Name: tyramide signal amplification for the immunofluorescent staining of zbp1-dependent phosphorylation of ripk3 and mlkl after hsv-1 infection in human cells
Uploaded: 2022-10-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells at J

Мы хотели бы поблагодарить VIB Bioimaging Core за обучение, поддержку и доступ к инструментальному парку. J.N. поддерживается стипендией PhD от Исследовательского фонда Фландрии (FWO). Исследования в группе J.M. были поддержаны грантом Odysseus II (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), грантом для младших исследователей (G031022N) от Исследовательского фонда Фландрии (FWO), грантом CRIG для молодых исследователей, доказательством концепции, а также Гентским университетом. Исследования в группе P.V. были поддержаны EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), старшими исследовательскими грантами FWO (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Фондом против рака (F/2016/865, F/2020/1505), консорциумами CRIG и GIGG и VIB.

1. Получение биотинилированного тирамида
<ol><li>Готовят биотинилированный тирамид, начиная с биотин-тирамида. Чтобы сделать 10 мМ запасного раствора, растворить 3,6 мг биотин-тирамида в 1 мл ДМСО. Хранить растворенный продукт в аликвотах при −20 °C для сохранения качества.</li>
</ol><p clas...

<ol>
	<li>Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+necroptosis+by+post-translational+modifications.">The regulation of necroptosis by post-translational modifications.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).</li><li>Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+necroptotic+cell+death+signaling.">The structural basis of necroptotic cell death signaling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).</li><li>Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis:+The+Trojan+horse+in+cell+autonomous+antiviral+host+defense.">Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense.</a> Virology. 479-480, 160-166 (2015).</li><li>Nailwal, H., Chan, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+in+anti-viral+inflammation.">Necroptosis in anti-viral inflammation.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).</li><li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+RIPK3+maintains+MLKL+in+an+inactive+conformation+prior+to+cell+death+by+necroptosis.">Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis.</a> Nature Communications. 12 (1), 6783 (2021).</li><li>Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location,+location,+location:+A+compartmentalized+view+of+TNF-induced+necroptotic+signaling.">Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling.</a> Science Signalling. 14 (668), (2021).</li><li>Koehler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+E3+prevents+sensing+of+Z-RNA+to+block+ZBP1-dependent+necroptosis.">Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis.</a> Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).</li><li>Balachandran, S., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Z-RNA+triggers+ZBP1-dependent+cell+death.">Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death.</a> Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).</li><li>Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZBP1:+Innate+sensor+regulating+cell+death+and+inflammation.">ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation.</a> Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).</li><li>Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+sensors+and+programmed+cell+death.">Nucleic acid sensors and programmed cell death.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).</li><li>Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+manipulation+of+host+cell+necroptosis+and+pyroptosis.">Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis.</a> Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+suppresses+necroptosis+in+human+cells.">Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+(HSV-1)+and+HSV-2+mediate+species-specific+modulations+of+programmed+necrosis+through+the+viral+ribonucleotide+reductase+large+subunit+R1.">Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1.</a> Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP1/RIP3+binding+to+HSV-1+ICP6+initiates+necroptosis+to+restrict+virus+propagation+in+mice.">RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-independent+contribution+of+ZBP1/DAI/DLM-1-triggered+necroptosis+in+host+defense+against+HSV1.">Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (8), 816 (2018).</li><li>Devos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+of+endogenous+nucleic+acids+by+ZBP1+induces+keratinocyte+necroptosis+and+skin+inflammation.">Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).</li><li>Jiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Z-nucleic-acid+sensing+triggers+ZBP1-dependent+necroptosis+and+inflammation.">Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation.</a> Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).</li><li>de Reuver, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+prevents+autoinflammation+by+suppressing+spontaneous+ZBP1+activation.">ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation.</a> Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).</li><li>Jiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+averts+fatal+type+I+interferon+induction+by+ZBP1.">ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1.</a> Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).</li><li>Hubbard, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+mutation+causes+ZBP1-dependent+immunopathology.">ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology.</a> Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+masks+the+cancer+immunotherapeutic+promise+of+ZBP1-driven+necroptosis.">ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis.</a> Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).</li><li>Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin+amplification+of+biotin+and+horseradish+peroxidase+signals+in+histochemical+stains.">Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).</li><li>Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+DNA+and+mRNA+in+situ+hybridization.">Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization.</a> Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).</li><li>Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+analysis+of+kinase+activity+by+intracellular+flow+cytometry.">Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry.</a> Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).</li><li>Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+mass+spectrometry+(TSA-MS)+ratio+identifies+nuclear+speckle+proteins.">Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).</li><li>Samson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+for+imaging+RIPK1,+RIPK3,+and+MLKL+in+mouse+and+human+cells.">A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells.</a> Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).</li><li>De Groote, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+new+gateway-compatible+inducible+lentiviral+vector+platform+allowing+easy+derivation+of+co-transduced+cells.">Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells.</a> Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).</li><li>Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+ICP6+impedes+TNF+receptor+1-induced+necrosome+assembly+during+compartmentalization+to+detergent-resistant+membrane+vesicles.">Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).</li><li>Mandal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP3+induces+apoptosis+independent+of+pronecrotic+kinase+activity.">RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity.</a> Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+Z-RNAs+induce+ZBP1-mediated+necroptosis.">Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis.</a> Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).</li><li>Garnish, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+interconversion+of+MLKL+and+disengagement+from+RIPK3+precede+cell+death+by+necroptosis.">Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis.</a> Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).</li><li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification.">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedural+requirements+and+recommendations+for+multiplex+immunofluorescence+tyramide+signal+amplification+assays+to+support+translational+oncology+studies.">Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies.</a> Cancers. 12 (2), 255 (2020).</li></ol>

