Name: flow cytometry-based quantification and analysis of myocardial b-cells
Uploaded: 2022-08-17T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells at JoVE.com

Denne undersøgelse blev finansieret af NHLBI-tilskud 5K08HLO145108-03 og 1R01HL160716-01 tildelt Luigi Adamo.
Aurora Flow Cytometer, der blev brugt til at udvikle denne undersøgelse, blev finansieret af NIH Grant S10OD026859. Vi anerkender støtten fra JHU Ross Flow Cytometry Core.

Alle eksperimenter beskrevet i dette manuskript blev udført med godkendelse af IACUC ved Johns Hopkins University School of Medicine.
1. præparater
<ol><li>Forbered FACS-bufferen som beskrevet i tabel 1.</li>
	<li>Sørg for, at der er nok CO2 til at aflive dyrene.</li>
	<li>Forbered dissektionsrummet (placer bænkpuden og placer tape og dissektionsværktøjer i nærheden).</li>
	<li>Mærk de 15 ml rør, læg 3 ml HBSS med calcium og magnesium i ...

<ol>
	<li>Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+B+lymphocytes+in+cardiovascular+disease.">The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease.</a> Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).</li><li>Gowans, J. L., Knight, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+route+of+re-circulation+of+lymphocytes+in+the+rat.">The route of re-circulation of lymphocytes in the rat.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).</li><li>Kunkel, E. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+the+tissue-specific+migration+of+lymphocytes.">Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes.</a> Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+controlling+homeostatic+recirculation+and+tissue-specific+trafficking+of+lymphocytes.">Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).</li><li>Rocha-Resende, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+myocardial+B+cells+mirror+changes+in+B+cells+associated+with+different+organs.">Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs.</a> JCI Insight. 5 (16), (2020).</li><li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+B+cells+are+a+subset+of+circulating+lymphocytes+with+delayed+transit+through+the+heart.">Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart.</a> JCI Insight. 5 (3), 139377 (2020).</li><li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+subsets+of+cardiac+B+lymphocytes+improves+cardiac+function+after+acute+injury.">Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury.</a> JCI Insight. 3 (11), (2018).</li><li>Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+modulate+the+expression+of+MHC-II+on+cardiac+CCR2(-)+macrophages.">B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).</li><li>Zouggari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+trigger+monocyte+mobilization+and+impair+heart+function+after+acute+myocardial+infarction.">B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).</li><li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-10-producing+B+cells+are+enriched+in+murine+pericardial+adipose+tissues+and+ameliorate+the+outcome+of+acute+myocardial+infarction.">IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).</li><li>Heinrichs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+mobilizes+a+distinct+B-cell+subset+through+a+CXCL13-CXCR5-dependent+mechanism.">The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism.</a> Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splenic+marginal+zone+B+lymphocytes+regulate+cardiac+remodeling+after+acute+myocardial+infarction+in+mice.">Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice.</a> Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).</li><li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+dynamics+of+cardiac+immune+cell+accumulation+following+acute+myocardial+infarction.">Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).</li><li>Iwata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+against+the+second+extracellular+loop+of+beta(1)-adrenergic+receptors+induces+beta-adrenergic+receptor+desensitization+and+myocardial+hypertrophy+in+vivo.">Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo.</a> Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).</li><li>Jahns, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+a+beta+1-adrenergic+receptor-directed+autoimmune+attack+as+a+cause+of+idiopathic+dilated+cardiomyopathy.">Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).</li><li>Christ, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+against+the+beta1+adrenoceptor+from+patients+with+dilated+cardiomyopathy+prolong+action+potential+duration+and+enhance+contractility+in+isolated+cardiomyocytes.">Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).</li><li>Jane-wit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenergic+receptor+autoantibodies+mediate+dilated+cardiomyopathy+by+agonistically+inducing+cardiomyocyte+apoptosis.">Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis.</a> Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).</li><li>Ludwig, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+autoantibody-induced+pathology.">Mechanisms of autoantibody-induced pathology.</a> Frontiers in Immunology. 8, 603 (2017).</li><li>Haudek, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor+engagement+mediates+differentiation+of+cardiac+fibroblast+precursor+cells.">Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).</li><li>Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc(gamma)+receptors+IIa+on+cardiomyocytes+and+their+potential+functional+relevance+in+dilated+cardiomyopathy.">Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy.</a> Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+natural+IgM+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury.">The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+specific+self-reactive+IgM+antibody+that+initiates+intestinal+ischemia/reperfusion+injury.">Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).</li><li>Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+ADP-ATP+carrier--an+autoantigen+in+myocarditis+and+dilated+cardiomyopathy--impair+cardiac+function.">Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function.</a> Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).</li><li>Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+epitope+spreading+is+a+critical+step+for+the+switch+from+C-protein-induced+myocarditis+to+dilated+cardiomyopathy.">B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy.</a> The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).</li><li>Caforio, A. L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+state+of+knowledge+on+aetiology,+diagnosis,+management,+and+therapy+of+myocarditis:+a+position+statement+of+the+European+Society+of+Cardiology+Working+Group+on+Myocardial+and+Pericardial+Diseases.">Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases.</a> European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues.">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Horckmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericardial+adipose+tissue+regulates+granulopoiesis,+fibrosis+and+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction.</a> Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Bajpai, G., Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+macrophage+subsets+and+stromal+cells+from+human+and+mouse+myocardial+specimens.">Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60015 (2019).</li><li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes.">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li><li>Coffman, R. L., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B220:+a+B+cell-specific+member+of+th+T200+glycoprotein+family.">B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family.</a> Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).</li><li>Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+B+cell+development+in+the+fetus+and+adult.">B-1 B cell development in the fetus and adult.</a> Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).</li><li>Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+B+cells+in+cardiomyopathy+and+heart+failure.">The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure.</a> Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).</li><li>Zhao, T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rituximab+in+patients+with+acute+ST-elevation+myocardial+infarction:+an+experimental+medicine+safety+study.">Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).</li><li>Kushnir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B2+but+not+B1+cells+can+contribute+to+CD4++T-cell-mediated+clearance+of+rotavirus+in+SCID+mice.">B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice.</a> Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).</li></ol>

