the objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518 F / 30 &#176;C</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>444970-9000-000</td>
			<td>To visualise the sample at high magnifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaner</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>000000-0105-200</td>
			<td>To clean the objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM880 Fast Airyscan confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To visualise the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Office</td>
			<td>xx</td>
			<td>To process the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>xx</td>
			<td>To analyse the data- statistical testing and graph generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Volocity</td>
			<td>xx</td>
			<td>To perform quantifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen black</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>xx</td>
			<td>To aquire and process images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen blue</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>xx</td>
			<td>To visualise images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viruses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 (mutRHIM) F strain</td>
			<td>produced by&#160; Dr. Jiahuai Han</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG&#62;AAAA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 (WT) F strain</td>
			<td>Produced by Dr. Jiahuai Han</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV PR8</td>
			<td>in house stock</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>IAV as a trigger for necroptosis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tyramide signal amplification for the immunofluorescent staining of zbp1-dependent phosphorylation of ripk3 and mlkl after hsv-1 infection in human cells

キナーゼ受容体相互作用セリン/スレオニンプロテインキナーゼ3(RIPK3)およびその基質混合系統キナーゼドメイン様(MLKL)は、重要な抗ウイルス機能を備えた炎症性細胞死型であるネクロプトーシスの重要な調節因子です。RIPK3の自己リン酸化は、ネクロトーシスMLKLの細孔形成実行タンパク質のリン酸化および活性化を誘導する。細胞膜でのリン酸化MLKLのトラフィッキングとオリゴマー化は、ネクロトーシス細胞死の特徴である細胞溶解をもたらします。核酸センサーZBP1は、RNAおよびDNAウイルスに感染した後、左巻きZ型二本鎖RNA(Z-RNA)に結合することによって活性化されます。ZBP1活性化は、感染した宿主細胞のネクロプトーシスを含む調節された細胞死を誘導することにより、ウイルス感染を制限します。免疫蛍光顕微鏡法は、ZBP1を介したネクロトーシスの下流にあるさまざまなシグナル伝達ステップを細胞ごとに視覚化することができます。しかしながら、ヒトRIPK3およびMLKLに対する現在市販のホスホ特異的抗体を用いた標準的な蛍光顕微鏡の感度は、これらのマーカーの再現可能なイメージングを妨げる。ここでは、単純ヘルペスウイルス1(HSV-1)に感染したヒトHT-29細胞におけるセリン(S)リン酸化RIPK3(S227)およびMLKL(S358)の最適化された染色手順について説明します。免疫蛍光染色プロトコルにチラミドシグナル増幅(TSA)ステップを含めることで、S227リン酸化RIPK3の特異的検出が可能になります。さらに、TSAはS358リン酸化MLKLの検出感度を大幅に向上させます。一緒に、この方法は、ZBP1誘発ネクロプトーシスの誘導中のこれら2つの重要なシグナル伝達イベントの視覚化を可能にします。

ヒト細胞におけるMLKLリン酸化、特にRIPK3リン酸化の免疫蛍光検出は技術的に困難です26。ここでは、ZBP1の活性化時のヒトp-RIPK3(S227)およびp-MLKL(S358)の染色プロトコルの改善を紹介します。このプロトコルには、蛍光シグナルの検出限界と感度を改善するためのTSAステップが含まれています。この方法を検証するために、TSAを介した免疫蛍光とp-RIPK3(S227)およびp-MLKL(S358)の両方?...

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Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells

免疫蛍光染色中のチラミドシグナル増幅により、HSV-1感染後のZBP1誘発ネクロトーシス中のリン酸化RIPK3およびMLKLの高感度検出が可能になります。

ヒト細胞におけるHSV-1感染後のRIPK3およびMLKLのZBP1依存性リン酸化の免疫蛍光染色のためのチラミドシグナル増幅

The kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) and its substrate mixed lineage kinase domain-like (MLKL) are critical ...

