Name: tyramide signal amplification for the immunofluorescent staining of zbp1-dependent phosphorylation of ripk3 and mlkl after hsv-1 infection in human cells
Uploaded: 2022-10-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells at J

VIB Bioimaging Core'a eğitim, destek ve cihaz parkına erişim için teşekkür ederiz. J.N., Araştırma Vakfı Flanders'tan (FWO) doktora bursu ile desteklenmektedir. J.M. grubundaki araştırmalar, bir Odysseus II Grant (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), Araştırma Vakfı Flanders'tan (FWO) bir junior research grant (G031022N), bir CRIG genç araştırmacı kavram kanıtı hibesi ve Ghent Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. P.V. grubundaki araştırmalar EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO kıdemli araştırma hibeleri (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Kansere Karşı Vakıf (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG ve GIGG konsorsiyumları ve VIB tarafından desteklenmiştir.

1. Biyotinillenmiş tiramid hazırlanması
<ol><li>Biotin-tiramidden başlayarak biyotinile tiramid hazırlayın. 10 mM'lik bir stok çözeltisi yapmak için, 1 mL DMSO içinde 3.6 mg biyotin-tiramid çözün. Kaliteyi korumak için çözünmüş ürünü -20 ° C'de alikotlarda saklayın.</li>
</ol>2. HT-29 hücrelerinin kültürde tutulması
NOT: ZBP1-eksprese HT-29, insan ZBP1'i kodlayan bir lentivektör27 ile...

<ol>
	<li>Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+necroptosis+by+post-translational+modifications.">The regulation of necroptosis by post-translational modifications.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).</li><li>Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+of+necroptotic+cell+death+signaling.">The structural basis of necroptotic cell death signaling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).</li><li>Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis:+The+Trojan+horse+in+cell+autonomous+antiviral+host+defense.">Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense.</a> Virology. 479-480, 160-166 (2015).</li><li>Nailwal, H., Chan, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necroptosis+in+anti-viral+inflammation.">Necroptosis in anti-viral inflammation.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).</li><li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+RIPK3+maintains+MLKL+in+an+inactive+conformation+prior+to+cell+death+by+necroptosis.">Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis.</a> Nature Communications. 12 (1), 6783 (2021).</li><li>Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location,+location,+location:+A+compartmentalized+view+of+TNF-induced+necroptotic+signaling.">Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling.</a> Science Signalling. 14 (668), (2021).</li><li>Koehler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+E3+prevents+sensing+of+Z-RNA+to+block+ZBP1-dependent+necroptosis.">Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis.</a> Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).</li><li>Balachandran, S., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Z-RNA+triggers+ZBP1-dependent+cell+death.">Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death.</a> Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).</li><li>Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZBP1:+Innate+sensor+regulating+cell+death+and+inflammation.">ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation.</a> Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).</li><li>Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+sensors+and+programmed+cell+death.">Nucleic acid sensors and programmed cell death.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).</li><li>Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+manipulation+of+host+cell+necroptosis+and+pyroptosis.">Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis.</a> Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+suppresses+necroptosis+in+human+cells.">Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+(HSV-1)+and+HSV-2+mediate+species-specific+modulations+of+programmed+necrosis+through+the+viral+ribonucleotide+reductase+large+subunit+R1.">Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1.</a> Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).</li><li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP1/RIP3+binding+to+HSV-1+ICP6+initiates+necroptosis+to+restrict+virus+propagation+in+mice.">RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice.</a> Cell Host &amp; Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-independent+contribution+of+ZBP1/DAI/DLM-1-triggered+necroptosis+in+host+defense+against+HSV1.">Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (8), 816 (2018).</li><li>Devos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+of+endogenous+nucleic+acids+by+ZBP1+induces+keratinocyte+necroptosis+and+skin+inflammation.">Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation.</a> The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).</li><li>Jiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Z-nucleic-acid+sensing+triggers+ZBP1-dependent+necroptosis+and+inflammation.">Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation.</a> Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).</li><li>de Reuver, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+prevents+autoinflammation+by+suppressing+spontaneous+ZBP1+activation.">ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation.</a> Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).</li><li>Jiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+averts+fatal+type+I+interferon+induction+by+ZBP1.">ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1.</a> Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).</li><li>Hubbard, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+mutation+causes+ZBP1-dependent+immunopathology.">ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology.</a> Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAR1+masks+the+cancer+immunotherapeutic+promise+of+ZBP1-driven+necroptosis.">ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis.</a> Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).</li><li>Adams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin+amplification+of+biotin+and+horseradish+peroxidase+signals+in+histochemical+stains.">Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).</li><li>Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+DNA+and+mRNA+in+situ+hybridization.">Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization.</a> Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).</li><li>Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+for+analysis+of+kinase+activity+by+intracellular+flow+cytometry.">Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry.</a> Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).</li><li>Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+mass+spectrometry+(TSA-MS)+ratio+identifies+nuclear+speckle+proteins.">Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins.</a> The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).</li><li>Samson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+for+imaging+RIPK1,+RIPK3,+and+MLKL+in+mouse+and+human+cells.">A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells.</a> Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).</li><li>De Groote, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+new+gateway-compatible+inducible+lentiviral+vector+platform+allowing+easy+derivation+of+co-transduced+cells.">Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells.</a> Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).</li><li>Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+1+ICP6+impedes+TNF+receptor+1-induced+necrosome+assembly+during+compartmentalization+to+detergent-resistant+membrane+vesicles.">Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).</li><li>Mandal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIP3+induces+apoptosis+independent+of+pronecrotic+kinase+activity.">RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity.</a> Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+Z-RNAs+induce+ZBP1-mediated+necroptosis.">Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis.</a> Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).</li><li>Garnish, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+interconversion+of+MLKL+and+disengagement+from+RIPK3+precede+cell+death+by+necroptosis.">Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis.</a> Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).</li><li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification.">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedural+requirements+and+recommendations+for+multiplex+immunofluorescence+tyramide+signal+amplification+assays+to+support+translational+oncology+studies.">Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies.</a> Cancers. 12 (2), 255 (2020).</li></ol>

