Name: flow cytometry-based quantification and analysis of myocardial b-cells
Uploaded: 2022-08-17T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells at JoVE.com

Deze studie werd gefinancierd door NHLBI-subsidies 5K08HLO145108-03 en 1R01HL160716-01 toegekend aan Luigi Adamo.
De Aurora Flow Cytometer die werd gebruikt om deze studie te ontwikkelen, werd gefinancierd door NIH Grant S10OD026859. We erkennen de steun van de JHU Ross Flow Cytometry Core.

Alle experimenten die in dit manuscript worden beschreven, werden uitgevoerd met de goedkeuring van de IACUC aan de Johns Hopkins University School of Medicine.
1. Voorbereidingen
<ol><li>Bereid de FACS-buffer voor, zoals beschreven in tabel 1.</li>
	<li>Zorg voor voldoende CO2 om de dieren te euthanaseren.</li>
	<li>Bereid de snijruimte voor (plaats het bankkussen en plaats de tape en snijgereedschappen in de buurt).</li>
	<li>Label de 15 ml buis...

<ol>
	<li>Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+B+lymphocytes+in+cardiovascular+disease.">The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease.</a> Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).</li><li>Gowans, J. L., Knight, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+route+of+re-circulation+of+lymphocytes+in+the+rat.">The route of re-circulation of lymphocytes in the rat.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).</li><li>Kunkel, E. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+the+tissue-specific+migration+of+lymphocytes.">Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes.</a> Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+controlling+homeostatic+recirculation+and+tissue-specific+trafficking+of+lymphocytes.">Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).</li><li>Rocha-Resende, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+myocardial+B+cells+mirror+changes+in+B+cells+associated+with+different+organs.">Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs.</a> JCI Insight. 5 (16), (2020).</li><li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+B+cells+are+a+subset+of+circulating+lymphocytes+with+delayed+transit+through+the+heart.">Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart.</a> JCI Insight. 5 (3), 139377 (2020).</li><li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+subsets+of+cardiac+B+lymphocytes+improves+cardiac+function+after+acute+injury.">Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury.</a> JCI Insight. 3 (11), (2018).</li><li>Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+modulate+the+expression+of+MHC-II+on+cardiac+CCR2(-)+macrophages.">B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).</li><li>Zouggari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+trigger+monocyte+mobilization+and+impair+heart+function+after+acute+myocardial+infarction.">B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).</li><li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-10-producing+B+cells+are+enriched+in+murine+pericardial+adipose+tissues+and+ameliorate+the+outcome+of+acute+myocardial+infarction.">IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).</li><li>Heinrichs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+mobilizes+a+distinct+B-cell+subset+through+a+CXCL13-CXCR5-dependent+mechanism.">The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism.</a> Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splenic+marginal+zone+B+lymphocytes+regulate+cardiac+remodeling+after+acute+myocardial+infarction+in+mice.">Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice.</a> Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).</li><li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+dynamics+of+cardiac+immune+cell+accumulation+following+acute+myocardial+infarction.">Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).</li><li>Iwata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+against+the+second+extracellular+loop+of+beta(1)-adrenergic+receptors+induces+beta-adrenergic+receptor+desensitization+and+myocardial+hypertrophy+in+vivo.">Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo.</a> Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).</li><li>Jahns, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+a+beta+1-adrenergic+receptor-directed+autoimmune+attack+as+a+cause+of+idiopathic+dilated+cardiomyopathy.">Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).</li><li>Christ, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+against+the+beta1+adrenoceptor+from+patients+with+dilated+cardiomyopathy+prolong+action+potential+duration+and+enhance+contractility+in+isolated+cardiomyocytes.">Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).</li><li>Jane-wit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenergic+receptor+autoantibodies+mediate+dilated+cardiomyopathy+by+agonistically+inducing+cardiomyocyte+apoptosis.">Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis.</a> Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).</li><li>Ludwig, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+autoantibody-induced+pathology.">Mechanisms of autoantibody-induced pathology.</a> Frontiers in Immunology. 8, 603 (2017).</li><li>Haudek, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor+engagement+mediates+differentiation+of+cardiac+fibroblast+precursor+cells.">Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).</li><li>Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc(gamma)+receptors+IIa+on+cardiomyocytes+and+their+potential+functional+relevance+in+dilated+cardiomyopathy.">Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy.</a> Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+natural+IgM+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury.">The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+specific+self-reactive+IgM+antibody+that+initiates+intestinal+ischemia/reperfusion+injury.">Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).</li><li>Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+ADP-ATP+carrier--an+autoantigen+in+myocarditis+and+dilated+cardiomyopathy--impair+cardiac+function.">Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function.</a> Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).</li><li>Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+epitope+spreading+is+a+critical+step+for+the+switch+from+C-protein-induced+myocarditis+to+dilated+cardiomyopathy.">B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy.</a> The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).</li><li>Caforio, A. L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+state+of+knowledge+on+aetiology,+diagnosis,+management,+and+therapy+of+myocarditis:+a+position+statement+of+the+European+Society+of+Cardiology+Working+Group+on+Myocardial+and+Pericardial+Diseases.">Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases.</a> European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues.">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Horckmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericardial+adipose+tissue+regulates+granulopoiesis,+fibrosis+and+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction.</a> Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Bajpai, G., Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+macrophage+subsets+and+stromal+cells+from+human+and+mouse+myocardial+specimens.">Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60015 (2019).</li><li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes.">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li><li>Coffman, R. L., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B220:+a+B+cell-specific+member+of+th+T200+glycoprotein+family.">B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family.</a> Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).</li><li>Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+B+cell+development+in+the+fetus+and+adult.">B-1 B cell development in the fetus and adult.</a> Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).</li><li>Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+B+cells+in+cardiomyopathy+and+heart+failure.">The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure.</a> Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).</li><li>Zhao, T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rituximab+in+patients+with+acute+ST-elevation+myocardial+infarction:+an+experimental+medicine+safety+study.">Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).</li><li>Kushnir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B2+but+not+B1+cells+can+contribute+to+CD4++T-cell-mediated+clearance+of+rotavirus+in+SCID+mice.">B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice.</a> Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).</li></ol>