Этот протокол иммунофлуоресцентного окрашивания описывает использование амплификации тирамидного сигнала (TSA) для повышения чувствительности к сигнальным событиям некроптотического сигнального пути человека, которые трудно обнаружить, включая фосфорилирование RIPK3 и MLKL26</s...

Рецептор-взаимодействующая серин/треонин протеинкиназа 3 (RIPK3) и доменная диназа смешанной линии (MLKL) являются центральными регуляторами некроптотической гибели клеток 1,2. Некроптоз является литической и воспалительной формой регулируемой гибели клеток, участвующей в противовирусном иммунитете и аутовоспалении. Некроптоз инфицированных вирусом клеток немедленно отключает репликацию вируса. Лизис клеток после индукции некроптоза также высвобождает связанные с повреждением молекулярные паттерны, которые стимулируют противовирусный иммунитет 3,4. Некроптоз инициируется активацией RIPK3 после опосредованного мотивом гомотипического взаимодействия RIP (RHIM) с одной из трех восходящих активирующих молекул: RIPK1 (при вовлечении рецептора TNF 1 [TNFR1]), TIR-доменсодержащим адаптером, индуцирующим интерферон-β (TRIF; при вовлечении Toll-подобных рецепторов 3 и 4) или датчиком противовирусной нуклеиновой кислоты Z-ДНК-связывающим белком 1 (ZBP1)1,2 . Передача сигналов некроптоза протекает через серию событий фосфорилирования, начиная с автофосфорилирования RIPK3. Аутофосфорилирование человеческого RIPK3 при серине (S)227 внутри его киназного домена является предпосылкой для некроптоза, обеспечивая взаимодействие с MLKL, и обычно используется в качестве биохимического маркера активации RIPK3 человека и некроптотической гибели клеток 1,5. После активации RIPK3 фосфорилирует цикл активации MLKL при треонине (T)357 и S3581. Это вызывает изменение конформации MLKL, что приводит к воздействию N-концевого домена четырехспирального пучка спирали. Затем MLKL олигомеризуется и транспортируется к клеточной мембране, где он образует пору через вставку открытых четырех пучков спирали в липидный бислой, что в конечном итоге приводит к гибели клеток 2,6.
ZBP1 - это датчик противовирусных нуклеиновых кислот, который распознает левосторонние Z-образные нуклеиновые кислоты, включая двухцепочечную РНК в Z-конформации (Z-РНК). Связывание Z-РНК происходит через два Zα-домена, расположенных на N-конце ZBP1. Считается, что Z-РНК, накапливающаяся во время заражения РНК и ДНК вирусами, напрямую влияет на ZBP1 7,8. Активированный ZBP1 набирает RIPK3 через свои центральные RHIM и индуцирует регулируемую гибель клеток, включая некроптоз 9,10. Вирусы приняли многочисленные механизмы побега для противодействия ZBP1-индуцированному некроптозу клеток-хозяев11. Например, вирус простого герпеса 1 (ВПГ-1) рибонуклеотидредуктазы субъединицы 1, известный как ICP6 и кодируемый UL39, содержит RHIM на своем N-конце, который препятствует ZBP1-опосредованной активации RIPK3 в клетках человека 12,13,14,15. ZBP1 не только ограничивает репликацию вируса, но исследования на мышах показали, что активация ZBP1 вызывает воспалительные заболевания и стимулирует раковый иммунитет 16,17,18,19,20,21. Поэтому протоколы, которые обнаруживают сигнальные события, происходящие во время ZBP1-индуцированного некроптоза в клетках человека, ценны для оценки роли ZBP1 в этих процессах.
Амплификация тирамидного сигнала (TSA), также называемая катализируемым репортерным осаждением (CARD), была разработана для улучшения предела обнаружения и отношения сигнал/шум в иммуноанализах на основе антител. Во время TSA любое первичное антитело может быть использовано для обнаружения интересующего антигена. Пероксидаза хрена (HRP) в сочетании со вторичным антителом катализирует местное накопление биотинилированных тирамидных радикалов в присутствии перекиси водорода. Эти активированные биотин-тирамидные радикалы затем реагируют с проксимальными остатками тирозина с образованием ковалентных связей. Потенциальные тирамидно-биотиновые субстраты включают сам антиген, первичные и вторичные антитела и соседние белки. Таким образом, в то время как TSA значительно улучшает чувствительность анализа, часть его пространственного разрешения теряется. На заключительном этапе молекулы биотина обнаруживаются с использованием флуоресцентно меченого стрептавидина. Реакция HRP откладывает много молекул тирамида-биотина на интересующем антигене или рядом с ним. Это значительно увеличивает количество сайтов связывания стрептавидин-фторхром, тем самым значительно усиливая чувствительность анализа (рисунок 1). Альтернативно, тирамид может быть непосредственно соединен с фторхромом, устраняя необходимость в флуорофорах, связанных со стрептавидином. Иммуногистохимия белка и гибридизация ДНК/РНК in situ были одними из первых методов, с помощью которых TSA был использован для улучшения интенсивности сигнала22,23. Совсем недавно TSA был объединен с внутриклеточной проточной цитометрией24 и масс-спектрометрией25.
Здесь мы представляем протокол для обнаружения серина 227 фосфорилированного человеческого RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) и фосфорилированного человеческого MLKL (p-MLKL [S358]) при активации ZBP1 инфекцией HSV-1 с использованием иммунофлуоресцентной микроскопии. Мы используем чувствительную к некроптозу клеточную линию колоректальной аденокарциномы человека HT-29, которая была трансдуцирована для стабильной экспрессии человеческого ZBP1. Эти клетки были инфицированы штаммом HSV-1, экспрессирующим мутантный белок ICP6 (HSV-1 ICP6mutRHIM), в котором четыре основные аминокислоты в вирусном RHIM (VQCG) были заменены аланинами (AAAA), тем самым делая ICP6 неспособным блокировать ZBP1-опосредованный некроптоз 13,14,15. Чтобы преодолеть проблему низкого отношения сигнал/шум коммерчески доступных в настоящее время антител, направленных против p-RIPK3 и p-MLKL в иммуноокрашивании26, мы выполняем стадию усиления тирамидного сигнала (TSA) (рисунок 1), которая приводит к надежному обнаружению человеческого p-RIPK3 (S227) и улучшает чувствительность обнаружения p-MLKL человека (S358) на порядок.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP</td>