Bu immünofloresan boyama protokolü, RIPK3 ve MLKL26'nın fosforilasyonu da dahil olmak üzere tespit edilmesi zor olan insan nekroptotik sinyal yolunun sinyal olaylarına duyarlılığı artırmak için tiramid sinyal amplifikasyonunun (TSA) kullanımını açıklar. Bir TSA adımının dahil edilmesi, p-RIPK3 (S227) ve p-MLKL (S358) algılama eşiğini önemli ölçüde iyileştirir ve p-MLKL (S358) gerilmesinin hassasiyetini artırır. TSA, alaycı muamele görmüş numunelerde zaten mevcut ol...

Reseptör etkileşen serin/treonin protein kinaz 3 (RIPK3) ve karışık soy kinaz etki alanı benzeri (MLKL), nekrototik hücre ölümünün merkezi düzenleyicileridir 1,2. Nekrotoz, antiviral bağışıklık ve otoinflamasyonda rol oynayan düzenlenmiş hücre ölümünün litik ve enflamatuar bir şeklidir. Virüs bulaşmış hücrelerin nekroptozu derhal virüs replikasyonunu durdurur. Nekrotoz indüksiyonunu takiben hücre lizisi, antiviral bağışıklığı uyaran hasarla ilişkili moleküler paternleri de serbest bırakır 3,4. Nekrotoz, üç yukarı akış aktive edici molekülden biriyle RIP homotipik etkileşim motifi (RHIM) aracılı etkileşimleri takiben RIPK3'ün aktivasyonu ile başlatılır: RIPK1 (TNF reseptörü 1 [TNFR1] katılımı üzerine), TIR etki alanı içeren adaptörü indükleyen interferon-β (TRIF; Toll benzeri reseptör 3 ve 4 etkileşimi üzerine) veya antiviral nükleik asit sensörü Z-DNA bağlayıcı protein 1 (ZBP1)1,2 . Nekrotoz sinyalizasyonu, RIPK3'ün otofosforilasyonu ile başlayan bir dizi fosforilasyon olayından geçer. İnsan RIPK3'ün kinaz alanı içindeki serin (S) 227'de otofosforilasyonu, MLKL ile etkileşimi sağlayarak nekroptoz için bir ön koşuldur ve yaygın olarak insan RIPK3 aktivasyonu ve nekroptotik hücre ölümü için biyokimyasal bir belirteç olarak kullanılır 1,5. Aktive edildikten sonra, RIPK3, MLKL'nin aktivasyon döngüsünü treonin (T) 357 ve S3581'de fosforile eder. Bu, MLKL konformasyonunda bir değişikliğe neden olur ve N-terminal dört sarmal demet alanının maruz kalmasına neden olur. MLKL daha sonra oligomerize olur ve hücre zarına gider, burada lipit çift katmanına maruz kalan dört sarmal demetinin yerleştirilmesiyle bir gözenek oluşturur ve sonunda hücre ölümüne yol açar 2,6.
ZBP1, Z-konformasyonunda (Z-RNA) çift sarmallı RNA da dahil olmak üzere solak Z-formu nükleik asitleri tanıyan bir antiviral nükleik asit sensörüdür. Z-RNA bağlanması, ZBP1'in N-terminusunda konumlandırılmış iki Zα-alanı aracılığıyla gerçekleşir. RNA ve DNA virüs enfeksiyonu sırasında biriken Z-RNA'nın ZBP1 7,8'i doğrudan etkilediği düşünülmektedir. Aktif ZBP1, merkezi RHIM'leri aracılığıyla RIPK3'ü işe alır ve nekroptoz 9,10 dahil olmak üzere düzenlenmiş hücre ölümünü indükler. Virüsler, ZBP1 ile indüklenen konakçı hücre nekroptozuna karşı koymak için çok sayıda kaçış mekanizması benimsemiştir11. Örneğin, ICP6 olarak bilinen ve UL39 tarafından kodlanan herpes simpleks virüsü 1 (HSV-1) ribonükleotid redüktaz alt birimi 1, RHIM'i insan hücrelerinde ZBP1 aracılı RIPK3 aktivasyonuna müdahale eden N-terminusunda barındırır12,13,14,15. ZBP1 sadece viral replikasyonu kısıtlamakla kalmaz, aynı zamanda fare çalışmaları ZBP1 aktivasyonunun enflamatuar hastalıklara neden olduğunu ve kanser bağışıklığını uyardığını göstermiştir 16,17,18,19,20,21. Bu nedenle, insan hücrelerinde ZBP1 kaynaklı nekroptoz sırasında meydana gelen sinyal olaylarını tespit eden protokoller, ZBP1'in bu süreçlerdeki rolünü değerlendirmek için değerlidir.