En voksende mængde beviser indikerer, at B-celler spiller en vigtig rolle i forbindelse med myokardiefysiologi og myokardieombygning / tilpasning til skade 7,8,9,10,11,12,13,36. Flowcytometri er et fremragende værktøj til at studere immuncellepopulatione...

B-lymfocytter er højt specialiserede immunceller, der spiller en vigtig rolle i både adaptive og medfødte immunresponser1. Der er to hovedpopulationer af B-celler: en mindre population af B1-celler, der for det meste produceres i embryonalt liv, og en overvejende population af B2-celler, der produceres i voksenlivet i knoglemarven1. Efter modning i knoglemarven migrerer B-celler til primære og sekundære lymfoide organer. Derfra recirkulerer de kontinuerligt mellem lymfoide organer, der rejser gennem blodkar og lymfekar2. B-celler udtrykker specifikke antistoffer på deres overflade, som fungerer som receptorer. Når B-celler støder på et antigen, der binder til deres receptor, kan et aktiverende signal udløses. Aktiverede B-celler migrerer enten til det væv, hvor antigenet blev fundet, eller går tilbage til knoglemarven, hvor de kan modnes til antistofproducerende plasmaceller 3,4.
For nylig er det blevet værdsat, at hjertet har en betydelig population af B-celler. Undersøgelser af gnavere har vist, at B-celler koloniserer hjertet tidligt under embryonal udvikling5, og at myokardieassocierede B-celler for det meste er intravaskulære, naive B2-celler klæbet til endotelet6,7, med en lille procentdel af B1-celler7. Der er stadig mange områder med usikkerhed, men de tilgængelige data indikerer, at B-celler spiller en vigtig rolle både i det naive hjerte og i forbindelse med myokardietilpasning til skade.
Undersøgelser i det naive murinhjerte har vist, at myokardie B-celler ved baseline for det meste er placeret i det intravaskulære rum, klæbet til endotelet (>95% af murine hjerte B-celler viste sig at være placeret i det intravaskulære rum). Disse B-celler viste sig at have genekspressionsmønstre, der adskiller sig fra cirkulerende B-celler isoleret fra det perifere blod. Analyse af naive hjerter fra dyr uden B-celler og syngeneiske kontroller viste, at dyr, der manglede B-celler, havde mindre hjerter og højere udstødningsfraktion6. Alt dette tyder på, at B-celler kan modulere myokardievækst og / eller myokardiefunktion, og at ikke kun interstitielle, men også intravaskulære B-celler kan være ansvarlige for sådanne observationer. B-celler viste sig også at modulere fænotypen af myokardieresidente makrofager8.
Flere undersøgelser har vist, at B-celler spiller en vigtig rolle i forbindelse med myokardietilpasning til skade 8,9,10,11,12,13. B-celler akkumuleres forbigående i det skadede hjerte, sandsynligvis gennem en CXCL13-CXCR5-afhængig mekanisme11,13. Derfra fremmer B-celler negativ hjerteremodellering gennem flere mekanismer, der inkluderer cytokinmedieret monocytrekruttering 9,12. Derudover kan B-celler producere antistoffer mod hjerteproteiner, der kan fremme udvidelsen af hjerteskader og negativ hjerteremodellering gennem flere mekanismer 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B-celler kan også udøve beskyttende virkninger på det skadede hjerte gennem udskillelsen af IL-1010.
Efterhånden som antallet af grupper, der undersøger B-cellernes rolle i det naive og skadede hjerte, vokser, bliver det mere og mere vigtigt at definere fælles protokoller for korrekt at kvantificere og vurdere myokardie-B-celler og dermed undgå uoverensstemmelser, der allerede er begyndt at dukke op i litteraturen. Indtil videre er B-celler faktisk både rapporteret at være en af de mest udbredte immunceller i gnaverhjertet7 og at være til stede med en markant lavere forekomst end myeloide celler 26,27 eller at være ret sjældne 28. Tilsvarende har flere grupper beskrevet, at antallet af myokardie-B-celler stiger efter akut iskæmisk myokardieskade 7,9,13, men en gruppe rapporterede ingen ændringer i antallet af B-celler i det skadede myokardium29. Undersøgelser af hjerteimmunceller giver sjældent detaljer om perfusionsbetingelser, og der er ingen konsensus om fordøjelsesbetingelserne. Da en stor del af B-cellerne i gnaverhjertet er intravaskulære, og ekstraktion af immunceller fra myokardiet er stærkt afhængig af den anvendte fordøjelsesmetode, kan de forskelle, der rapporteres i litteraturen, være resultatet af forskelle i organperfusion og vævsfordøjelse.
