Name: tyramide signal amplification for the immunofluorescent staining of zbp1-dependent phosphorylation of ripk3 and mlkl after hsv-1 infection in human cells
Uploaded: 2022-10-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells at J

Gostaríamos de agradecer ao VIB Bioimaging Core pelo treinamento, suporte e acesso ao parque de instrumentos. J.N. é apoiado por uma bolsa de doutoramento da Fundação de Investigação Flandres (FWO). A investigação no grupo J.M. foi apoiada por uma bolsa Odysseus II (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), uma bolsa de investigação júnior (G031022N) da Fundação de Investigação da Flandres (FWO), uma bolsa de prova de conceito para jovens investigadores do CRIG e pela Universidade de Ghent. A investigação no grupo P.V. foi apoiada por EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), consórcios CRIG e GIGG e VIB.

1. Preparação de tiramida biotinilada
<ol><li>Preparar tiramida biotinilada a partir de biotina-tiramida. Para fazer uma solução-mãe de 10 mM, dissolver 3,6 mg de biotina-tiramida em 1 mL de DMSO. Conservar o produto dissolvido em alíquotas a -20 °C para preservar a qualidade.</li>
</ol>2. Manutenção das células HT-29 em cultura
NOTA: Os HT-29 que expressam ZBP1 foram gerados por transdução com um lentivetor<sup class="xref"...

<ol>
	<li>Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+necroptosis+by+post-translational+modifications.">The regulation of necroptosis by post-translational modifications.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).</li><li>Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+necroptotic+cell+death+signaling.">The structural basis of necroptotic cell death signaling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).</li><li>Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis:+The+Trojan+horse+in+cell+autonomous+antiviral+host+defense.">Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense.</a> Virology. 479-480, 160-166 (2015).</li><li>Nailwal, H., Chan, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+in+anti-viral+inflammation.">Necroptosis in anti-viral inflammation.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).</li><li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+RIPK3+maintains+MLKL+in+an+inactive+conformation+prior+to+cell+death+by+necroptosis.">Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis.</a> Nature Communications. 12 (1), 6783 (2021).</li><li>Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location,+location,+location:+A+compartmentalized+view+of+TNF-induced+necroptotic+signaling.">Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling.</a> Science Signalling. 14 (668), (2021).</li><li>Koehler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+E3+prevents+sensing+of+Z-RNA+to+block+ZBP1-dependent+necroptosis.">Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis.</a> Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).</li><li>Balachandran, S., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Z-RNA+triggers+ZBP1-dependent+cell+death.">Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death.</a> Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).</li><li>Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZBP1:+Innate+sensor+regulating+cell+death+and+inflammation.">ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation.</a> Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).</li><li>Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+sensors+and+programmed+cell+death.">Nucleic acid sensors and programmed cell death.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).</li><li>Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+manipulation+of+host+cell+necroptosis+and+pyroptosis.">Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis.</a> Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+suppresses+necroptosis+in+human+cells.">Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+(HSV-1)+and+HSV-2+mediate+species-specific+modulations+of+programmed+necrosis+through+the+viral+ribonucleotide+reductase+large+subunit+R1.">Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1.</a> Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP1/RIP3+binding+to+HSV-1+ICP6+initiates+necroptosis+to+restrict+virus+propagation+in+mice.">RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-independent+contribution+of+ZBP1/DAI/DLM-1-triggered+necroptosis+in+host+defense+against+HSV1.">Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (8), 816 (2018).</li><li>Devos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+of+endogenous+nucleic+acids+by+ZBP1+induces+keratinocyte+necroptosis+and+skin+inflammation.">Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).</li><li>Jiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Z-nucleic-acid+sensing+triggers+ZBP1-dependent+necroptosis+and+inflammation.">Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation.</a> Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).</li><li>de Reuver, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+prevents+autoinflammation+by+suppressing+spontaneous+ZBP1+activation.">ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation.</a> Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).</li><li>Jiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+averts+fatal+type+I+interferon+induction+by+ZBP1.">ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1.</a> Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).</li><li>Hubbard, N. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin+amplification+of+biotin+and+horseradish+peroxidase+signals+in+histochemical+stains.">Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).</li><li>Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+DNA+and+mRNA+in+situ+hybridization.">Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization.</a> Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).</li><li>Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+analysis+of+kinase+activity+by+intracellular+flow+cytometry.">Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry.</a> Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).</li><li>Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+mass+spectrometry+(TSA-MS)+ratio+identifies+nuclear+speckle+proteins.">Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).</li><li>Samson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+for+imaging+RIPK1,+RIPK3,+and+MLKL+in+mouse+and+human+cells.">A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells.</a> Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).</li><li>De Groote, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+new+gateway-compatible+inducible+lentiviral+vector+platform+allowing+easy+derivation+of+co-transduced+cells.">Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells.</a> Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).</li><li>Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+ICP6+impedes+TNF+receptor+1-induced+necrosome+assembly+during+compartmentalization+to+detergent-resistant+membrane+vesicles.">Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).</li><li>Mandal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP3+induces+apoptosis+independent+of+pronecrotic+kinase+activity.">RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity.</a> Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+Z-RNAs+induce+ZBP1-mediated+necroptosis.">Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis.</a> Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).</li><li>Garnish, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+interconversion+of+MLKL+and+disengagement+from+RIPK3+precede+cell+death+by+necroptosis.">Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis.</a> Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).</li><li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification.">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedural+requirements+and+recommendations+for+multiplex+immunofluorescence+tyramide+signal+amplification+assays+to+support+translational+oncology+studies.">Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies.</a> Cancers. 12 (2), 255 (2020).</li></ol>