Een groeiend aantal aanwijzingen geeft aan dat B-cellen een belangrijke rol spelen in de context van myocardiale fysiologie en myocardiale remodellering / aanpassing aan letsel 7,8,9,10,11,12,13,36. Flowcytometrie is een uitstekend hulpmiddel om immuuncelpo...

B-lymfocyten zijn zeer gespecialiseerde immuuncellen die een belangrijke rol spelen in zowel adaptieve als aangeboren immuunresponsen1. Er zijn twee hoofdpopulaties van B-cellen: een kleinere populatie van B1-cellen die meestal worden geproduceerd tijdens het embryonale leven, en een overheersende populatie van B2-cellen die in het volwassen leven in het beenmerg worden geproduceerd1. Na rijping in het beenmerg migreren B-cellen naar primaire en secundaire lymfoïde organen. Van daaruit recirculeren ze continu tussen lymfoïde organen die door bloedvaten en lymfevaten reizen2. B-cellen brengen specifieke antilichamen tot expressie op hun oppervlak, die functioneren als receptoren. Wanneer B-cellen een antigeen tegenkomen dat zich aan hun receptor bindt, kan een activerend signaal worden geactiveerd. Geactiveerde B-cellen migreren naar het weefsel waar het antigeen werd gevonden of gaan terug naar het beenmerg waar ze kunnen rijpen tot antilichaamproducerende plasmacellen 3,4.
Onlangs is het gewaardeerd dat het hart een aanzienlijke populatie B-cellen herbergt. Studies bij knaagdieren hebben aangetoond dat B-cellen het hart vroeg koloniseren tijdens de embryonale ontwikkeling5, en dat myocardiale geassocieerde B-cellen meestal intravasculaire, naïeve B2-cellen zijn die zich hechten aan het endotheel 6,7, met een klein percentage B1-cellen7. Er zijn nog veel gebieden van onzekerheid, maar de beschikbare gegevens geven aan dat B-cellen een belangrijke rol spelen, zowel in het naïeve hart als in de context van myocardiale aanpassing aan letsel.
Studies in het naïeve muizenhart hebben aangetoond dat bij baseline myocardiale B-cellen zich meestal in de intravasculaire ruimte bevinden, gehecht aan het endotheel (>95% van de murine cardiale B-cellen bleken zich in de intravasculaire ruimte te bevinden). Deze B-cellen bleken genexpressiepatronen te hebben die verschillen van die van circulerende B-cellen geïsoleerd uit het perifere bloed. Analyse van naïeve harten van B-cel-deficiënte dieren en syngene controles wees uit dat dieren zonder B-cellen kleinere harten en hogere ejectiefractie6 hadden. Al dit bewijs suggereert dat B-cellen de myocardiale groei en/of myocardiale functie kunnen moduleren, en dat niet alleen interstitiële maar ook intravasculaire B-cellen verantwoordelijk kunnen zijn voor dergelijke waarnemingen. B-cellen bleken ook het fenotype van myocardiale residente macrofagen te moduleren8.
Verschillende studies hebben aangetoond dat B-cellen een belangrijke rol spelen in de context van myocardiale aanpassing aan letsel 8,9,10,11,12,13. B-cellen hopen zich tijdelijk op in het gewonde hart, waarschijnlijk via een CXCL13-CXCR5-afhankelijk mechanisme11,13. Van daaruit bevorderen B-cellen nadelige cardiale remodellering via verschillende mechanismen, waaronder cytokine-gemedieerde monocytenrekrutering 9,12. Bovendien kunnen B-cellen antilichamen tegen harteiwitten produceren die de uitbreiding van hartschade en ongunstige hartremodellering kunnen bevorderen via verschillende mechanismen 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B-cellen kunnen ook beschermende effecten uitoefenen op het gewonde hart door de afscheiding van IL-1010.
Naarmate het aantal groepen dat de rol van B-cellen in het naïeve en gewonde hart onderzoekt, groeit, wordt het steeds belangrijker om gedeelde protocollen te definiëren om myocardiale B-cellen goed te kwantificeren en te beoordelen en zo inconsistenties te voorkomen die al in de literatuur zijn begonnen te verschijnen. Tot nu toe zijn B-cellen in feite beide gemeld als een van de meest voorkomende immuuncellen in het knaagdierhart7 en aanwezig te zijn met een duidelijk lagere prevalentie dan myeloïde cellen26,27, of vrij zeldzaam28. Evenzo hebben verschillende groepen beschreven dat het aantal myocardiale B-cellen toeneemt na acuut ischemisch myocardinfarct 7,9,13, maar één groep meldde geen veranderingen in het aantal B-cellen van het gewonde myocard29. Studies op cardiale immuuncellen geven zelden details over perfusieomstandigheden en er is geen consensus over de spijsverteringscondities. Aangezien in het knaagdierhart een groot deel van de B-cellen intravasculair is en de extractie van immuuncellen uit het myocard sterk afhankelijk is van de gebruikte verteringsmethode, kunnen de in de literatuur gemelde verschillen het gevolg zijn van verschillen in orgaanperfusie en weefselvertering.