Præsenteret her er en detaljeret metode til flowcytometribaseret kvantificering af murinmyokardie B-celler, der maksimerer udbyttet af B-cellegendannelse ved at optimere perfusions- og fordøjelsesbetingelser og tillader diskrimination af intravaskulære vs. ekstravaskulære myokardiale B-celler6. Denne protokol er en tilpasning og optimering af andre lignende protokoller, der skelner mellem intravaskulære og interstitielle immunceller 28,30,31.
I denne protokol standardiserer vi myokardieperfusion for at eliminere B-celler, der flyder i det intravaskulære rum uden at fjerne biologisk relevante B-celler, der klæber til det mikrovaskulære endotel. Ved at bygge videre på tidligere protokoller, der har beskrevet brugen af intravenøs injektion af antistoffer til at skelne intravaskulære fra interstitielle immunceller32, og drage fordel af det faktum, at B-celler udtrykker overflademarkøren B22033, demonstrerer vi, hvordan man skelner mellem intravaskulære vs. ekstravaskulære myokardie-B-celler gennem intravaskulær injektion af et B220-specifikt antistof umiddelbart før dyreofring og hjerteperfusion. Denne protokol er relevant for forskningen fra enhver videnskabsmand, der er interesseret i at inkludere analysen af myokardiale B-celler i det naive og skadede hjerte. Den udbredte implementering af denne protokol vil reducere uoverensstemmelser mellem forskergrupper, vil muliggøre analyse af ændringer i de intravaskulære og ekstravaskulære myokardie-B-cellepuljer og dermed styrke udviklingen af opdagelser inden for hjerteimmunologi.
Sammenfattende repræsenterer protokollen en optimeret arbejdsgang til at kvantificere og analysere myokardiale B-celler via flowcytometri og samtidig skelne mellem celler placeret i det ekstravaskulære rum og det intravaskulære rum.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody</td>
			<td>101222</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100 &#181;g 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 &#181;m, Blue</td>
			<td>QBIAP303</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube</td>
			<td>1605-0000</td>
			<td>SealRite, USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Injection, USP</td>
			<td>114-055-101</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>0.90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>SealRite, USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11213810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11267810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free</td>
			<td>430052</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Way Stop Valve, Polycarbonate</td>
			<td>SVPT951</td>
			<td>ECT Manufacturing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td>T48402</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11208810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Way Stop Valve, Polycarbonate</td>
			<td>SVPT953</td>
			<td>ECT Manufacturing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style</td>
			<td>352054</td>
			<td>Falcon, a Corning Brand</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free</td>
			<td>430290</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63</td>
			<td>5810759005</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62</td>
			<td>22638289</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 &#8211; 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62</td>
			<td>22638246</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil 12 in x 75&#39; Roll .0007</td>
			<td>UPC 109153</td>
			<td>Reynolds Wrap</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Induction Chamber - Mouse</td>
			<td>RWD-AICMV-100</td>
			<td>Conduct Science</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL</td>
			<td>309626</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2&#34; 100-Pack</td>
			<td>CMD 2613</td>
			<td>Brandzig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody</td>
			<td>115537</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 &#181;m, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile</td>
			<td>T9009</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Dioxide USP E CGA 940&#160;</td>
			<td>CD USPE</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL</td>
			<td>UX-34502-46</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 2</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector brass chrome plated 1/4&#34; female NPT x 1/4&#34; barb</td>