Este protocolo de coloração imunofluorescente descreve o uso de amplificação de sinal de tiramida (TSA) para aumentar a sensibilidade para eventos de sinalização da via de sinalização necroptótica humana que são difíceis de detectar, incluindo a fosforilação de RIPK3 e MLKL26. A inclusão de uma etapa TSA melhora significativamente o limiar de detecção de p-RIPK3 (S227) e p-MLKL (S358) e aumenta a sensibilidade do esforço p-MLKL (S358). A TSA revelou um sinal p-RIPK3 (S227) já pre...

A serina/treonina proteína quinase 3 (RIPK3) e a quinase de linhagem mista (MLKL) são reguladores centrais da morte celular necroptótica 1,2. A necroptose é uma forma lítica e inflamatória de morte celular regulada envolvida na imunidade antiviral e na autoinflamação. A necroptose de células infectadas por vírus interrompe imediatamente a replicação do vírus. A lise celular após a indução da necroptose também libera padrões moleculares associados a danos, que estimulam a imunidade antiviral 3,4. A necroptose é iniciada pela ativação da RIPK3 após interações mediadas por motivo de interação homotípica RIP (RHIM) com uma das três moléculas ativadoras a montante: RIPK1 (no engajamento do receptor de TNF 1 [TNFR1]), β de interferon indutor de adaptador contendo domínio TIR (TRIF; no engajamento do receptor Toll-like 3 e 4), ou o sensor de ácido nucleico antiviral Z-DNA binding protein 1 (ZBP1)1,2 . A sinalização da necroptose prossegue através de uma série de eventos de fosforilação começando com a autofosforilação do RIPK3. A autofosforilação da RIPK3 humana na serina (S)227 dentro de seu domínio da quinase é um pré-requisito para a necroptose, permitindo a interação com a MLKL e é comumente usada como marcador bioquímico para ativação da RIPK3 humana e morte celular necroptótica 1,5. Uma vez ativado, o RIPK3 fosforila o loop de ativação do MLKL na treonina (T)357 e S3581. Isso causa uma mudança na conformação do MLKL, resultando na exposição do domínio do feixe de quatro hélices N-terminal. O MLKL então oligomeriza e trafega para a membrana celular, onde forma um poro através da inserção dos quatro feixes de hélices expostos na bicamada lipídica, levando eventualmente à morte celular 2,6.
ZBP1 é um sensor de ácido nucleico antiviral que reconhece ácidos nucleicos canhotos da forma Z, incluindo RNA de fita dupla na conformação Z (Z-RNA). A ligação do Z-RNA ocorre através de dois domínios Zα posicionados no terminal N do ZBP1. Acredita-se que o Z-RNA que se acumula durante a infecção por vírus de RNA e DNA envolva diretamente o ZBP1 7,8. O ZBP1 ativado recruta RIPK3 através de seus RHIMs centrais e induz a morte celular regulada, incluindo necroptose 9,10. Os vírus adotaram inúmeros mecanismos de escape para neutralizar a necroptose de células hospedeiras induzida porZBP11 11. Por exemplo, a subunidade 1 da ribonucleotídeo redutase do vírus herpes simplex 1 (HSV-1), conhecida como ICP6 e codificada pelo UL39, abriga o RHIM em seu N-terminal que interfere na ativação do RIPK3 mediado por ZBP1 em células humanas12,13,14,15. O ZBP1 não apenas restringe a replicação viral, mas estudos em camundongos mostraram que a ativação do ZBP1 causa doenças inflamatórias e estimula a imunidade ao câncer 16,17,18,19,20,21. Protocolos que detectam eventos de sinalização que ocorrem durante a necroptose induzida por ZBP1 em células humanas são, portanto, valiosos para avaliar o papel do ZBP1 nesses processos.
A amplificação de sinal de tiramida (TSA), também conhecida como deposição catalisada de repórter (CARD), foi desenvolvida para melhorar o limite de detecção e a relação sinal-ruído em imunoensaios baseados em anticorpos. Durante a TSA, qualquer anticorpo primário pode ser usado para detectar o antígeno de interesse. A peroxidase de rábano (HRP), acoplada a um anticorpo secundário, catalisa o acúmulo local de radicais de tiramida biotinilados na presença de peróxido de hidrogênio. Esses radicais de biotina-tiramida ativados então reagem com resíduos proximais de tirosina para formar ligações covalentes. Potenciais substratos de tiramida-biotina incluem o próprio antígeno, os anticorpos primários e secundários e proteínas vizinhas. Assim, enquanto a TSA melhora significativamente a sensibilidade do ensaio, parte de sua resolução espacial é perdida. Em uma etapa final, as moléculas de biotina são detectadas usando treptavidina marcada fluorescentemente. A reação HRP deposita muitas moléculas de tiramida-biotina sobre ou perto do antígeno de interesse. Isso aumenta muito o número de sítios de ligação treptavidina-fluorocromo, ampliando consideravelmente a sensibilidade do ensaio (Figura 1). Alternativamente, a tiraamida pode ser diretamente acoplada a um fluorocromo, eliminando a necessidade de fluoróforos acoplados à estreptavidina. A imuno-histoquímica proteica e a hibridização in situ DNA/RNA estavam entre os primeiros métodos pelos quais a ATS foi empregada para melhorar as intensidades de sinal22,23. Mais recentemente, a AST tem sido combinada com citometria de fluxo intracelular24 e espectrometria de massas25.