Katalizörlü muhabir birikimi (CARD) olarak da adlandırılan tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA), antikor bazlı immünotahlillerde algılama sınırını ve sinyal-gürültü oranını iyileştirmek için geliştirilmiştir. TSA sırasında, ilgilenilen antijeni tespit etmek için herhangi bir primer antikor kullanılabilir. Yaban turpu peroksidaz (HRP), ikincil bir antikorla birleştiğinde, hidrojen peroksit varlığında biyotinile tiramid radikallerinin lokal birikimini katalize eder. Bu aktive biyotin-tiramid radikalleri daha sonra kovalent bağlar oluşturmak için proksimal tirozin kalıntıları ile reaksiyona girer. Potansiyel tiramid-biyotin substratları antijenin kendisini, birincil ve ikincil antikorları ve komşu proteinleri içerir. Böylece, TSA tahlilin hassasiyetini önemli ölçüde artırırken, mekansal çözünürlüğünün bir kısmı kaybolur. Son bir adımda, biyotin molekülleri floresan olarak etiketlenmiş streptavidin kullanılarak tespit edilir. HRP reaksiyonu, ilgilenilen antijenin üzerinde veya yakınında birçok tiramid-biyotin molekülü biriktirir. Bu, streptavidin-florokrom bağlanma bölgelerinin sayısını büyük ölçüde arttırır, böylece tahlilin hassasiyetini büyük ölçüde arttırır (Şekil 1). Alternatif olarak, tiramid doğrudan bir florokroma bağlanabilir ve streptavidin-kuplajlı floroforlara olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Protein immünohistokimyası ve DNA / RNA in situ hibridizasyonu, TSA'nın sinyal yoğunluklarını iyileştirmek için kullanıldığı ilk yöntemler arasındaydı22,23. Daha yakın zamanlarda, TSA hücre içi akış sitometrisi24 ve kütle spektrometrisi25 ile birleştirilmiştir.
Burada, immünofloresan mikroskobu kullanılarak HSV-1 enfeksiyonu ile ZBP1'in aktivasyonu üzerine serin 227 fosforile insan RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) ve fosforile insan MLKL'sini (p-MLKL [S358]) tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. İnsan ZBP1'i kararlı bir şekilde eksprese etmek için dönüştürülen nekropotoza duyarlı HT-29 insan kolorektal adenokarsinom hücre hattı kullanıyoruz. Bu hücreler, viral RHIM (VQCG) içindeki dört çekirdek amino asidin alaninler (AAAA) ile değiştirildiği mutant bir ICP6 proteinini (HSV-1 ICP6mutRHIM) eksprese eden bir HSV-1 suşu ile enfekte oldu, böylece ICP6, ZBP1 aracılı nekroptoz 13,14,15'i bloke edemez hale getirdi. İmmün boyama26'da p-RIPK3 ve p-MLKL'ye karşı halihazırda piyasada bulunan antikorların düşük sinyal-gürültü oranı sorununun üstesinden gelmek için, insan p-RIPK3'ün (S227) sağlam bir şekilde algılanmasıyla sonuçlanan ve insan p-MLKL'nin (S358) algılama hassasiyetini bir büyüklük sırasına göre artıran bir tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) adımı (Şekil 1) gerçekleştiriyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit HRP</td>
			<td>Agilent Technologies Belgium</td>
			<td>K4002</td>
			<td>Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse DyLight 633</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>35513</td>
			<td>Secundary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 ICP0</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53070</td>
			<td>Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV-PR8 mouse serum</td>
			<td>In house production</td>
			<td>xx</td>
			<td>Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMLKL</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab187091</td>
			<td>Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pRIPK3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab209384</td>
			<td>Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophores</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>D21490</td>
			<td>To visualise the nucleus of the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>S11226</td>
			<td>To visulalise biotin molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compounds</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009</td>
			<td>Oxidising substrate, necessary for HRP activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td>SANBIO</td>
			<td>AR1068</td>
			<td>To fix/crosslink the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinyl-tyramide</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>6241</td>
			<td>To amplify signal, HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV-6</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7597</td>