			<td>Y992611-AG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytek Aurora Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td>Cytek Biosciences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP</td>
			<td>M-08-12</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I - 40,000 U</td>
			<td>D4527</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypet&#160;3 - Electronic Pipette Controller</td>
			<td>4430000018</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Balance, AX223/E</td>
			<td>30100606</td>
			<td>Ohaus Corp.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes</td>
			<td></td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.1</td>
			<td></td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100)</td>
			<td>Z740287</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]</td>
			<td>14025076</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>H3506</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostats, Straight</td>
			<td>13018-14</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL</td>
			<td>302831</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940</td>
			<td>M1-940-PG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McKesson Underpads, Moderate</td>
			<td>4033-CS150</td>
			<td>McKesson</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navigator Multi-Purpose Portable Balance</td>
			<td>NV2201</td>
			<td>Ohaus Corp.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]</td>
			<td>10010023</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody</td>
			<td>103208</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>200 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>103132</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100 &#181;g 500 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene</td>
			<td>FB0875711YZ</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02</td>
			<td>M08-1</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator</td>
			<td>LED-6W</td>
			<td>AmScope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm)</td>
			<td>305122</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO)</td>
			<td>553141</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company Biosciences</td>
			<td>0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 4.1.1</td>
			<td></td>
			<td>The R Foundation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>9501250000</td>
			<td>Accutec Blades Inc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet</td>
			<td>Y12244A320-AG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets</td>
			<td>Rotor A-4-62</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma label tape</td>
			<td>L8394</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroFlo 3.0.0</td>
			<td></td>
			<td>Cytek Biosciences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8&#34; Hose Barb; 1/EA</td>
			<td>MTLL230-6005</td>
			<td>Spex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8&#34; ID x 3/16&#34; OD x 1/32&#34; Wall x 50&#39; Long</td>
			<td>CG-730-003</td>
			<td>Excelon Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe PP/PE without needle, 3 mL</td>
			<td>Z683566</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>55-1199 (95-240)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500</td>
			<td>9371W13</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rack, 12&#160;positions, 6 for 5.0&#160;mL and 15&#160;mL tubes and 6 for 25&#160;mL and 50&#160;mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable</td>
			<td>30119835</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rack, 12&#160;positions, for 5.0&#160;mL and 15&#160;mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable</td>
			<td>30119827</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. &#215; O.D. 1/4 in. &#215; 3/8 in.</td>
			<td>T8913 (Millipore Sigma)</td>
			<td>Tygon, Saint-Gobain</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Scientific Industries, Inc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips</td>
			<td>89259-946</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4&#189;&#34;</td>
			<td>82027-578</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I</td>
			<td>12620-946</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>423102</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry-based quantification and analysis of myocardial b-cells