Hier gepresenteerd is een gedetailleerde methode voor flowcytometrie-gebaseerde kwantificering van murine myocardiale B-cellen die de opbrengst van B-celherstel maximaliseert door perfusie- en spijsverteringscondities te optimaliseren en de discriminatie van intravasculaire versus extravasculaire myocardiale B-cellenmogelijk maakt 6. Dit protocol is een aanpassing en optimalisatie van andere vergelijkbare protocollen die onderscheid maken tussen intravasculaire en interstitiële immuuncellen 28,30,31.
In dit protocol standaardiseren we myocardiale perfusie om B-cellen die in de intravasculaire ruimte zweven te elimineren zonder biologisch relevante B-cellen te verwijderen die aan het microvasculaire endotheel zijn gehecht. Bovendien, voortbouwend op eerdere protocollen die het gebruik van intraveneuze injectie van antilichamen hebben beschreven om intravasculaire van interstitiële immuuncellen te onderscheiden32, en gebruikmakend van het feit dat B-cellen de oppervlaktemarker B22033 tot expressie brengen, demonstreren we hoe intravasculaire versus extravasculaire myocardiale B-cellen kunnen worden onderscheiden door intravasculaire injectie van een B220-specifiek antilichaam onmiddellijk vóór het dierenoffer en de hartperfusie. Dit protocol is relevant voor het onderzoek van elke wetenschapper die geïnteresseerd is in het opnemen van de analyse van myocardiale B-cellen in het naïeve en gewonde hart. De wijdverspreide implementatie van dit protocol zal inconsistenties tussen onderzoeksgroepen verminderen, zal de analyse van veranderingen in de intravasculaire en extravasculaire myocardiale B-celpools mogelijk maken en zo de vooruitgang van ontdekkingen op het gebied van cardiale immunologie ondersteunen.
Samenvattend vertegenwoordigt het protocol een geoptimaliseerde workflow om myocardiale B-cellen te kwantificeren en te analyseren via flowcytometrie, en tegelijkertijd onderscheid te maken tussen cellen in de extravasculaire ruimte en de intravasculaire ruimte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody</td>
			<td>101222</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100 &#181;g 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 &#181;m, Blue</td>
			<td>QBIAP303</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube</td>
			<td>1605-0000</td>
			<td>SealRite, USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Injection, USP</td>
			<td>114-055-101</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>0.90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>SealRite, USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11213810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11267810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free</td>
			<td>430052</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Way Stop Valve, Polycarbonate</td>
			<td>SVPT951</td>
			<td>ECT Manufacturing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td>T48402</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11208810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Way Stop Valve, Polycarbonate</td>
			<td>SVPT953</td>
			<td>ECT Manufacturing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style</td>
			<td>352054</td>
			<td>Falcon, a Corning Brand</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free</td>
			<td>430290</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63</td>
			<td>5810759005</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62</td>
			<td>22638289</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 &#8211; 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62</td>
			<td>22638246</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil 12 in x 75&#39; Roll .0007</td>
			<td>UPC 109153</td>
			<td>Reynolds Wrap</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Induction Chamber - Mouse</td>
			<td>RWD-AICMV-100</td>
			<td>Conduct Science</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL</td>
			<td>309626</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2&#34; 100-Pack</td>
			<td>CMD 2613</td>
			<td>Brandzig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody</td>
			<td>115537</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 &#181;m, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile</td>
			<td>T9009</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Dioxide USP E CGA 940&#160;</td>
			<td>CD USPE</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL</td>
