Name: tyramide signal amplification for the immunofluorescent staining of zbp1-dependent phosphorylation of ripk3 and mlkl after hsv-1 infection in human cells
Uploaded: 2022-10-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells at J

Nos gustaría agradecer al VIB Bioimaging Core por la capacitación, el apoyo y el acceso al parque de instrumentos. J.N. cuenta con el apoyo de una beca de doctorado de la Fundación de Investigación de Flandes (FWO). La investigación en el grupo J.M. fue apoyada por una beca Odysseus II (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), una beca de investigación junior (G031022N) de la Fundación de Investigación de Flandes (FWO), una beca de prueba de concepto para jóvenes investigadores de CRIG y por la Universidad de Gante. La investigación en el grupo P.V. contó con el apoyo de EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG y GIGG consorcios, y VIB.

1. Preparación de tiramida biotinilada
<ol><li>Preparar tiramida biotinilada a partir de biotina-tiramida. Para hacer una solución madre de 10 mM, disuelva 3,6 mg de tiramida de biotina en 1 ml de DMSO. Conservar el producto disuelto en alícuotas a -20 °C para preservar la calidad.</li>
</ol>2. Mantenimiento de células HT-29 en cultivo
NOTA: Los HT-29 que expresan ZBP1 se generaron por transducción con un lentivector<sup class="xr...

<ol>
	<li>Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+necroptosis+by+post-translational+modifications.">The regulation of necroptosis by post-translational modifications.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).</li><li>Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+necroptotic+cell+death+signaling.">The structural basis of necroptotic cell death signaling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).</li><li>Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis:+The+Trojan+horse+in+cell+autonomous+antiviral+host+defense.">Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense.</a> Virology. 479-480, 160-166 (2015).</li><li>Nailwal, H., Chan, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+in+anti-viral+inflammation.">Necroptosis in anti-viral inflammation.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).</li><li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+RIPK3+maintains+MLKL+in+an+inactive+conformation+prior+to+cell+death+by+necroptosis.">Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis.</a> Nature Communications. 12 (1), 6783 (2021).</li><li>Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location,+location,+location:+A+compartmentalized+view+of+TNF-induced+necroptotic+signaling.">Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling.</a> Science Signalling. 14 (668), (2021).</li><li>Koehler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+E3+prevents+sensing+of+Z-RNA+to+block+ZBP1-dependent+necroptosis.">Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis.</a> Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).</li><li>Balachandran, S., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Z-RNA+triggers+ZBP1-dependent+cell+death.">Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death.</a> Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).</li><li>Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZBP1:+Innate+sensor+regulating+cell+death+and+inflammation.">ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation.</a> Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).</li><li>Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+sensors+and+programmed+cell+death.">Nucleic acid sensors and programmed cell death.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).</li><li>Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+manipulation+of+host+cell+necroptosis+and+pyroptosis.">Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis.</a> Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+suppresses+necroptosis+in+human+cells.">Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+(HSV-1)+and+HSV-2+mediate+species-specific+modulations+of+programmed+necrosis+through+the+viral+ribonucleotide+reductase+large+subunit+R1.">Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1.</a> Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP1/RIP3+binding+to+HSV-1+ICP6+initiates+necroptosis+to+restrict+virus+propagation+in+mice.">RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-independent+contribution+of+ZBP1/DAI/DLM-1-triggered+necroptosis+in+host+defense+against+HSV1.">Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (8), 816 (2018).</li><li>Devos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+of+endogenous+nucleic+acids+by+ZBP1+induces+keratinocyte+necroptosis+and+skin+inflammation.">Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).</li><li>Jiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Z-nucleic-acid+sensing+triggers+ZBP1-dependent+necroptosis+and+inflammation.">Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation.</a> Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).</li><li>de Reuver, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+prevents+autoinflammation+by+suppressing+spontaneous+ZBP1+activation.">ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation.</a> Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).</li><li>Jiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+averts+fatal+type+I+interferon+induction+by+ZBP1.">ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1.</a> Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).</li><li>Hubbard, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+mutation+causes+ZBP1-dependent+immunopathology.">ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology.</a> Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+masks+the+cancer+immunotherapeutic+promise+of+ZBP1-driven+necroptosis.">ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis.</a> Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).</li><li>Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin+amplification+of+biotin+and+horseradish+peroxidase+signals+in+histochemical+stains.">Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).</li><li>Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+DNA+and+mRNA+in+situ+hybridization.">Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization.</a> Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).</li><li>Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+analysis+of+kinase+activity+by+intracellular+flow+cytometry.">Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry.</a> Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).</li><li>Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+mass+spectrometry+(TSA-MS)+ratio+identifies+nuclear+speckle+proteins.">Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).</li><li>Samson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+for+imaging+RIPK1,+RIPK3,+and+MLKL+in+mouse+and+human+cells.">A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells.</a> Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).</li><li>De Groote, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+new+gateway-compatible+inducible+lentiviral+vector+platform+allowing+easy+derivation+of+co-transduced+cells.">Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells.</a> Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).</li><li>Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+ICP6+impedes+TNF+receptor+1-induced+necrosome+assembly+during+compartmentalization+to+detergent-resistant+membrane+vesicles.">Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).</li><li>Mandal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP3+induces+apoptosis+independent+of+pronecrotic+kinase+activity.">RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity.</a> Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+Z-RNAs+induce+ZBP1-mediated+necroptosis.">Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis.</a> Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).</li><li>Garnish, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+interconversion+of+MLKL+and+disengagement+from+RIPK3+precede+cell+death+by+necroptosis.">Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis.</a> Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).</li><li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification.">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedural+requirements+and+recommendations+for+multiplex+immunofluorescence+tyramide+signal+amplification+assays+to+support+translational+oncology+studies.">Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies.</a> Cancers. 12 (2), 255 (2020).</li></ol>