			<td>Agilent Technologies Belgium</td>
			<td>K4002</td>
			<td>Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse DyLight 633</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>35513</td>
			<td>Secundary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 ICP0</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53070</td>
			<td>Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV-PR8 mouse serum</td>
			<td>In house production</td>
			<td>xx</td>
			<td>Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMLKL</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab187091</td>
			<td>Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRIPK3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab209384</td>
			<td>Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophores</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D21490</td>
			<td>To visualise the nucleus of the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>S11226</td>
			<td>To visulalise biotin molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compounds</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Oxidising substrate, necessary for HRP activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>SANBIO</td>
			<td>AR1068</td>
			<td>To fix/crosslink the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinyl-tyramide</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6241</td>
			<td>To amplify signal, HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV-6</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7597</td>
			<td>BV6 IAP Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>For cell culture: to detach the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>8.0 g/L NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.4 g/L disodium salt of EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.04%</td>
			<td>In house formulation</td>
			<td></td>
			<td>1.1 g/L Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>TICO</td>
			<td>FBS EU XXX</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSK&#39;840</td>
			<td>Aobious</td>
			<td>AOB0917</td>
			<td>RIPK3 kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10444402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td>In house production</td>
			<td>-</td>
			<td>Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td>To permeabilise the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11732</td>
			<td>For cell counting, used as live/dead marker at 0,1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4424</td>
			<td>For cell culture: to detach the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zVAD</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>BACE4026865.0005</td>
			<td>Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 well high glass bottom</td>
			<td>iBidi</td>
			<td>80807</td>
			<td>To culture the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Preping Balls-size medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71001-10</td>
			<td>To clean the objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518 F / 30 &#176;C</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>444970-9000-000</td>
			<td>To visualise the sample at high magnifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaner</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>000000-0105-200</td>
			<td>To clean the objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM880 Fast Airyscan confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To visualise the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Office</td>
			<td>xx</td>
			<td>To process the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>xx</td>
			<td>To analyse the data- statistical testing and graph generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Volocity</td>
			<td>xx</td>
			<td>To perform quantifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen black</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>xx</td>
			<td>To aquire and process images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen blue</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>xx</td>
			<td>To visualise images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viruses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 (mutRHIM) F strain</td>
			<td>produced by&#160; Dr. Jiahuai Han</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG&#62;AAAA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 (WT) F strain</td>
			<td>Produced by Dr. Jiahuai Han</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV PR8</td>
			<td>in house stock</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>IAV as a trigger for necroptosis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tyramide signal amplification for the immunofluorescent staining of zbp1-dependent phosphorylation of ripk3 and mlkl after hsv-1 infection in human cells