			<td>UX-34502-46</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 2</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector brass chrome plated 1/4&#34; female NPT x 1/4&#34; barb</td>
			<td>Y992611-AG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytek Aurora Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td>Cytek Biosciences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP</td>
			<td>M-08-12</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I - 40,000 U</td>
			<td>D4527</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypet&#160;3 - Electronic Pipette Controller</td>
			<td>4430000018</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Balance, AX223/E</td>
			<td>30100606</td>
			<td>Ohaus Corp.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes</td>
			<td></td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.1</td>
			<td></td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100)</td>
			<td>Z740287</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]</td>
			<td>14025076</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>H3506</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostats, Straight</td>
			<td>13018-14</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL</td>
			<td>302831</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940</td>
			<td>M1-940-PG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McKesson Underpads, Moderate</td>
			<td>4033-CS150</td>
			<td>McKesson</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navigator Multi-Purpose Portable Balance</td>
			<td>NV2201</td>
			<td>Ohaus Corp.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]</td>
			<td>10010023</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody</td>
			<td>103208</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>200 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>103132</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100 &#181;g 500 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene</td>
			<td>FB0875711YZ</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02</td>
			<td>M08-1</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator</td>
			<td>LED-6W</td>
			<td>AmScope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm)</td>
			<td>305122</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO)</td>
			<td>553141</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company Biosciences</td>
			<td>0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 4.1.1</td>
			<td></td>
			<td>The R Foundation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>9501250000</td>
			<td>Accutec Blades Inc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet</td>
			<td>Y12244A320-AG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets</td>
			<td>Rotor A-4-62</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma label tape</td>
			<td>L8394</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroFlo 3.0.0</td>
			<td></td>
			<td>Cytek Biosciences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8&#34; Hose Barb; 1/EA</td>
			<td>MTLL230-6005</td>
			<td>Spex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8&#34; ID x 3/16&#34; OD x 1/32&#34; Wall x 50&#39; Long</td>
			<td>CG-730-003</td>
			<td>Excelon Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe PP/PE without needle, 3 mL</td>
			<td>Z683566</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>55-1199 (95-240)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500</td>
			<td>9371W13</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rack, 12&#160;positions, 6 for 5.0&#160;mL and 15&#160;mL tubes and 6 for 25&#160;mL and 50&#160;mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable</td>
			<td>30119835</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rack, 12&#160;positions, for 5.0&#160;mL and 15&#160;mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable</td>
			<td>30119827</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. &#215; O.D. 1/4 in. &#215; 3/8 in.</td>
			<td>T8913 (Millipore Sigma)</td>
			<td>Tygon, Saint-Gobain</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Scientific Industries, Inc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips</td>
			<td>89259-946</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4&#189;&#34;</td>
			<td>82027-578</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I</td>
			<td>12620-946</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>423102</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry-based quantification and analysis of myocardial b-cells