			<td>BV6 IAP Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>For cell culture: to detach the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>8.0 g/L NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.4 g/L disodium salt of EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.04%</td>
			<td>In house formulation</td>
			<td></td>
			<td>1.1 g/L Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L NaH2PO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>0.2 g/L Glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>TICO</td>
			<td>FBS EU XXX</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSK&#39;840</td>
			<td>Aobious</td>
			<td>AOB0917</td>
			<td>RIPK3 kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7513</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAXblock</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>15252</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10444402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td>For cell culture, maintaining cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-&#945;</td>
			<td>In house production</td>
			<td>-</td>
			<td>Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td>To permeabilise the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11732</td>
			<td>For cell counting, used as live/dead marker at 0,1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4424</td>
			<td>For cell culture: to detach the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zVAD</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>BACE4026865.0005</td>
			<td>Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 well high glass bottom</td>
			<td>iBidi</td>
			<td>80807</td>
			<td>To culture the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Preping Balls-size medium</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71001-10</td>
			<td>To clean the objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518 F / 30 &#176;C</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>444970-9000-000</td>
			<td>To visualise the sample at high magnifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaner</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>000000-0105-200</td>
			<td>To clean the objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM880 Fast Airyscan confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To visualise the sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Office</td>
			<td>xx</td>
			<td>To process the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 9</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td>xx</td>
			<td>To analyse the data- statistical testing and graph generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Volocity</td>
			<td>xx</td>
			<td>To perform quantifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen black</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>xx</td>
			<td>To aquire and process images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen blue</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>xx</td>
			<td>To visualise images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viruses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 (mutRHIM) F strain</td>
			<td>produced by&#160; Dr. Jiahuai Han</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG&#62;AAAA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HSV-1 (WT) F strain</td>
			<td>Produced by Dr. Jiahuai Han</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV PR8</td>
			<td>in house stock</td>
			<td>in house replication</td>
			<td>IAV as a trigger for necroptosis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tyramide signal amplification for the immunofluorescent staining of zbp1-dependent phosphorylation of ripk3 and mlkl after hsv-1 infection in human cells