En voksende mængde beviser viser, at B-lymfocytter spiller en vigtig rolle i forbindelse med myokardiefysiologi og myokardietilpasning til skade. Litteraturen rapporterer imidlertid kontrasterende data om forekomsten af myokardie-B-celler. B-celler er rapporteret at være både blandt de mest udbredte immunceller i gnaverhjertet eller at være til stede, men med en markant lavere forekomst end myeloide celler, eller at være ret sjældne. Tilsvarende har flere grupper beskrevet, at antallet af myokardie-B-celler stiger efter akut iskæmisk myokardieskade, men en gruppe rapporterede ingen ændringer i antallet af B-celler i det skadede myokardie. Implementering af en delt, reproducerbar metode til vurdering af forekomsten af myokardiale B-celler er afgørende for at harmonisere observationer fra forskellige forskningsgrupper og dermed fremme udviklingen af undersøgelsen af B-celle myokardieinteraktioner. Baseret på vores erfaring stammer de tilsyneladende kontrasterende observationer, der er rapporteret i litteraturen, sandsynligvis fra det faktum, at murine myokardie B-celler for det meste er intravaskulære og forbundet med det mikrovaskulære endotel. Derfor er antallet af B-celler, der genvindes fra et murinhjerte, udsøgt følsomt over for de perfusionsbetingelser, der anvendes til at rense organet og til den anvendte fordøjelsesmetode. Her rapporterer vi en optimeret protokol, der tager højde for disse to kritiske variabler på en bestemt måde. Denne protokol muliggør reproducerbar, flowcytometribaseret analyse af antallet af murine myokardie-B-celler og giver forskere mulighed for at skelne ekstravaskulære vs. intravaskulære myokardie-B-celler.