Aqui, apresentamos um protocolo para detectar serina 227 RIPK3 humana fosforilada (p-RIPK3 [S227]) e MLKL humana fosforilada (p-MLKL [S358]) após a ativação de ZBP1 por infecção por HSV-1 usando microscopia de imunofluorescência. Usamos uma linhagem celular de adenocarcinoma colorretal humano HT-29 sensível à necroptose que foi transduzida para expressar de forma estável a ZBP1 humana. Essas células foram infectadas com uma cepa de HSV-1 expressando uma proteína ICP6 mutante (HSV-1 ICP6mutRHIM) na qual quatro aminoácidos centrais dentro da IHMI viral (VQCG) foram substituídos por alaninas (AAAA), tornando a ICP6 incapaz de bloquear a necroptose mediada porZBP1 13,14,15. Para superar o problema da baixa relação sinal-ruído dos anticorpos atualmente disponíveis comercialmente dirigidos contra p-RIPK3 e p-MLKL na imunocoloração26, realizamos uma etapa de amplificação de sinal de tiramida (TSA) (Figura 1), que resulta na detecção robusta de p-RIPK3 humano (S227) e melhora a sensibilidade de detecção de p-MLKL humano (S358) em uma ordem de magnitude.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP</td>
			<td>Agilent Technologies Belgium</td>
			<td>K4002</td>
			<td>Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse DyLight 633</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>35513</td>
			<td>Secundary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 ICP0</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53070</td>
			<td>Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV-PR8 mouse serum</td>
			<td>In house production</td>
			<td>xx</td>
			<td>Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMLKL</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab187091</td>
			<td>Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRIPK3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab209384</td>
			<td>Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophores</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D21490</td>
			<td>To visualise the nucleus of the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>S11226</td>
			<td>To visulalise biotin molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compounds</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Oxidising substrate, necessary for HRP activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>SANBIO</td>
			<td>AR1068</td>
			<td>To fix/crosslink the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinyl-tyramide</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6241</td>
			<td>To amplify signal, HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV-6</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7597</td>
			<td>BV6 IAP Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>For cell culture: to detach the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>8.0 g/L NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.4 g/L disodium salt of EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.04%</td>
			<td>In house formulation</td>
			<td></td>
			<td>1.1 g/L Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>TICO</td>
			<td>FBS EU XXX</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSK&#39;840</td>
			<td>Aobious</td>
			<td>AOB0917</td>
			<td>RIPK3 kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10444402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td>In house production</td>
			<td>-</td>
			<td>Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td>To permeabilise the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11732</td>
			<td>For cell counting, used as live/dead marker at 0,1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4424</td>
			<td>For cell culture: to detach the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zVAD</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>BACE4026865.0005</td>
			<td>Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 well high glass bottom</td>
			<td>iBidi</td>
			<td>80807</td>
			<td>To culture the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Preping Balls-size medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71001-10</td>
			<td>To clean the objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518 F / 30 &#176;C</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>444970-9000-000</td>
			<td>To visualise the sample at high magnifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaner</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>000000-0105-200</td>
			<td>To clean the objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM880 Fast Airyscan confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To visualise the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Office</td>
			<td>xx</td>
			<td>To process the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>xx</td>
			<td>To analyse the data- statistical testing and graph generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Volocity</td>
			<td>xx</td>
			<td>To perform quantifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen black</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>xx</td>
			<td>To aquire and process images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen blue</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>xx</td>
			<td>To visualise images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viruses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 (mutRHIM) F strain</td>
			<td>produced by&#160; Dr. Jiahuai Han</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG&#62;AAAA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 (WT) F strain</td>
			<td>Produced by Dr. Jiahuai Han</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV PR8</td>
			<td>in house stock</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>IAV as a trigger for necroptosis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tyramide signal amplification for the immunofluorescent staining of zbp1-dependent phosphorylation of ripk3 and mlkl after hsv-1 infection in human cells