Kinaz Reseptörü ile etkileşime giren serin/treonin protein kinaz 3 (RIPK3) ve substrat karışık soy kinaz etki alanı benzeri (MLKL), önemli antiviral fonksiyonlara sahip hücre ölümünün enflamatuar bir formu olan nekroptozun kritik düzenleyicileridir. RIPK3'ün otofosforilasyonu, fosforilasyonu ve nekroptoz MLKL'nin gözenek oluşturan cellat proteininin aktivasyonunu indükler. Fosforile MLKL'nin hücre zarında ticareti ve oligomerizasyonu, nekrototik hücre ölümünün karakteristiği olan hücre lizisi ile sonuçlanır. Nükleik asit sensörü ZBP1, RNA ve DNA virüsleri ile enfeksiyondan sonra solak Z formundaki çift sarmallı RNA'YA (Z-RNA) BAĞLANARAK AKTIVE EDILIR. ZBP1 aktivasyonu, enfekte konakçı hücrelerin nekroptozu da dahil olmak üzere düzenlenmiş hücre ölümünü indükleyerek virüs enfeksiyonunu kısıtlar. İmmünofloresan mikroskopi, ZBP1 aracılı nekroptozun aşağı yönünde farklı sinyal basamaklarının hücre bazında görselleştirilmesine izin verir. Bununla birlikte, standart floresan mikroskobunun, insan RIPK3 ve MLKL'ye karşı mevcut ticari olarak temin edilebilen fosfo-spesifik antikorları kullanan duyarlılığı, bu belirteçlerin tekrarlanabilir görüntülenmesini engellemektedir. Burada, herpes simpleks virüsü 1 (HSV-1) ile enfekte olmuş insan HT-29 hücrelerinde serin (S) fosforile edilmiş RIPK3 (S227) ve MLKL (S358) için optimize edilmiş bir boyama prosedürünü açıklıyoruz. İmmünofloresan boyama protokolüne bir tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) adımının dahil edilmesi, S227 fosforile RIPK3'ün spesifik olarak tespit edilmesini sağlar. Dahası, TSA, S358 fosforile MLKL'nin tespitinin hassasiyetini büyük ölçüde arttırır. Birlikte, bu yöntem ZBP1 kaynaklı nekroptozun indüksiyonu sırasında bu iki kritik sinyal olayının görselleştirilmesini sağlar.