Når erhvervelsen er afsluttet, og alle hændelser er indsamlet, skal dataene analyseres i henhold til standard flowcytometripraksis. Analysens fokus vil variere afhængigt af det individuelle mål for hvert eksperiment. I dette tilfælde blev kvantificering af intravaskulære og ekstravaskulære B-celler forfulgt, og det blev udtrykt som antallet af celler pr. Mg væv.
Når du bruger et spektralcytometer, anbefales det at starte analysen med en indledende gating for at fjerne snavs med størr...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells at JoVE.com

Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells

Her rapporterer vi en protokol til kvantificering og differentiering af myokardie B-lymfocytter baseret på deres placering i det intravaskulære eller endotelrum ved hjælp af flowcytometri.

Flowcytometribaseret kvantificering og analyse af myokardie-B-celler

A growing body of evidence shows that B-lymphocytes play an important role in the context of myocardial physiology and myocardial adaptation to injury. ...

Litteraturen rapporterer kontrasterende data om forekomsten af myokardiale B-celler. Dette skyldes sandsynligvis variation i perfusions- og fordøjelsesteknikker. Vores protokol muliggør reproducerbar flowcytometribaseret analyse på myokardie-B-celler.Denne teknik maksimerer genoprettelsesudbyttet af B-celler og reducerer variabiliteten i flowcytometritællinger blandt B-celler og andre populationer fra hjerteprøver. Denne optimerede fordøjelses- og isoleringsmetode kan let ændres til at implementere et udvidet antistofpanel til at studere forskellige immuncelletyper i hjertet. Protokollen kan også anvendes på andre organer, såsom lunge eller lever, for at studere B-celler forbundet med disse organer.Til at begynde med vejer en 12 uger gammel hanmus. Læg en 310-cc insulinsprøjte med 100 mikroliter B220-antistofopløsningen. Injicer det fortyndede B220-antistof ved retro-orbital injektion og fortsæt straks til organhøstning og perfusion.Efter eutanasi skal du holde musens hud med tang i det epigastriske område. Lav en to millimeter åbning i huden ved hjælp af en saks og brug tangen til at skrælle huden væk for at afsløre fascialaget. Skær ved epigastrium gennem fascia og peritoneum.Klem xiphoidprocessen ved hjælp af hæmostatiske tang. Lav et lodret snit gennem brystvæggen på niveau med midtklavikulær linje på hver side og løft den forreste brystvæg for at afsløre mediastinumindholdet. Hold aorta sikkert bagfra ved hjælp af tang.Indfør sprøjtenålen i hjertets spids. Perfuseret med tre ml HBSS med en hastighed på tre ml pr. Minut. Skær aorta og fjern hjertet.Vask hjertet i petriskålen med HBSS. Væg det isolerede hjerte og noter vægten i milligram. Hak hjertet ved stuetemperatur i små stykker med et blad.Hjertestykkerne skal være omkring 1,5 millimeter i størrelse. Mål massen af hjertevæv ved hjælp af en balance og læg 60 milligram af det hakkede hjerte, der skal fordøjes i et 15 ml rør på is med tre ml HBSS. Gentag denne proces for en mus, der ikke modtog B220-antistofinjektionen, og læg den i røret med tre ml HBSS-mærket referencekontrolvæv.Tilsæt enzymer til hvert rør, der indeholder hakket væv. Tilsæt 0,5 mikroliter pr. milligram DNase I, en 0,5 mikroliter pr. milligram collagenase II og 0,2 mikroliter pr. milligram hyaluronidase. Anbring fordøjelsesreaktionen i rysteren i 30 minutter ved 300 rotationer pr. Minut.Rør placeres i rysteren i en lille vinkel, ca. 25 graders hældning. Tilsæt syv ml HBSS til hvert af 15 ml reaktionsrørene og centrifuger ved 250 G i fem minutter ved fire grader Celsius. Efter dekantering af supernatanten resuspenderes hver pellet i fem ml ACK-lysisbuffer.Inkuber i fem minutter ved stuetemperatur. Efter tilsætning af 10 ml PBS til hvert rør, blandes og filtreres i et 50 ml rør med en 40 mikrometer sil. Knus snavs på filteret med et sprøjtestempel for at sikre, at alt materiale passerer gennem filteret.Efter tilsætning af PBS gennem filteret, indtil volumenet når 25 ml