A proteína quinase 3 (RIPK3) e sua linhagem mista quinase quinase (MLKL) são reguladores críticos da necroptose, uma forma inflamatória de morte celular com importantes funções antivirais. A autofosforilação do RIPK3 induz a fosforilação e a ativação da proteína executora formadora de poros da necroptose MLKL. O tráfico e a oligomerização da MLKL fosforilada na membrana celular resultam em lise celular, característica da morte celular necroptótica. O sensor de ácido nucleico ZBP1 é ativado ligando-se ao RNA DE FITA DUPLA (Z-RNA) da forma Z canhoto após a infecção por vírus de RNA e DNA. A ativação do ZBP1 restringe a infecção pelo vírus, induzindo a morte celular regulada, incluindo necroptose, de células hospedeiras infectadas. A microscopia de imunofluorescência permite a visualização de diferentes etapas de sinalização a jusante da necroptose mediada por ZBP1 por célula. No entanto, a sensibilidade da microscopia de fluorescência padrão, usando anticorpos fosfo-específicos atualmente disponíveis comercialmente contra RIPK3 e MLKL humanos, impede a imagem reprodutível desses marcadores. Aqui, descrevemos um procedimento de coloração otimizado para serina (S) fosforilada RIPK3 (S227) e MLKL (S358) em células HT-29 humanas infectadas com o vírus herpes simplex 1 (HSV-1). A inclusão de uma etapa de amplificação de sinal de tiramida (TSA) no protocolo de coloração imunofluorescente permite a detecção específica de RIPK3 fosforilado S227. Além disso, a TSA aumenta muito a sensibilidade da detecção de MLKL fosforilado S358. Juntos, esse método permite a visualização desses dois eventos críticos de sinalização durante a indução da necroptose induzida por ZBP1.

A detecção imunofluorescente da fosforilação MLKL e, especialmente, da fosforilação RIPK3 em células humanas é tecnicamente desafiadora26. Apresentamos aqui um protocolo de coloração melhorado para p-RIPK3 humano (S227) e p-MLKL (S358) após a ativação do ZBP1. O protocolo inclui uma etapa da TSA para melhorar o limite de detecção e a sensibilidade dos sinais fluorescentes. Para validar o método, foi realizada uma comparação lado a lado da imunofluorescência mediada pela TSA com ...

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Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells

A amplificação do sinal de tiramida durante a coloração imunofluorescente permite a detecção sensível de RIPK3 fosforilado e MLKL durante necroptose induzida por ZBP1 após infecção por HSV-1.