Киназна-взаимодействующая с рецептором серин/треонин протеинкиназа 3 (RIPK3) и ее субстрат смешанной линии киназы доменной (MLKL) являются критическими регуляторами некроптоза, воспалительной формы гибели клеток с важными противовирусными функциями. Аутофосфорилирование RIPK3 индуцирует фосфорилирование и активацию порообразующего белка-палача некроптоза MLKL. Незаконный оборот и олигомеризация фосфорилированного МЛКЛ на клеточной мембране приводит к лизису клеток, характерному для некроптотической гибели клеток. Датчик нуклеиновых кислот ZBP1 активируется путем связывания с левосторонней Z-формой двухцепочечной РНК (Z-РНК) после заражения РНК и ДНК-вирусами. Активация ZBP1 ограничивает вирусную инфекцию, вызывая регулируемую гибель клеток, включая некроптоз, инфицированных клеток-хозяев. Иммунофлуоресцентная микроскопия позволяет визуализировать различные сигнальные стадии после ZBP1-опосредованного некроптоза на клеточной основе. Однако чувствительность стандартной флуоресцентной микроскопии с использованием современных коммерчески доступных фосфоспецифических антител против человека RIPK3 и MLKL исключает воспроизводимую визуализацию этих маркеров. Здесь мы описываем оптимизированную процедуру окрашивания сериновых (S) фосфорилированных RIPK3 (S227) и MLKL (S358) в клетках HT-29 человека, инфицированных вирусом простого герпеса 1 (HSV-1). Включение стадии усиления тирамидного сигнала (TSA) в протокол иммунофлуоресцентного окрашивания позволяет специфически обнаруживать фосфорилированный RIPK3 S227. Кроме того, TSA значительно повышает чувствительность обнаружения фосфорилированного MLKL S358. Вместе этот метод позволяет визуализировать эти два критических сигнальных события во время индукции некроптоза, индуцированного ZBP1.

Иммунофлуоресцентное обнаружение фосфорилирования MLKL и особенно фосфорилирования RIPK3 в клетках человека технически сложно26. Здесь мы представляем улучшенный протокол окрашивания для человека p-RIPK3 (S227) и p-MLKL (S358) при активации ZBP1. Протокол включает в себя шаг TSA для улучшен?...

Watch this Scientific Journal Video about Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells at J

Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells

Усиление тирамидного сигнала во время иммунофлуоресцентного окрашивания позволяет чувствительно обнаруживать фосфорилированные RIPK3 и MLKL во время ZBP1-индуцированного некроптоза после инфекции ВПГ-1.

Усиление тирамидного сигнала для иммунофлуоресцентного окрашивания ZBP1-зависимого фосфорилирования RIPK3 и MLKL после инфекции HSV-1 в клетках человека

The kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) and its substrate mixed lineage kinase domain-like (MLKL) are critical ...