Este protocolo de tinción inmunofluorescente describe el uso de la amplificación de señal de tiramida (TSA) para aumentar la sensibilidad a los eventos de señalización de la vía de señalización necropótica humana que son difíciles de detectar, incluida la fosforilación de RIPK3 y MLKL26. La inclusión de un paso TSA mejora significativamente el umbral de detección de p-RIPK3 (S227) y p-MLKL (S358) y aumenta la sensibilidad del esfuerzo p-MLKL (S358). TSA reveló una señal p-RIPK3 (S22...

La proteína quinasa 3 de serina/treonina que interactúa con receptores (RIPK3) y la quinasa de linaje mixto similar a un dominio (MLKL) son reguladores centrales de la muerte celular necrótica 1,2. La necroptosis es una forma lítica e inflamatoria de muerte celular regulada involucrada en la inmunidad antiviral y la autoinflamación. La necroptosis de las células infectadas por virus detiene inmediatamente la replicación del virus. La lisis celular después de la inducción de necroptosis también libera patrones moleculares asociados al daño, que estimulan la inmunidad antiviral 3,4. La necroptosis se inicia por la activación de RIPK3 después de interacciones mediadas por motivos de interacción homotípica RIP (RHIM) con una de las tres moléculas activadoras aguas arriba: RIPK1 (sobre el compromiso del receptor TNF 1 [TNFR1]), β inductor de interferón inductor de adaptador que contiene dominio TIR (TRIF; en el compromiso de los receptores 3 y 4 tipo Toll), o el sensor antiviral de ácido nucleico Z-DNA proteína de unión al ADN 1 (ZBP1)1,2 . La señalización de necroptosis procede a través de una serie de eventos de fosforilación que comienzan con la autofosforilación de RIPK3. La autofosforilación de RIPK3 humana en serina (S)227 dentro de su dominio quinasa es un requisito previo para la necroptosis al permitir la interacción con MLKL y se usa comúnmente como un marcador bioquímico para la activación de RIPK3 humana y la muerte celular necrótica 1,5. Una vez activado, RIPK3 fosforila el bucle de activación de MLKL en treonina (T)357 y S3581. Esto provoca un cambio en la conformación MLKL, lo que resulta en la exposición del dominio del haz de cuatro hélices N-terminal. MLKL luego oligomeriza y trafica a la membrana celular donde forma un poro a través de la inserción de los cuatro haces helicoidales expuestos en la bicapa lipídica, lo que finalmente conduce a la muerte celular 2,6.
ZBP1 es un sensor de ácido nucleico antiviral que reconoce los ácidos nucleicos zurdos en forma Z, incluido el ARN bicatenario en la conformación Z (ARN Z). La unión al ARN Z se produce a través de dos dominios Zα posicionados en el extremo N de ZBP1. Se cree que el ARN-Z que se acumula durante la infección por virus de ARN y ADN afecta directamente a ZBP1 7,8. ZBP1 activado recluta RIPK3 a través de sus RHIM centrales e induce la muerte celular regulada, incluyendo necroptosis 9,10. Los virus han adoptado numerosos mecanismos de escape para contrarrestar la necroptosis de la célula huésped inducida por ZBP111. Por ejemplo, la subunidad 1 de la ribonucleótido reductasa del virus del herpes simple 1 (HSV-1), conocida como ICP6 y codificada por UL39, alberga RHIM en su extremo N que interfiere con la activación de RIPK3 mediada por ZBP1 en células humanas12,13,14,15. ZBP1 no sólo restringe la replicación viral, sino que los estudios en ratones han demostrado que la activación de ZBP1 causa enfermedades inflamatorias y estimula la inmunidad contra el cáncer 16,17,18,19,20,21. Los protocolos que detectan eventos de señalización que ocurren durante la necroptosis inducida por ZBP1 en células humanas son, por lo tanto, valiosos para evaluar el papel de ZBP1 en estos procesos.
La amplificación de señal de tiramida (TSA), también conocida como deposición catalizada del informador (CARD), se ha desarrollado para mejorar el límite de detección y la relación señal-ruido en inmunoensayos basados en anticuerpos. Durante la TSA, se puede usar cualquier anticuerpo primario para detectar el antígeno de interés. La peroxidasa de rábano picante (HRP), acoplada a un anticuerpo secundario, cataliza la acumulación local de radicales tiramida biotinilados en presencia de peróxido de hidrógeno. Estos radicales de biotina-tiramida activados reaccionan con residuos de tirosina proximales para formar enlaces covalentes. Los sustratos potenciales de tiramida-biotina incluyen el antígeno en sí, los anticuerpos primarios y secundarios y las proteínas vecinas. Por lo tanto, aunque TSA mejora significativamente la sensibilidad del ensayo, parte de su resolución espacial se pierde. En un paso final, las moléculas de biotina se detectan utilizando estreptavidina marcada con fluorescencia. La reacción HRP deposita muchas moléculas de tiramida-biotina en o cerca del antígeno de interés. Esto aumenta en gran medida el número de sitios de unión estreptavidina-fluorocromo, amplificando así en gran medida la sensibilidad del ensayo (Figura 1). Alternativamente, la tiramida se puede acoplar directamente a un fluorocromo, eliminando la necesidad de fluoróforos acoplados a estreptavidina. La inmunohistoquímica de proteínas y la hibridación in situ ADN/ARN estuvieron entre los primeros métodos mediante los cuales se empleó TSA para mejorar las intensidades de señal22,23. Más recientemente, la TSA se ha combinado con la citometría de flujo intracelular24 y la espectrometría de masas25.