ネクロトーシス誘導中の2つの重要なシグナル伝達イベントであるリン酸化RIPK3とMLKLの堅牢な視覚化は、技術的に困難でした。提示されたチラミド増幅プロトコルは、これら2つの分子の高感度検出を可能にする。シグナル増幅ステップは検出閾値を下げ、リン酸化RIPK3およびMLKLの堅牢で再現性のある検出を可能にします。90, 000個のZBP1発現HT-29細胞を、1センチメートル四方の表面積ウェルプレートに全強度マッコイの5A培地に播種し始め、ハイエンドの顕微鏡観察を可能にします。ウェルあたり200マイクロリットルのエンドボリュームを使用してください。細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素で一晩インキュベートします。細胞が70〜80%コンフルエントに達したら、単純ヘルペスウイルス1を含む200マイクロリットルの予熱された全強度マッコイの5A培地で細胞に感染し、5の感染の多重度でリム変異体ICP6をコードする。細胞をウイルスと一緒に9時間インキュベートして、ネクロプトーシスを誘発します。ネクロトーシス誘導のポジティブコントロールとして、200マイクロリットルの予熱ネクロプトーシス誘発カクテルで細胞を4時間刺激します。陰性対照として、摂氏37度に予熱した10マイクロモルのGSK22マイクロリットルGSK3を加えて、RIPK3キナーゼ活性を阻害します。セリン227の自己リン酸化を防ぐために、未処理の状態およびネクロトーシス刺激後にこの阻害剤を含める。細胞を固定するには、培地を取り除き、200マイクロリットルのPBSで細胞を洗浄します。次にPBSを取り出し、室温で平衡化した150マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドを加えます。細胞を室温で30分間インキュベートします。固定後、4%パラホルムアルデヒドを除去し、200マイクロリットルのPBSで細胞を3回洗浄する。サンプルは、さらに処理されるまで、摂氏4度で一晩PBSを超えて保存できます。プレートからPBSを取り出し、細胞を100マイクロリットルの透過バッファーとともに室温で傾斜ラボシェーカー上で30分間インキュベートします。インキュベーション後、透過処理バッファーを除去し、100マイクロリットルの洗浄バッファーで細胞を洗浄します。イメージングチャンバーを洗浄バッファーとともに、傾斜ラボシェーカーで室温で5分間インキュベートします。一次抗体の非特異的結合を防ぐために、プレートを100マイクロリットルのブロッキング媒体とともに室温で2時間、傾斜ラボシェーカーでインキュベートします。次に、ウェルを100マイクロリットルの洗浄バッファーで3回洗浄し、傾斜実験室用シェーカー上で室温で5分間インキュベートします。洗浄バッファーを除去した後、100マイクロリットルの一次抗体をイメージングチャンバーに加えます。チラミドシグナル増幅の潜在的なバックグラウンドを視覚化し、マスキング閾値を設定するために、一次抗体なし条件を必ず含めてください。チャンバーを摂氏4度で一晩インキュベートします。一次抗体ミックスを除去し、ウェルを100マイクロリットルの洗浄バッファーで3回洗浄し、傾斜ラボシェーカー上で室温で5分間インキュベートします。洗浄バッファーを除去した後、100マイクロリットルのHRP標識二次抗体と共に細胞をインキュベートし、増幅される一次抗体の種を認識し、傾斜ラボシェーカー上で30分間インキュベートする。抗体インキュベーション中に、ビオチン化チラミドミックスを調製します。HRPの酵素活性を誘発するには、使用前に新たに酸化基質をTSAバッファーに加えます。次に、最適化された希釈を使用して、調製したTSAバッファーでビオチン化チラミドを希釈します。HRP標識二次抗体でインキュベートした後、ウェルを洗浄バッファーで3回洗浄し、傾斜ラボ用シェーカーで5分間インキュベートします。ウェルから洗浄バッファーを除去した後、希釈したビオチン-チラミドをウェルに添加して、終末容量を100マイクロリットルにします。室温で10分間傾斜した実験用シェーカーで反応をインキュベートし、続いて洗浄バッファー洗浄を3回行います。二次抗体、結合ストレプトアビジン、核染色剤および洗浄バッファーを含む染色ミックスを調製します。洗浄バッファーを除去し、プレートを100マイクロリットルの染色ミックスとともに室温で傾斜ラボシェーカーで1時間インキュベートします。このステップ以降、イメージングチャンバーを光から遮蔽してください。染色後、洗浄バッファーで2回連続して洗浄し、ウェルをPBSで2回すすぐ。PBSを超えるサンプルを摂氏4度で保存し、イメージングまで染色を保持します。これで、イメージングチャンバーを共焦点顕微鏡で視覚化する準備が整いました。チラミドシグナル増幅を含めることで、リム変異型ICP6感染細胞をコードする単純ヘルペスウイルス1の細胞質ゾル中のセリン227でリン酸化されたRIPK3の堅牢な検出が可能になりました。