Amplificação do Sinal de Tiramida para a Coloração Imunofluorescente da Fosforilação Dependente de ZBP1 de RIPK3 e MLKL Após Infecção por HSV-1 em Células Humanas

The kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) and its substrate mixed lineage kinase domain-like (MLKL) are critical ...

A visualização robusta de RIPK3 e MLKL fosforilados, dois eventos-chave de sinalização durante a indução da necroptose, tem sido tecnicamente desafiadora. O protocolo de amplificação de tiramida apresentado permite a detecção sensível dessas duas moléculas. A etapa de amplificação do sinal reduz o limiar de detecção, permitindo a detecção robusta e reprodutível de RIPK3 e MLKL fosforilados.Comece a semear as 90.000 células HT-29 que expressam ZBP1 no meio 5A de McCoy de força total em uma placa de poço de área de superfície quadrada de um centímetro, permitindo microscopia de ponta. Use um volume final de 200 microlitros por poço. Incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5%.Uma vez que as células atinjam 70 a 80% de confluência, infecte as células em 200 microlitros pré-aquecidos, meio McCoy's 5A de força total contendo o vírus herpes simplex um, codificando uma ICP6 mutante de borda a uma multiplicidade de infecção de cinco. Incubar as células com o vírus por nove horas para induzir necroptose. Como controle positivo para a indução de necroptose, estimular as células por quatro horas com 200 microlitros de coquetel indutor de necroptose pré-aquecido.Como controle negativo, adicione 22 microlitros de 10 micromolares GSK840 pré-aquecidos a 37 graus Celsius para inibir a atividade da quinase RIPK3. Incluir este inibidor em uma condição não tratada e após estimulação da necroptose para evitar a autofosforilação da serina 227. Para fixar as células, retire o meio e lave as células com 200 microlitros de PBS.Em seguida, retire o PBS e adicione 150 microlitros de paraformaldeído a 4% equilibrado à temperatura ambiente. Incubar as células à temperatura ambiente durante 30 minutos. Após a fixação, retire o paraformaldeído a 4% e lave as células três vezes com 200 microlitros de PBS.As amostras podem ser armazenadas em excesso de PBS a quatro graus Celsius durante a noite até processamento adicional. Remova o PBS da placa e incube as células com 100 microlitros de tampão de permeação à temperatura ambiente por 30 minutos em um agitador de laboratório inclinado. Após a incubação, remova o tampão de permeabilização e lave as células com 100 microlitros de tampão de lavagem.Incubar a câmara de imagem com tampão de lavagem durante cinco minutos à temperatura ambiente num agitador de laboratório inclinado. Para evitar a ligação inespecífica de anticorpos primários, incubar a placa com 100 microlitros de meio bloqueador à temperatura ambiente por duas horas em um agitador de laboratório inclinado. Em seguida, lave os poços três vezes com 100 microlitros de tampão de lavagem com cinco minutos de incubação à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado.Depois de remover o tampão de lavagem, adicione 100 microlitros dos anticorpos primários à câmara de imagem. Certifique-se de incluir uma condição de anticorpo não primária para visualizar o fundo potencial da amplificação do sinal de tiramida e definir o limiar de mascaramento. Incubar a câmara durante a noite a quatro graus Celsius.Remova a mistura primária de anticorpos e lave os poços três vezes com 100 microlitros de tampão de lavagem com cinco minutos de incubação à temperatura ambiente em um agitador de laboratório inclinado. Após a remoção do tampão de lavagem, incubar as células com 100 microlitros de anticorpo secundário marcado com HRP, reconhecendo as espécies do anticorpo primário a serem amplificadas por 30 minutos em um agitador de laboratório inclinado. Durante a incubação de anticorpos, prepare a mistura de tiramida biotinilada.Para desencadear a atividade enzimática da HRP, adicione um substrato oxidante ao tampão TSA imediatamente antes do uso. Em seguida, diluir a tiramida biotinilada no tampão TSA preparado utilizando a diluição optimizada. Após a incubação com anticorpo secundário marcado com HRP, lave os poços três vezes com tampão de lavagem com cinco minutos de incubação em um agitador de laboratório inclinado.Depois de remover o tampão de lavagem do poço, adicione biotina-tiramida diluída ao poço a um volume final de 100 microlitros. Incubar a reação à temperatura ambiente por 10 minutos em um agitador de laboratório inclinado, seguido de três lavagens tampão de lavagem. Prepare a mistura de coloração contendo o anticorpo secundário, a estreptavidina acoplada e o tampão de coloração e lavagem nuclear.Retire o tampão