Aquí, presentamos un protocolo para detectar serina 227 fosforilada humana RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) y MLKL humana fosforilada (p-MLKL [S358]) tras la activación de ZBP1 por infección por HSV-1 utilizando microscopía de inmunofluorescencia. Utilizamos una línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano HT-29 sensible a la necroptosis que se transdució para expresar de manera estable ZBP1 humano. Estas células fueron infectadas con una cepa HSV-1 que expresa una proteína ICP6 mutante (HSV-1 ICP6mutRHIM) en la que cuatro aminoácidos centrales dentro del RHIM viral (VQCG) fueron reemplazados por alaninas (AAAA), lo que hace que el ICP6 no pueda bloquear la necroptosis mediada por ZBP113,14,15. Para superar el problema de la baja relación señal-ruido de los anticuerpos actualmente disponibles comercialmente dirigidos contra p-RIPK3 y p-MLKL en inmunotinción26, realizamos un paso de amplificación de señal de tiramida (TSA) (Figura 1), que resulta en la detección robusta de p-RIPK3 humano (S227) y mejora la sensibilidad de detección de p-MLKL humano (S358) en un orden de magnitud.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP</td>
			<td>Agilent Technologies Belgium</td>
			<td>K4002</td>
			<td>Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse DyLight 633</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>35513</td>
			<td>Secundary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 ICP0</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53070</td>
			<td>Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV-PR8 mouse serum</td>
			<td>In house production</td>
			<td>xx</td>
			<td>Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMLKL</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab187091</td>
			<td>Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRIPK3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab209384</td>
			<td>Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophores</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D21490</td>
			<td>To visualise the nucleus of the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>S11226</td>
			<td>To visulalise biotin molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compounds</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Oxidising substrate, necessary for HRP activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>SANBIO</td>
			<td>AR1068</td>
			<td>To fix/crosslink the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinyl-tyramide</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6241</td>
			<td>To amplify signal, HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV-6</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7597</td>
			<td>BV6 IAP Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>For cell culture: to detach the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>8.0 g/L NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.4 g/L disodium salt of EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.04%</td>
			<td>In house formulation</td>
			<td></td>
			<td>1.1 g/L Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>TICO</td>
			<td>FBS EU XXX</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSK&#39;840</td>
			<td>Aobious</td>
			<td>AOB0917</td>
			<td>RIPK3 kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10444402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td>In house production</td>
			<td>-</td>
			<td>Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td>To permeabilise the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11732</td>
			<td>For cell counting, used as live/dead marker at 0,1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4424</td>
			<td>For cell culture: to detach the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zVAD</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>BACE4026865.0005</td>
			<td>Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 well high glass bottom</td>
			<td>iBidi</td>
			<td>80807</td>
			<td>To culture the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Preping Balls-size medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71001-10</td>
			<td>To clean the objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518 F / 30 &#176;C</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>444970-9000-000</td>
			<td>To visualise the sample at high magnifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaner</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>000000-0105-200</td>
			<td>To clean the objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM880 Fast Airyscan confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To visualise the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Office</td>
			<td>xx</td>
			<td>To process the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>xx</td>
			<td>To analyse the data- statistical testing and graph generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Volocity</td>
			<td>xx</td>
			<td>To perform quantifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen black</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>xx</td>
			<td>To aquire and process images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen blue</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>xx</td>
			<td>To visualise images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viruses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 (mutRHIM) F strain</td>
			<td>produced by&#160; Dr. Jiahuai Han</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG&#62;AAAA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 (WT) F strain</td>
			<td>Produced by Dr. Jiahuai Han</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV PR8</td>
			<td>in house stock</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>IAV as a trigger for necroptosis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tyramide signal amplification for the immunofluorescent staining of zbp1-dependent phosphorylation of ripk3 and mlkl after hsv-1 infection in human cells