Надежная визуализация фосфорилированных RIPK3 и MLKL, двух ключевых сигнальных событий во время индукции некроптоза, была технически сложной задачей. Представленный протокол амплификации тирамида позволяет чувствительно обнаруживать эти две молекулы. Шаг усиления сигнала снижает порог обнаружения, обеспечивая надежное и воспроизводимое обнаружение фосфорилированных RIPK3 и MLKL.Начните посев 90 000 ZBP1-экспрессирующих клеток HT-29 в полноценную среду McCoy's 5A в пластину скважины площадью один сантиметр, что позволит проводить высококачественную микроскопию. Используйте конечный объем 200 микролитров на лунку. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа.Как только клетки достигают от 70 до 80% конфлюентности, заражают клетки в 200 микролитров предварительно нагретой, полной мощности среды Маккоя 5A, содержащей вирус простого герпеса один, кодирующий мутантный обод ICP6 при множественности инфекции в пять. Инкубируйте клетки с вирусом в течение девяти часов, чтобы вызвать некроптоз. В качестве положительного контроля индукции некроптоза стимулируйте клетки в течение четырех часов 200 микролитрами предварительно нагретого коктейля, вызывающего некроптоз.В качестве отрицательного контроля добавьте 22 микролитра 10 микромоляров GSK840, предварительно нагретых при 37 градусах Цельсия, чтобы ингибировать активность киназы RIPK3. Включают этот ингибитор в необработанном состоянии и после стимуляции некроптоза для предотвращения аутофосфорилирования серина 227. Чтобы закрепить клетки, удалите среду и промыть клетки 200 микролитрами PBS.Затем удалите PBS и добавьте 150 микролитров 4% параформальдегида, уравновешенного при комнатной температуре. Инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 30 минут. После фиксации удаляют 4% параформальдегида и трижды промывают клетки 200 микролитрами PBS.Образцы могут храниться в количестве, превышающем PBS при четырех градусах Цельсия в течение ночи до дальнейшей обработки. Извлеките PBS из пластины и инкубируйте клетки со 100 микролитрами буфера проникновения при комнатной температуре в течение 30 минут на наклонном лабораторном шейкере. После инкубации удалите буфер пермеабилизации и промыть клетки 100 микролитрами промывочного буфера.Инкубируйте камеру визуализации с буфером промывки в течение пяти минут при комнатной температуре на наклонном лабораторном шейкере. Чтобы предотвратить неспецифическое связывание первичных антител, инкубируют пластину со 100 микролитрами блокирующей среды при комнатной температуре в течение двух часов на наклонном лабораторном шейкере. Далее промыть колодцы три раза 100 микролитрами промывочного буфера с пятью минутами инкубации при комнатной температуре на наклонном лабораторном шейкере.После удаления буфера промывки добавьте 100 микролитров первичных антител в камеру визуализации. Убедитесь, что у вас нет первичного антитела, чтобы визуализировать потенциальный фон усиления тирамидного сигнала и установить порог маскировки. Насиживайте камеру на ночь при четырех градусах Цельсия.Удалите первичную смесь антител и трижды промыть лунки 100 микролитрами промывочного буфера с пятью минутами инкубации при комнатной температуре на наклонном лабораторном шейкере. После удаления промывочного буфера инкубируют клетки со 100 микролитрами меченого HRP вторичного антитела, распознавая вид первичного антитела, подлежащего усилению в течение 30 минут на наклонном лабораторном шейкере. Во время инкубации антител готовят биотинилированную тирамидную смесь.Чтобы вызвать ферментативную активность HRP, добавьте окисляющий субстрат в буфер TSA перед использованием. Затем разбавляют биотинилированный тирамид в подготовленном буфере TSA с использованием оптимизированного разбавления. После инкубации с меченым HRP вторичным антителом трижды промывайте колодцы промывочным буфером с пятью минутами инкубации на наклонном лабораторном шейкере.После снятия промывочного буфера из скважины добавьте в скважину разбавленный биотин-тирамид до конечного объема 100 микролитров. Инкубируйте реакцию при комнатной температуре в течение 10 минут на наклонном лабораторном шейкере с последующей тремя промывочными буферными промывками. Приготовьте окрашивающую смесь, содержащую вторичное антитело, связанный стрептавидин, а также буфер ядерного окрашивания и промывки.Снимите буфер для стирки и инкубируйте пластину со 100 микролитрами окрашивающей смеси при комнатной температуре в течение одного часа на наклонном лабораторном шейкере. Держите камеры визуализации защищенными от света с этого шага вперед. После окрашивания дважды промывайте с помощью промывочного буфера и два раза промойте колодцы PBS.