pr. Hjerte, tilsættes yderligere 25 ml PBS til referencekontrolvævsrøret og opdeles i to forskellige rør. Mærk et af rørene ubejdset og det andet levende/dødt. Efter centrifugering ved 250 G i fem minutter ved fire grader Celsius dekanteres supernatanten, og det ufarvede rør resuspenderes i 100 mikroliter PBS og hver af de andre pellets i 100 mikroliter levende/død pletopløsning.Inkuber på is i 30 minutter i mørket. Efter tilsætning af 500 mikroliter FACS-buffer til hver prøve overføres den til et FACS-rør gennem et 40 mikrometer filter. Efter at have afvist FACS-rørene ved 250 G i fem minutter ved fire grader Celsius og kasseret supernatanten, resuspenderes pellet i 500 mikroliter FACS-buffer.Tilsæt 50 mikroliter FC-blokerende opløsning til hvert rør, undtagen de ufarvede og levende / døde rør. Bland og inkuber i fem minutter. Efter tilsætning af 50 mikroliter antistofblandingsopløsning til hvert rør, bortset fra de ufarvede og levende / døde rør, inkuberes i 30 minutter i mørke og dækker isspanden med aluminiumsfolie.Som med den levende / døde plet, vask igen med 500 mikroliter FACS-buffer og resuspender i 300 til 500 mikroliter FACS-buffer. Åbn instrumentstyringssoftwaren. Øverst i vinduet skal du vælge fanen Erhvervelse og klikke på Ny.I bibliotekssektionen i feltet Skriv for at filtrere, skriv PE, PerCP-Cy5.5, strålende violet 421, Alexa Fluor 700 og Zombie Aqua, vælg fluor-4 og klik på Tilføj efter at have skrevet hver. Klik derefter på Næste for at fortsætte til fanen Grupper. Klik nu på symbolet med et rør for at tilføje hjertet til analysen.Klik på referencegruppen, og et vindue vises. I kolonnen fluorescerende tags skal du vælge Zombie Aqua som fluorescerende tag og slette andre ved at klikke på det røde papirkurvikon ved siden af hver. Vælg derefter Celler i ikonet Kontroltype.Klik derefter på Gem. Klik på Næste. Klik derefter på fanen Marmarker.Der vises en tabel. Skriv den tilsvarende cellemarkør i den første række i hver fluor-4-kolonne, og tryk på Enter. Klik på Næste to gange for at gå til fanen Anskaffelse.I Begivenheder til registrering af forsøgsprøverne, type 10 millioner, og i samme felt for referencegruppelinjen, type 200.000. Klik på Gem og åbn. Klik på Instrumentbetjening nederst til venstre.Indstil spændingen til FSC 50, SSC 175, SSC-B 175. Vælg anskaffelseskontrolelementet. For indstillingen for strømningshastighed skal du vælge Høj i rullemenuen.Vortex det ufarvede hjerterør og placer det sikkert på prøveinjektionsporten. Sørg for, at den grønne indikatorpil peger på den korrekte prøve. Klik derefter på Optag, og vent, indtil begivenhederne er optaget.Gør det samme for det levende / døde farvede hjertevæv. Vælg menuen Unmix, og indstil kontrollerne. Markér afkrydsningsfeltet for Autofluorescens som et fluorescerende mærke.Klik derefter på Næste for at fortsætte til fanen Identificer positive/negative populationer. I denne fane vises et plot af fremadrettet spredningsområde versus sidespredningsområde. Klik og træk polygonens punkter for at vælge et område mellem 1 og 4 millioner på den fremadrettede spredningsområdeakse og mellem 0,2 og 3 millioner på sidepunktaksen.I det næste plot til højre vises V5-A på X-aksen. Flyt portene for at vælge halvdelen af toppen yderst til højre som positiv og en region i venstre side af plottet som negativ. I plottet med titlen Referencegruppe-Unstained skal du vælge en population i et lignende interval.For de ubesmittede må der ikke vælges noget positivt/negativt. Klik på knappen Live Unmixing. Nu erhverve de eksperimentelle prøver, hvirvel røret, og placere det sikkert på SIP.Sørg for, at den grønne indikatorpil peger på den korrekte prøve. Klik derefter på Optag i panelet Acquisition Control i cytometersoftwaren, og vent, indtil hændelserne registreres. Vælg fanen Ublandet standardregneark.Opret et FCS-A versus SSC-A-plot ved hjælp af prikplotværktøjet øverst. Vælg hændelser, der er højere end 0,4 millioner på FSC-A-aksen og højere end 0,8 millioner på SSC-A-aksen, ved