La quinasa Receptor-interacción serina/treonina proteína quinasa 3 (RIPK3) y su sustrato mixto de linaje quinasa similar a dominio (MLKL) son reguladores críticos de necroptosis, una forma inflamatoria de muerte celular con importantes funciones antivirales. La autofosforilación de RIPK3 induce la fosforilación y activación de la proteína verdugo formadora de poros de la necroptosis MLKL. El tráfico y oligomerización de MLKL fosforilada en la membrana celular da lugar a la lisis celular, característica de la muerte celular necroptótica. El sensor de ácido nucleico ZBP1 se activa uniéndose al ARN bicatenario zurdo en forma Z (ARN-Z) después de la infección con virus de ARN y ADN. La activación de ZBP1 restringe la infección por virus al inducir la muerte celular regulada, incluida la necroptosis, de las células huésped infectadas. La microscopía de inmunofluorescencia permite la visualización de diferentes pasos de señalización aguas abajo de la necroptosis mediada por ZBP1 por célula. Sin embargo, la sensibilidad de la microscopía de fluorescencia estándar, utilizando anticuerpos fosfoespecíficos disponibles comercialmente contra RIPK3 y MLKL humanos, impide la obtención de imágenes reproducibles de estos marcadores. Aquí, describimos un procedimiento de tinción optimizado para serina (S) fosforiladas RIPK3 (S227) y MLKL (S358) en células humanas HT-29 infectadas con el virus del herpes simple 1 (HSV-1). La inclusión de un paso de amplificación de señal de tiramida (TSA) en el protocolo de tinción inmunofluorescente permite la detección específica de S227 fosforilado RIPK3. Además, TSA aumenta en gran medida la sensibilidad de la detección de MLKL fosforilado S358. Juntos, este método permite la visualización de estos dos eventos críticos de señalización durante la inducción de la necroptosis inducida por ZBP1.

La detección inmunofluorescente de la fosforilación de MLKL y especialmente de la fosforilación de RIPK3 en células humanas es técnicamente desafiante26. Aquí presentamos un protocolo de tinción mejorado para p-RIPK3 (S227) y p-MLKL (S358) humanos tras la activación de ZBP1. El protocolo incluye un paso TSA para mejorar el límite de detección y la sensibilidad de las señales fluorescentes. Para validar el método, se realizó una comparación lado a lado de la inmunofluorescencia mediad...

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Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells

La amplificación de la señal de tiramida durante la tinción inmunofluorescente permite la detección sensible de RIPK3 y MLKL fosforilados durante la necroptosis inducida por ZBP1 después de la infección por HSV-1.