Een groeiend aantal bewijzen toont aan dat B-lymfocyten een belangrijke rol spelen in de context van myocardiale fysiologie en myocardiale aanpassing aan letsel. De literatuur rapporteert echter contrasterende gegevens over de prevalentie van myocardiale B-cellen. Van B-cellen is gemeld dat ze zowel tot de meest voorkomende immuuncellen in het knaagdierhart behoren als aanwezig zijn, maar met een aanzienlijk lagere prevalentie dan myeloïde cellen, of vrij zeldzaam zijn. Evenzo hebben verschillende groepen beschreven dat het aantal myocardiale B-cellen toeneemt na acuut ischemisch myocardinfarct, maar één groep meldde geen veranderingen in het aantal B-cellen van het gewonde myocardium. Implementatie van een gedeelde, reproduceerbare methode om de prevalentie van myocardiale B-cellen te beoordelen, is van cruciaal belang om waarnemingen van verschillende onderzoeksgroepen te harmoniseren en zo de voortgang van de studie van B-cel myocardiale interacties te bevorderen. Op basis van onze ervaring komen de schijnbaar contrasterende waarnemingen die in de literatuur worden gerapporteerd waarschijnlijk voort uit het feit dat muizenmyocardiale B-cellen meestal intravasculair zijn en verbonden met het microvasculaire endotheel. Daarom is het aantal B-cellen dat wordt teruggewonnen uit een muizenhart buitengewoon gevoelig voor de perfusieomstandigheden die worden gebruikt om het orgaan te reinigen en voor de gebruikte verteringsmethode. Hier rapporteren we een geoptimaliseerd protocol dat op een specifieke manier rekening houdt met deze twee kritieke variabelen. Dit protocol maakt reproduceerbare, op flowcytometrie gebaseerde analyse van het aantal muizenmyocardiale B-cellen mogelijk en stelt onderzoekers in staat om extravasculaire versus intravasculaire myocardiale B-cellen te onderscheiden.