hjælp af polygonmarkeringsværktøjet. Opret et nyt plot ved at dobbeltklikke på markeringen, og i dette nye plot skal du højreklikke på Y-akseetiketten og vælge levende / død plet.Højreklik på X-akseetiketten, og vælg Autofluorescens A.Vælg alle begivenhederne under 10 til den femte på live/dead-aksen. Disse er de levende celler. Dobbeltklik i denne markering.I det nye afbildning skal du vælge PerCP-Cy5.5A for X-aksen og SSC-A for Y-aksen. Vælg populationerne på højre side af PerCP-Cy5.5A. Disse er immuncellerne.Dobbeltklik på markeringen. På det nye plot skal du vælge FSC-A for X-aksen og spredningshøjden fremad for Y-aksen. Vælg de hændelser, der følger en tendens, hvor FSC-A-værdien og SSC-A-værdien er den samme.Dette vælger enkeltceller og eliminerer dubletter. Dobbeltklik på denne markering for at få vist et nyt plot i den CD45-positive enkeltcellepopulation. Fra det CD45-positive enkeltcellepopulationsplot skal du vælge strålende violet 421 på X-aksen versus SSC-A på Y-aksen.Vælg populationen til højre på den strålende violette 421-akse. Dette er B-cellepopulationen. Dobbeltklik to gange i denne population for at oprette to nye afbildninger med B-cellepopulationen.Opsæt det første B-celleplot med PEA på X-aksen og strålende violet 421A på Y-aksen. Populationen til højre svarer til de intervaskulære B-celler, og populationen til venstre repræsenterer de interstitielle B-celler. Vælg begge.Konfigurer det andet B-celleplot med Alexa Fluor 700A på X-aksen og SSC-A på Y-aksen. Populationen til venstre svarer til de CD11b-negative celler, og begivenhederne til højre svarer til de CD11b-positive celler. Højreklik på hvert afsnit, og klik derefter på Gate-egenskaber.Klik på Antal og forældre for at få vist antallet af hændelser og procentdele af de overordnede populationer. Registrer antallet af hændelser og procentdele til yderligere dataanalyse. Efter fjernelse af dubletter i et naivt uskadt hjerte forventes det, at omkring 20% af CD45-positive celler vil være CD19-positive B-celler.Af disse celler er i gennemsnit 5,5% placeret i det interstitielle rum. 94,5%er i det intravaskulære rum. Af hele B-cellepopulationen i hjertet svarer kun ca. 1,6% til B1-celler baseret på overflademarkøren CD11b og de øvrige 98,4% svarer til B2-celler.Når man analyserer myokardie-B-celler via flowcytometri, er det afgørende at perfusere og hakke hjertet korrekt efter protokollen. Korrekt filtrering af det fordøjede hjerte er også afgørende for at maksimere genopretningen af immunceller.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Den Isolering, differentiering, og Kvantificering af humant antistof-secernerende B-celler fra Blood: ELISpot som Funktionel Udlæsning af humoral immunitet

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Flowcytometri-baserede assay for Overvågning af NK cellefunktioner

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Vurdering Retinal mikrogliaceller fagocytotisk funktion<em&gt; In vivo</em&gt; Brug en flowcytometri-baseret assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Detektion og berigelse af Rare Antigen-specifikke B-Celler til analyse af fænotype og funktion

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

En Flow flowcytometri-baserede cytotoksicitet analyse til vurdering af menneskers NK celleaktivitet

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

En simpel flowcytometri baseret analyse for at bestemme In Vitro antistof afhængig af forbedring af Dengue Virus ved hjælp af Zika Virus rekreationshjem Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Analyse af Shear Flow-induceret Migration af Murine Marginal Zone B-celler In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Flerfarvet Flow flowcytometri-baserede kvantificering af mitokondrier og lysosomer i T celler

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Fremstilling af hele knoglemarv til masse cytometri analyse af neutrofile-Lineage celler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...