Amplificación de la señal de tiramida para la tinción inmunofluorescente de la fosforilación dependiente de ZBP1 de RIPK3 y MLKL después de la infección por HSV-1 en células humanas

The kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) and its substrate mixed lineage kinase domain-like (MLKL) are critical ...

La visualización robusta de RIPK3 y MLKL fosforiladas, dos eventos de señalización clave durante la inducción de necroptosis, ha sido técnicamente desafiante. El protocolo de amplificación de tiramida presentado permite la detección sensible de estas dos moléculas. El paso de amplificación de la señal reduce el umbral de detección, lo que permite una detección robusta y reproducible de RIPK3 y MLKL fosforilados.Comience a sembrar las 90, 000 células HT-29 que expresan ZBP1 en el medio 5A de McCoy de fuerza completa en una placa de pozo de área de superficie cuadrada de un centímetro, lo que permite una microscopía de alta gama. Utilice un volumen final de 200 microlitros por pozo. Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono.Una vez que las células alcanzan el 70 al 80% de confluencia, infectar las células en 200 microlitros precalentados, medio McCoy's 5A de fuerza completa que contiene el virus del herpes simple uno, codificando un borde mutante ICP6 en una multiplicidad de infección de cinco. Incubar las células con el virus durante nueve horas para inducir necroptosis. Como control positivo para la inducción de necroptosis, estimule las células durante cuatro horas con 200 microlitros de cóctel precalentado que induce necroptosis.Como control negativo, agregue 22 microlitros de 10 micromolares GSK840 precalentados a 37 grados centígrados para inhibir la actividad de la quinasa RIPK3. Incluya este inhibidor en una condición no tratada y después de la estimulación de necroptosis para prevenir la autofosforilación de la serina 227. Para fijar las células, retire el medio y lave las células con 200 microlitros de PBS.Luego retire el PBS y agregue 150 microlitros de paraformaldehído al 4% equilibrado a temperatura ambiente. Incubar las células a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la fijación, retire el 4% de paraformaldehído y lave las células tres veces con 200 microlitros de PBS.Las muestras se pueden almacenar en exceso de PBS a cuatro grados centígrados durante la noche hasta su posterior procesamiento. Retire el PBS de la placa e incube las células con 100 microlitros de tampón de permeación a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador de laboratorio basculante. Después de la incubación, retire el tampón de permeabilización y lave las células con 100 microlitros de tampón de lavado.Incubar la cámara de imágenes con tampón de lavado durante cinco minutos a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante. Para evitar la unión no específica de anticuerpos primarios, incube la placa con 100 microlitros de medio de bloqueo a temperatura ambiente durante dos horas en un agitador de laboratorio basculante. A continuación, lave los pocillos tres veces con 100 microlitros de tampón de lavado con cinco minutos de incubación a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante.Después de retirar el tampón de lavado, agregue 100 microlitros de anticuerpos primarios a la cámara de imágenes. Asegúrese de incluir una condición sin anticuerpos primarios para visualizar el fondo potencial de la amplificación de la señal de tiramida y establecer el umbral de enmascaramiento. Incubar la cámara durante la noche a cuatro grados centígrados.Retire la mezcla primaria de anticuerpos y lave los pocillos tres veces con 100 microlitros de tampón de lavado con cinco minutos de incubación a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante. Después de retirar el tampón de lavado, incubar las células con 100 microlitros de anticuerpo secundario marcado con HRP, reconociendo la especie del anticuerpo primario que se amplificará durante 30 minutos en un agitador de laboratorio basculante. Durante la incubación de anticuerpos, prepare la mezcla de tiramida biotinilada.Para desencadenar la actividad enzimática de HRP, agregue un sustrato oxidante al tampón TSA antes de usarlo. A continuación, diluir la tiramida biotinilada en el tampón TSA preparado utilizando la dilución optimizada. Después de la incubación con anticuerpos secundarios marcados con HRP, lave los pocillos tres veces con tampón de lavado con cinco minutos de incubación en un agitador de laboratorio basculante.Después de retirar el tampón de lavado del pozo, agregue biotina-tiramida diluida al pozo hasta un volumen final de 100 microlitros. Incubar la reacción a temperatura ambiente durante 10 minutos en un agitador de laboratorio basculante, seguido de tres lavados tampón. Prepare la mezcla de tinción que contiene el anticuerpo secundario, la estreptavidina acoplada y la tinción nuclear y el tampón de lavado.Retire el tampón de lavado e incube la placa con 100 microlitros de mezcla de tinción a temperatura ambiente durante una hora en un agitador de laboratorio basculante. Mantenga las cámaras de imágenes protegidas de la luz desde este paso en adelante. Después de la tinción, lave consecutivamente dos veces con tampón