Nosso protocolo nos permite medir diretamente o metabolismo pós-prandial na linfa mesentérica fluida. Isso é poderoso porque podemos determinar quantitativamente o movimento de nutrientes do intestino delgado para a linfa. E podemos medir citocinas, lipídios dietéticos, outros componentes da dieta e linfócitos.
Esta técnica pode nos ajudar a dissecar a dinâmica dos lipídios dietéticos que se movem para a linfa, a síntese e secreção de quilomícrons. O modelo de um dia apresentado aqui tem várias vantagens. Primeiro, reduz o tempo experimental.
Em segundo lugar, reduz o estresse animal. Aumenta a sobrevivência animal. E, no geral, diminui o número experimental.
Demonstrando nossa técnica hoje estará nosso Cirurgião de Laboratório Sênior, Sr. Nick Dedousis. E nosso cientista de pesquisa, Dr. Lihong Teng. Depois de preparar o rato para a cirurgia, segure a pele com uma pinça e faça uma incisão abdominal mediana com uma pequena tesoura.
Em seguida, corte em direção ao esterno e até a gordura inguinal. Usando o afastador, mova as vísceras peritoneais para fora do caminho até que o ducto linfático esteja visível. Usando uma ponta Q embebida em soro fisiológico, mova o fígado para o lado superior direito do corpo e os intestinos e estômago para a esquerda do animal.
Em seguida, expor a artéria mesentérica superior e o ducto linfático intestinal esticando o duodeno transversalmente para a esquerda. Prepare um tubo de cânula de 30 a 40 centímetros de comprimento inserindo uma agulha romba. Em seguida, usando uma seringa de um mililitro, lave uma pequena quantidade de heparina através do tubo e corte um bisel na ponta da tubulação da cânula usando tesoura.
Em seguida, faça uma incisão rasa e o ducto linfático para usar tesoura de íris conforme descrito no manuscrito. Segure a tubulação da cânula com um par de pinças finas e insira suavemente o bisel da ponta no duto. Como o ducto linfático é frágil, use uma gota de cianoacrilato para colar a cânula linfática na linfa mesentérica em vez de amarrar o cateter com uma sutura.
Agora, usando uma agulha de calibre 18, puncione um orifício através da região pilórica do estômago posterior ao esfíncter pilórico e insira o tubo de infusão duodenal no estômago um a dois milímetros além do esfíncter pilórico no duodeno. Em seguida, prenda o tubo ao estômago com uma ligadura de corda em bolsa usando uma sutura de seda 5/0 e selada com uma gota de cola de cianoacrilato para evitar vazamentos. Iniciar a infusão intraduodenal de glicose a 5% e solução fisiológica a 0,9%.
Substitua os órgãos na cavidade do corpo e suture a incisão da linha média. Coloque o rato suavemente num dispositivo de contenção aconchegante. Fornecer aos ratos uma infusão intraduodenal contínua de soro fisiológico e glicose por uma hora.
Verifique o fluxo linfático na cânula e comece a ordenhar a cânula linfática para manter o fluxo linfático. Realizar a infusão lipídica clássica de um bolus de emulsão lipídica de 0,3 mililitro através do tubo de infusão intraduodenal. Em seguida, troque a infusão de volta para glicose a 5% e soro fisiológico a 0,3 mililitros por hora continuamente até o final do experimento.
Coletar as amostras de linfa e pré-pesar micro tubos de centrífuga por 60 minutos e manter a linfa no gelo. Pesar os tubos pela segunda vez para estabelecer o peso da linfa secretada a cada 60 minutos. Colete o estômago, o ceco e o cólon e coloque cada órgão em um tubo de vidro de 15 mililitros.
Divida o intestino delgado em três ou quatro segmentos. Corte-o longitudinalmente e colete o conteúdo luminal enxaguando o tecido com dois a três mililitros de PBS frio. Remover a mucosa intestinal composta por células epiteliais e lâmina própria associada da camada muscular raspando cada corte em dois a três mililitros de PBS frio com um tweezer curvo.
Coloque todos os tecidos, os isolados luminal e mucoso e a camada muscular em tubos de vidro. A concentração de triglicerídeos na linfa aumentou em resposta a um bolus intraduodenal de 300 microlitros de SMOFlipid. O pico de concentração de triglicerídeos é atingido em duas a três horas após o bolus e diminui progressivamente ao longo das seis horas.
A taxa de fluxo linfático aumenta a partir do tempo zero de infusão em bolus até o final do experimento. Um dos principais objetivos desse protocolo foi reduzir o estresse dos animais, aumentar a taxa de sobrevida e diminuir o tempo de anestesia. Para conseguir isso, trocamos as gaiolas de contenção Bollman por aconchegos, e adicionamos umidade, calor e reposição de líquidos.
Nosso protocolo de fístula manca de um dia nos permite medir em tempo real, in vivo, a dinâmica de absorção lipídica. Também nos permite estudar o crosstalk de órgãos intestinais, metabolismo, absorção de nutrientes dietéticos e fenótipos imunológicos.