İnsan hücrelerinde MLKL fosforilasyonunun ve özellikle RIPK3 fosforilasyonunun immünofloresan tespiti teknik olarak zordur26. Burada ZBP1'in aktivasyonu üzerine insan p-RIPK3 (S227) ve p-MLKL (S358) için geliştirilmiş bir boyama protokolü sunuyoruz. Protokol, floresan sinyallerinin algılama sınırını ve hassasiyetini artırmak için bir TSA adımı içerir. Yöntemi doğrulamak için, TSA aracılı immünofloresansın hem p-RIPK3 (S227) hem de p-MLKL'nin (S358) standart dolaylı flore...

Watch this Scientific Journal Video about Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells at J

Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells

İmmünofloresan boyama sırasında tiramid sinyal amplifikasyonu, HSV-1 enfeksiyonundan sonra ZBP1 kaynaklı nekroptoz sırasında fosforile RIPK3 ve MLKL'nin hassas tespitini sağlar.

İnsan Hücrelerinde HSV-1 Enfeksiyonu Sonrası ZBP1'e Bağlı RIPK3 ve MLKL'nin İmmünofloresan Boyama İçin Timamid Sinyal Amplifikasyonu

The kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) and its substrate mixed lineage kinase domain-like (MLKL) are critical ...

Nekrotoz indüksiyonu sırasında iki önemli sinyal olayı olan fosforile RIPK3 ve MLKL'nin sağlam bir şekilde görselleştirilmesi teknik olarak zor olmuştur. Sunulan tiramid amplifikasyon protokolü, bu iki molekülün hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Sinyal amplifikasyon adımı, fosforile RIPK3 ve MLKL'nin sağlam ve tekrarlanabilir bir şekilde algılanmasını sağlayarak algılama eşiğini düşürür.90.000 ZBP1 eksprese eden HT-29 hücrelerini tam güçte McCoy's 5A ortamında bir santimetre karelik bir yüzey alanı kuyu plakasında tohumlamaya başlayın ve üst düzey mikroskopiye izin verin. Kuyu başına 200 mikrolitrelik bir uç hacim kullanın. Hücreleri gece boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin.Hücreler% 70 ila% 80 akıcılığa ulaştığında, hücreleri önceden ısıtılmış 200 mikrolitre, tam mukavemetli McCoy'un herpes simpleks virüsü içeren 5A ortamını enfekte eder ve bir jant mutant ICP6'yı beş enfeksiyon çokluğunda kodlar. Nekropsi indüklemek için hücreleri dokuz saat boyunca virüsle inkübe edin. Nekrotoz indüksiyonu için pozitif bir kontrol olarak, hücreleri 200 mikrolitre önceden ısıtılmış nekroptozise neden olan kokteyl ile dört saat boyunca uyarın.Negatif bir kontrol olarak, RIPK3 kinaz aktivitesini inhibe etmek için 37 santigrat derecede önceden ısıtılmış 22 mikrolitre 10 mikromolar GSK840 ekleyin. Bu inhibitörü, tedavi edilmemiş bir durumda ve serin 227'nin otofosforilasyonunu önlemek için nekroptoz stimülasyonundan sonra dahil edin. Hücreleri sabitlemek için ortamı çıkarın ve hücreleri 200 mikrolitre PBS ile yıkayın.Daha sonra PBS'yi çıkarın ve oda sıcaklığında dengelenmiş 150 mikrolitre% 4 paraformaldehit ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Fiksasyondan sonra,% 4'lük paraformaldehiti çıkarın ve hücreleri 200 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın.Numuneler, bir sonraki işleme kadar gece boyunca dört santigrat derecede PBS'den fazla saklanabilir. PBS'yi plakadan çıkarın ve hücreleri 100 mikrolitre geçirgenlik tamponu ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca eğilebilir bir laboratuvar çalkalayıcısında inkübe edin. Kuluçkadan sonra, geçirgenlik tamponunu çıkarın ve hücreleri 100 mikrolitre yıkama tamponu ile yıkayın.Görüntüleme odasını, yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında beş dakika boyunca yıkama tamponu ile inkübe