de lavado y enjuague los pocillos dos veces con PBS.Almacene las muestras en exceso de PBS a cuatro grados centígrados para preservar la tinción hasta la obtención de imágenes. La cámara de imágenes ahora está lista para ser visualizada en un microscopio confocal. La inclusión de la amplificación de la señal de tiramida permitió la detección robusta de RIPK3 fosforilada en serina 227 en el citosol del virus del herpes simple uno que codifica una célula infectada con ICP6 mutante en el borde.Una potencia láser del 2% fue suficiente para la detección sensible. En la inmunofluorescencia indirecta estándar, una mayor potencia láser seguía siendo insuficiente para la detección de fosfo-RIPK3. En la cuantificación de las imágenes tridimensionales de la pila Z, las células infectadas mostraron un aumento de aproximadamente 20 veces de vóxeles positivos para RIPK3 fosforilada sobre células tratadas simuladamente.El aumento de la tinción fosfo-RIPK3 de las células infectadas con el virus del herpes simple de tipo salvaje en comparación con las células tratadas con simulacros indicó que el dominio del borde de ICP6 no puede bloquear completamente la fosforilación de RIPK3 en serina 227. GSK840 se une al dominio quinasa de RIPK3 y previene la fosforilación de RIPK3 en la serina 227 tras la activación de ZBP1, confirmando la especificidad del método de detección de fosfo-RIPK3 mediado por amplificación de señal de tiramida. Las células tratadas simuladas mostraron una tinción citosólica baja ligeramente puntuada de la fosforilación de MLKL en la serina 358, mientras que se detectó una fuerte tinción en el citosol, el núcleo y la membrana plasmática de las células infectadas.La inmunofluorescencia indirecta estándar requirió una potencia láser del 40% para la detección específica de una señal de fosfo-MLKL en las células infectadas. Por el contrario, la amplificación de la señal de tiramida aumentó la sensibilidad de detección de fosfo-MLKL, reduciendo así la potencia láser necesaria al 6%La cuantificación de la imagen de la pila Z 3D mostró un aumento de aproximadamente 90 veces en el número de vóxeles positivos para fosfo-MLKL utilizando amplificación de señal de tiramida, en comparación con un aumento de siete veces utilizando el método estándar, lo que indica un umbral de detección mejorado y sensibilidad para fosfo-MLKL. Similar al virus del herpes simple uno, la infección por el virus de la influenza A desencadenó necroptosis dependiente de ZBP1.La amplificación de la señal de tiramida permitió la detección robusta de fosfo-RIPK3 y fosfo-MLKL, lo que indica necroptosis. Para interpretar la tinción confocal, se deben incluir varios controles de tinción. Esto implica una condición no primaria, manchas individuales, así como un control positivo.Al adaptar este protocolo, se pueden amplificar múltiples objetivos utilizando TSA secuencial. Esto permitiría la detección de RIPK3 y MLKL fosforilados dentro de la misma célula. La detección sensible de biomarcadores de necroptosis puede ser reveladora para la investigación en curso de ZBP1 sobre autoinflamación o infección por virus en la que las vías de muerte celular dependientes de ZBP1 ejecutadas aún deben confirmarse como necroptosis, apoptosis o piroptosis.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Alloantigen-specific Anergy in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells by Alloantigen Stimulation with Co-stimulatory Signal Blockade

La inducción de anergia aloantígenos específicos en las células mononucleares de sangre periférica mediante estimulación aloantígeno con bloqueo de señales co-estimuladoras

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) offers the best chance of cure for many patients with congenital and acquired hematologic ...

Investigación

Inmunología e Infección

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selección de Plasmodium falciparum Los parásitos de cytoadhesion a las células cerebrales endoteliales humanas

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

A raíz de la celda de destino en<em&gt; E. coli</em&gt; Después de la infección por fagos Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

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piggyBac Transposón modificación del sistema de células T humanas primarias

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

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La detección de glucógeno en las células mononucleares de sangre periférica con ácido periódico de Schiff tinción

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

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El desarrollo de la mediación de la Loop liofilizada amplificación isotérmica reactivos para la detección de<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

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Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

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Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of ...

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Infección por neumococo de células endoteliales humanas primarias en flujo constante

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...