高感度検出には2%のレーザー出力で十分でした。標準的な間接免疫蛍光法では、より高いレーザー出力はホスホ-RIPK3の検出には不十分でした。3次元Zスタック画像の定量化において、感染細胞は、模擬処理された細胞よりもリン酸化RIPK3陽性のボクセルの約20倍の増加を示した。模擬処理細胞と比較して野生型単純ヘルペスウイルス1感染細胞のホスホRIPK3染色の増加は、ICP6のリムドメインがセリン227でのRIPK3リン酸化を完全にブロックできないことを示しました。GSK840はRIPK3のキナーゼドメインに結合し、ZBP1活性化時にセリン227でのRIPK3リン酸化を防止し、チラミドシグナル増幅媒介ホスホRIPK3検出法の特異性を確認した。模擬処理した細胞は、セリン358でのMLKLリン酸化のわずかに中断された細胞質染色で低値を示しましたが、感染細胞の細胞質ゾル、核、および原形質膜で強い染色が検出されました。標準的な間接免疫蛍光法では、感染細胞におけるホスホMLKLシグナルを特異的に検出するために40%のレーザー出力が必要でした。対照的に、チラミド信号増幅はホスホMLKLの検出感度を増加させ、それによって必要なレーザー出力を6%3D Zスタック画像定量に低下させ、チラミドシグナル増幅を使用した場合と比較して、ホスホMLKL陽性のボクセル数が約90倍増加し、標準法を使用した場合と比較して、ホスホMLKLの検出閾値と感度が向上したことを示しています。単純ヘルペスウイルス1と同様に、インフルエンザAウイルス感染はZBP1依存性ネクロプトーシスを引き起こしました。チラミドシグナル増幅により、ホスホ-RIPK3およびホスホ-MLKLの堅牢な検出が可能になり、ネクロプトーシスを示しました。共焦点染色を解釈するには、いくつかの染色コントロールを含める必要があります。これには、一次状態なし、単一の汚れ、およびポジティブコントロールが必要です。このプロトコルを適応させることにより、シーケンシャルTSAを使用して複数のターゲットを増幅することができます。これにより、同じ細胞内でリン酸化されたRIPK3とMLKLの検出が可能になります。ネクロトーシスバイオマーカーの高感度検出は、実行されたZBP1依存性細胞死経路がネクロプトーシス、アポトーシス、またはパイロトーシスのいずれかとして確認される必要がある自己炎症またはウイルス感染に関する進行中のZBP1研究にとって洞察に満ちたものです。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Alloantigen-specific Anergy in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells by Alloantigen Stimulation with Co-stimulatory Signal Blockade

共刺激シグナル遮断によるアロ抗原刺激によるヒト末梢血単核球のアロ抗原特異的アネルギーの誘導

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) offers the best chance of cure for many patients with congenital and acquired hematologic ...

免疫・感染学

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

の選択熱帯熱マラリア原虫</em人間の脳内皮細胞へのCytoadhesion用>寄生虫

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

細胞運命を以下に<em&gt; E大腸菌の</emラムダファージによる感染後&gt;

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

過ヨウ素酸シッフ染色で末梢血単核細胞中のグリコーゲンの検出

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

の検出のための凍結乾燥LAMP法試薬の開発<em&gt; Q熱リケッチア</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

細胞毒性の評価と肺癌精密カット スライスで物質の免疫調節効果

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue

共同血管や脂肪組織における神経線維を染色

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

一定の流れの原発性ヒト内皮細胞の肺炎球菌感染

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...