Храните образцы сверх PBS при четырех градусах Цельсия, чтобы сохранить окрашивание до получения изображения. Камера визуализации теперь готова к визуализации на конфокальном микроскопе. Включение амплификации тирамидного сигнала позволило надежно обнаружить RIPK3, фосфорилированный при серине 227, в цитозоле вируса простого герпеса, кодирующего мутантные клетки ICP6.Мощность лазера в 2% была достаточной для чувствительного обнаружения. При стандартной непрямой иммунофлуоресценции более высокая мощность лазера оставалась недостаточной для обнаружения фосфо-RIPK3. При количественной оценке трехмерных изображений Z-стека инфицированные клетки показали примерно 20-кратное увеличение вокселей, положительных для фосфорилированных RIPK3 по сравнению с клетками, обработанными имитацией.Повышенное окрашивание фосфо-RIPK3 инфицированных клеток вирусом простого герпеса дикого типа по сравнению с клетками, обработанными имитацией, указывало на то, что кольцевой домен ICP6 не может полностью блокировать фосфорилирование RIPK3 при серине 227. GSK840 связывается с киназным доменом RIPK3 и предотвращает фосфорилирование RIPK3 при серине 227 при активации ZBP1, подтверждая специфичность метода обнаружения фосфо-RIPK3, опосредованного усилением тирамидного сигнала. Пробные обработанные клетки показали низкое слегка прерывистое цитозольное окрашивание фосфорилирования MLKL при серине 358, в то время как сильное окрашивание было обнаружено в цитозоле, ядре и плазматической мембране инфицированных клеток.Стандартная непрямая иммунофлуоресценция требовала 40% мощности лазера для специфического обнаружения сигнала фосфо-МЛКЛ в инфицированных клетках. Напротив, усиление тирамидного сигнала повысило чувствительность обнаружения фосфо-МЛКЛ, тем самым снизив необходимую мощность лазера до 6%3D Z-стека, количественное определение изображения показало примерно 90-кратное увеличение числа вокселей положительных для фосфо-МЛКЛ с использованием тирамидного усиления сигнала по сравнению с семикратным увеличением с использованием стандартного метода, что указывает на улучшение порога обнаружения и чувствительности для фосфо-МЛКЛ. Подобно вирусу простого герпеса, вирусная инфекция гриппа А вызвала ZBP1-зависимый некроптоз.Усиление тирамидного сигнала позволило надежно обнаружить фосфо-RIPK3 и фосфо-МЛКЛ, что указывает на некроптоз. Чтобы интерпретировать конфокальное окрашивание, необходимо включить несколько элементов управления окрашиванием. Это влечет за собой отсутствие первичного состояния, единичные пятна, а также положительный контроль.Адаптируя этот протокол, несколько целей могут быть усилены с использованием последовательного TSA. Это позволило бы обнаруживать фосфорилированные RIPK3 и MLKL в одной клетке. Чувствительное обнаружение биомаркеров некроптоза может быть полезным для текущих исследований ZBP1 по аутовоспалению или вирусной инфекции, при которых выполненные ZBP1-зависимые пути гибели клеток все еще должны быть подтверждены как некроптоз, апоптоз или пироптоз.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Alloantigen-specific Anergy in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells by Alloantigen Stimulation with Co-stimulatory Signal Blockade

Индукция аллоантигена конкретных анергии в населенных мононуклеарных клеток периферической крови путем стимуляции аллоантигена с сопредседателями стимулирующий сигнал блокады

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) offers the best chance of cure for many patients with congenital and acquired hematologic ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Выбор Plasmodium тропической Паразиты для Cytoadhesion для мозга человека эндотелиальных клеток

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

После Cell-судьба<em&gt; E. палочки</em&gt; После заражения фагом лямбда

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

PiggyBac транспозонов модификации системы первичной Т-клетках человека

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Обнаружение гликогена в мононуклеарных клеток периферической крови с йодной кислотой Шиффа окрашивания

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Развитие Лиофилизированный Loop опосредованных изотермических реагенты для амплификации для обнаружения<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Оценка цитотоксических и иммуномодулирующих эффектов веществ в легкое человека точности cut ломтики

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Количественная оценка Efferocytosis по микроскопии флуоресцирования одноклеточного

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue

Совместное окрашивание кровеносных сосудов и нервных волокон в жировой ткани

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Пневмококк инфекция первичных эндотелиальных клеток человека в постоянном потоке

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...