edin. Birincil antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için, plakayı yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında iki saat boyunca oda sıcaklığında 100 mikrolitre bloke edici ortam ile inkübe edin. Daha sonra, kuyucukları 100 mikrolitre yıkama tamponu ile üç kez, yatırılan bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında beş dakikalık inkübasyonla yıkayın.Yıkama tamponunu çıkardıktan sonra, görüntüleme odasına 100 mikrolitre birincil antikor ekleyin. Tiramit sinyal amplifikasyonunun potansiyel arka planını görselleştirmek ve maskeleme eşiğini ayarlamak için birincil antikor içermeyen bir durum içerdiğinden emin olun. Odayı bir gecede dört santigrat derecede inkübe edin.Birincil antikor karışımını çıkarın ve kuyucukları, eğilebilir bir laboratuvar çalkalayıcısında oda sıcaklığında beş dakikalık inkübasyonla 100 mikrolitre yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Yıkama tamponunu çıkardıktan sonra, hücreleri 100 mikrolitre HRP etiketli sekonder antikor ile inkübe edin ve eğilebilir bir laboratuvar çalkalayıcısında 30 dakika boyunca çoğaltılacak birincil antikor türlerini tanıyın. Antikor inkübasyonu sırasında, biyotinile tiramid karışımını hazırlayın.HRP'nin enzimatik aktivitesini tetiklemek için, kullanmadan önce TSA tamponuna taze olarak oksitleyici bir substrat ekleyin. Daha sonra, optimize edilmiş seyreltmeyi kullanarak hazırlanan TSA tamponundaki biyotinillenmiş tiramid seyreltin. HRP etiketli sekonder antikor ile inkübasyondan sonra, kuyucukları üç kez, eğilebilir bir laboratuvar çalkalayıcısında beş dakikalık inkübasyonla yıkama tamponu ile yıkayın.Yıkama tamponunu kuyudan çıkardıktan sonra, seyreltilmiş biotin-tiramid kuyuya 100 mikrolitrelik bir uç hacme ekleyin. Oda sıcaklığındaki reaksiyonu eğilebilir bir laboratuvar çalkalayıcısında 10 dakika boyunca inkübe edin, ardından üç yıkama tamponu yıkayın. İkincil antikor, birleştirilmiş streptavidin ve nükleer leke ve yıkama tamponunu içeren boyama karışımını hazırlayın.Yıkama tamponunu çıkarın ve plakayı 100 mikrolitre boyama karışımı ile oda sıcaklığında bir saat boyunca eğilebilir bir laboratuvar çalkalayıcısında inkübe edin. Bu adımdan itibaren görüntüleme odalarını ışıktan koruyun. Boyama işleminden sonra, art arda iki kez yıkama tamponu ile yıkayın ve kuyucukları PBS ile iki kez durulayın.Görüntülemeye kadar lekelenmeyi korumak için PBS'yi aşan örnekleri dört santigrat derecede saklayın. Görüntüleme odası artık konfokal mikroskopta görselleştirilmeye hazırdır. Tiramit sinyal amplifikasyonunun dahil edilmesi, herpes simpleks virüsünün sitosolünde serin 227'de fosforile edilmiş RIPK3'ün sağlam bir şekilde tespit edilmesini sağladı ve bir jant mutant ICP6 ile enfekte olmuş hücreleri kodladı.Hassas algılama için %2'lik bir lazer gücü yeterliydi. Standart dolaylı immünofloresansta, fosfo-RIPK3'ün tespiti için daha yüksek bir lazer gücü yetersiz kalmıştır. Üç boyutlu Z-yığını görüntülerinin nicelleştirilmesinde, enfekte olmuş hücreler, sahte tedavi edilen hücrelere göre fosforile edilmiş RIPK3 için pozitif voksellerin yaklaşık 20 kat arttığını gösterdi.Vahşi tip herpes simpleks virüsü bir enfekte hücrenin sahte tedavi edilen hücrelere kıyasla artan fosfo-RIPK3 boyaması, ICP6'nın jant alanının serin 227'de RIPK3 fosforilasyonunu tamamen bloke edemediğini göstermiştir. GSK840, RIPK3'ün kinaz alanına bağlanır ve ZBP1 aktivasyonu üzerine serin 227'de RIPK3 fosforilasyonunu önler