de lavagem e incube a placa com 100 microlitros de mistura de coloração à temperatura ambiente durante uma hora num agitador de laboratório basculante. Mantenha as câmaras de imagem protegidas da luz a partir deste passo. Após a coloração, lave consecutivamente duas vezes com tampão de lavagem e enxágue os poços duas vezes com PBS.Armazenar as amostras em excesso de PBS a quatro graus Celsius para preservar a coloração até a imagem. A câmara de imagem está agora pronta para ser visualizada em um microscópio confocal. A inclusão da amplificação do sinal de tiramida permitiu a detecção robusta de RIPK3 fosforilado na serina 227 no citosol do vírus herpes simplex um, codificando uma borda mutante de células infectadas por ICP6.Uma potência do laser de 2% foi suficiente para a detecção sensível. Na imunofluorescência indireta padrão, uma maior potência do laser permaneceu insuficiente para a detecção de fosfo-RIPK3. Na quantificação das imagens tridimensionais da pilha Z, as células infectadas mostraram um aumento de aproximadamente 20 vezes de voxels positivos para RIPK3 fosforilado em relação às células tratadas simuladas.O aumento da coloração fosfo-RIPK3 de células infectadas pelo vírus herpes simplex do tipo selvagem em comparação com células tratadas simuladas indicou que o domínio da borda da ICP6 é incapaz de bloquear completamente a fosforilação da RIPK3 na serina 227. O GSK840 liga-se ao domínio da quinase de RIPK3 e impede a fosforilação de RIPK3 na serina 227 após a ativação do ZBP1, confirmando a especificidade do método de detecção de fosfo-RIPK3 mediado por amplificação de sinal de tiramida. As células tratadas simuladas apresentaram baixa coloração citosólica levemente pontuada de fosforilação MLKL na serina 358, enquanto forte coloração foi detectada no citosol, núcleo e membrana plasmática das células infectadas.A imunofluorescência indireta padrão exigiu 40% de potência laser para a detecção específica de um sinal fosfo-MLKL nas células infectadas. Em contraste, a amplificação do sinal de tiramida aumentou a sensibilidade de detecção de fosfo-MLKL, diminuindo assim a potência necessária do laser para 6% de quantificação de imagem de pilha Z 3D mostrou um aumento de aproximadamente 90 vezes no número de voxels positivos para fosfo-MLKL usando amplificação de sinal de tiramida, em comparação com um aumento de sete vezes usando o método padrão, indicando melhor limiar de detecção e sensibilidade para fosfo-MLKL. Semelhante ao vírus herpes simplex um, a infecção pelo vírus influenza A desencadeou necroptose dependente de ZBP1.A amplificação do sinal de tiramida permitiu a detecção robusta de fosfo-RIPK3 e fosfo-MLKL, indicando necroptose. Para interpretar a coloração confocal, vários controles de coloração precisam ser incluídos. Isso implica uma condição sem primária, manchas únicas, bem como um controle positivo.Ao adaptar este protocolo, vários alvos podem ser amplificados usando TSA sequencial. Isso permitiria a detecção de RIPK3 e MLKL fosforilados dentro da mesma célula. A detecção sensível de biomarcadores de necroptose pode ser perspicaz para pesquisas em andamento sobre ZBP1 sobre autoinflamação ou infecção por vírus, nas quais as vias de morte celular dependentes de ZBP1 executadas ainda precisam ser confirmadas como necroptose, apoptose ou piroptose.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Alloantigen-specific Anergy in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells by Alloantigen Stimulation with Co-stimulatory Signal Blockade

Indução de aloantígenos específicos de anergia em células mononucleares do sangue periférico por Estimulação com aloantígenos Co-estimulatórias bloqueio de sinal

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) offers the best chance of cure for many patients with congenital and acquired hematologic ...

Imunologia e Infecção

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Seleção de Plasmodium falciparum Parasitas para Cytoadhesion para células do cérebro humano endotelial

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

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Seguindo o destino celular, em<em&gt; E. coli</em&gt; Após a infecção por um fago Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

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The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

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O Desenvolvimento da liofilizado Loop-mediadas isotérmicas de amplificação Reagentes para a detecção de<em&gt; Burnetii Coxiella</em

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Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...