ve tiramid sinyal amplifikasyonu aracılı fosfo-RIPK3 algılama yönteminin özgüllüğünü doğrular. Alaycı muamele görmüş hücreler, serin 358'de MLKL fosforilasyonunun hafif noktalanmış sitozolik boyanmasında düşük gösterirken, enfekte olmuş hücrelerin sitozol, çekirdek ve plazma zarında güçlü boyama tespit edildi.Standart dolaylı immünofloresan, enfekte hücrelerde fosfo-MLKL sinyalinin spesifik tespiti için% 40 lazer gücü gerektiriyordu. Buna karşılık, tiramid sinyal amplifikasyonu, fosfo-MLKL'nin algılama hassasiyetini arttırdı, böylece gerekli lazer gücünü% 6'ya düşürdü3D Z-yığını görüntü niceliği, standart yöntemi kullanarak yedi kat artışa kıyasla, tiramid sinyal amplifikasyonu kullanarak fosfo-MLKL için pozitif voksel sayısında yaklaşık 90 kat artış gösterdi ve fosfo-MLKL için gelişmiş algılama eşiği ve duyarlılığı gösterdi. Herpes simpleks virüsü birine benzer şekilde, influenza A virüsü enfeksiyonu ZBP1'e bağımlı nekroptozu tetikledi.Tiramit sinyal amplifikasyonu, nekropsitozu gösteren fosfo-RIPK3 ve fosfo-MLKL'nin sağlam bir şekilde algılanmasına izin verdi. Konfokal boyamayı yorumlamak için, birkaç boyama kontrolünün dahil edilmesi gerekir. Bu, birincil koşul olmadan, tek lekeler ve pozitif bir kontrol gerektirir.Bu protokolü uyarlayarak, sıralı TSA kullanılarak birden fazla hedef güçlendirilebilir. Bu, aynı hücre içinde fosforile RIPK3 ve MLKL'nin tespit edilmesini sağlayacaktır. Nekrotoz biyobelirteçlerinin hassas tespiti, yürütülen ZBP1'e bağımlı hücre ölüm yollarının hala nekroptoz, apoptoz veya pirotoksoz olarak doğrulanması gereken otoinflamasyon veya virüs enfeksiyonu üzerine devam eden ZBP1 araştırmaları için anlayışlı olabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Alloantigen-specific Anergy in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells by Alloantigen Stimulation with Co-stimulatory Signal Blockade

Co-uyarıcı Sinyal Abluka Alloantigen Uyarım İnsan periferik kan mononükleer hücreleri içinde Alloantigen özel anerji indüksiyonu

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) offers the best chance of cure for many patients with congenital and acquired hematologic ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Seçimi Plasmodium falciparum İnsan Beyninin endotel hücreleri Cytoadhesion için Parazitler

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Hücre-kaderi ardından<em&gt; E. coli</em&gt; Faj Lambda tarafından Enfeksiyon Sonrası

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

Primer insan T hücrelerinin piggyBac Transposon Sistem Modifikasyon

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periyodik Asit Schiff Boyama ile periferik kan mononükleer hücreleri glikojen algılama

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

tespiti için Liyofilize Döngü aracılı İzotermal Amplifikasyon Reaktifler Gelişimi<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Sitotoksik değerlendirilmesi ve insan hassas kesim akciğer dilimleri maddelerin etkileri Immunomodulatory

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue

Kan damarları ve sinir lifleri yağ dokusu içinde Co boyama

Recent studies have highlighted the critical role of angiogenesis and sympathetic innervation in adipose tissue remodeling during the development of ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Sürekli Akışta Birincil İnsan Endotel Hücrelerinin Pnömokok Enfeksiyonu

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...