Zodra de acquisitie is voltooid en alle gebeurtenissen zijn verzameld, moeten de gegevens worden geanalyseerd volgens de standaard flowcytometriepraktijk. De focus van de analyse zal variëren afhankelijk van het individuele doel van elk experiment. In dit geval werd kwantificering van intravasculaire en extravasculaire B-cellen nagestreefd en werd deze uitgedrukt als het aantal cellen per mg weefsel.
Bij gebruik van een spectrale cytometer wordt aanbevolen om de analyse te starten met een eer...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells at JoVE.com

Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells

Hier rapporteren we een protocol voor de kwantificering en differentiatie van myocardiale B-lymfocyten op basis van hun locatie in de intravasculaire of endotheelruimte met behulp van flowcytometrie.

FlowCytometrie-gebaseerde kwantificering en analyse van myocardiale B-cellen

A growing body of evidence shows that B-lymphocytes play an important role in the context of myocardial physiology and myocardial adaptation to injury. ...

De literatuur rapporteert contrasterende gegevens over de prevalentie van myocardiale B-cellen. Dit komt waarschijnlijk voort uit variabiliteit in perfusie- en verteringstechnieken. Ons protocol maakt reproduceerbare flowcytometrie-gebaseerde analyse op myocardiale B-cellen mogelijk.Deze techniek maximaliseert de herstelopbrengst van B-cellen en vermindert de variabiliteit in flowcytometrietellingen tussen B-cellen en andere populaties uit hartmonsters. Deze geoptimaliseerde verterings- en isolatiemethode kan eenvoudig worden aangepast om een uitgebreid antilichaampanel te implementeren om verschillende immuunceltypen in het hart te bestuderen. Het protocol kan ook worden toegepast op andere organen, zoals longen of lever, om B-cellen te bestuderen die geassocieerd zijn met die organen.Om te beginnen, weeg een 12 weken oude mannelijke muis. Laad een insulinespuit van 310 cc met 100 microliter van de B220-antilichaamoplossing. Injecteer het verdunde B220-antilichaam door retro-orbitale injectie en ga onmiddellijk over tot orgaanoogst en perfusie.Houd na euthanasie de huid van de muis met een tang op het epigastrische gebied. Maak een opening van twee millimeter in de huid met een schaar en gebruik de tang om de huid weg te pellen om de fascialaag te onthullen. Snijd bij de overbuikheid door de fascia en het buikvlies.Klem het xiphoid-proces met behulp van een hemostatische tang. Maak een verticale snede door de borstwand ter hoogte van de midclaviculaire lijn aan elke kant en til de voorste borstwand op om de mediastinuminhoud te onthullen. Houd de aorta stevig van achteren vast met behulp van een tang.Breng de naald van de spuit in de top van het hart. Doordrenkt met drie milliliter HBSS met een snelheid van drie milliliter per minuut. Snijd de aorta en verwijder het hart.Was het hart in de petrischaal met HBSS. Weeg het geïsoleerde hart en noteer het gewicht in milligrammen. Gehakt het hart op kamertemperatuur in kleine stukjes met een mes.De hartstukken moeten ongeveer 1,5 millimeter groot zijn. Meet de massa van het hartweefsel met behulp van een balans en plaats 60 milligram van het gehakte hart dat moet worden verteerd in een buis van 15 milliliter op ijs met drie milliliter HBSS. Herhaal dit proces voor een muis die de B220-antilichaaminjectie niet heeft ontvangen en plaats deze in de buis met drie milliliter HBSS-gelabeld referentiecontroleweefsel.Voeg enzymen toe aan elke buis die gehakte weefsels bevat. Voeg 0,5 microliter per milligram DNase I, één 0,5 microliter per milligram collagenase II en 0,2 microliter per milligram hyaluronidase toe. Plaats de verteringsreactie gedurende 30 minuten in de shaker met 300 omwentelingen per minuut.Buizen worden in de shaker geplaatst onder een kleine hoek, ongeveer 25 graden helling. Voeg zeven milliliter HBSS toe aan elk van de 15-milliliter reactiebuizen en centrifugeer bij 250 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Na het decanteren van het supernatant, resuspenseer elke pellet in vijf milliliter ACK lysis buffer.Incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Nadat u 10 milliliter PBS aan elke buis hebt toegevoegd, mengt en filtert u in een buis van 50 milliliter met een zeef van 40 micrometer. Sla alle vuil op het filter kapot met een spuitzuiger om ervoor te zorgen dat al het materiaal door het filter gaat.Nadat u PBS door het filter hebt toegevoegd totdat het volume 25 milliliter per hart bereikt, voegt u nog eens 25 milliliter PBS toe aan de referentiecontroleweefselbuis en verdeelt u het volume in twee verschillende buizen. Label een van de buizen ongebrand en de andere levend / dood. Na centrifugeren bij 250 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius, decanteert u het supernatant en resuspenseert u de niet-gekleurde buis in 100 microliter PBS en elk van de andere pellets in 100 microliter van de levende / dode vlekoplossing.Incubeer op ijs gedurende 30 minuten in het donker. Nadat u 500 microliter FACS-buffer aan elk monster hebt toegevoegd, brengt u het over in een FACS-buis door een filter van 40 micrometer. Na het weigeren van de FACS-buizen bij 250 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en het weggooien van het supernatant, resuspendeert u de pellet in 500 microliter FACS-buffer.Voeg 50 microliter FC-blokkerende oplossing toe aan elke buis, behalve de niet-gekleurde en levende / dode buizen. Meng en incubeer gedurende vijf minuten. Na het toevoegen van 50 microliter antilichaammixoplossing aan elke buis, behalve de niet-gekleurde en levende / dode buizen, incubeer gedurende 30 minuten in het donker en bedek de ijsemmer met aluminiumfolie.Net als bij de levende/dode vlek, opnieuw wassen met 500 microliter FACS-buffer en resuspender in 300 tot 500 microliter FACS-buffer. Open de instrumentbesturingssoftware. Selecteer bovenaan het venster het tabblad Acquisitie en klik op Nieuw.Typ in het bibliotheekgedeelte in het veld Type om te filteren PE, PerCP-Cy5.5, brilliant violet 421, Alexa Fluor 700 en Zombie Aqua, selecteer de fluoro-4 en klik op Toevoegen nadat u ze hebt getypt. Klik vervolgens op Volgende om door te gaan naar het tabblad Groepen. Klik nu op het symbool met een buis om het hart toe te voegen voor de analyse.Klik op de referentiegroep en er verschijnt een venster. Selecteer in de kolom fluorescerende tags Zombie Aqua als de fluorescerende tag en verwijder alle andere door op het rode prullenbakpictogram naast elk te klikken. Selecteer vervolgens in het pictogram Besturingstype de optie Cellen.Klik vervolgens op Opslaan. Klik op Volgende. Klik vervolgens op het tabblad Markeringen.Er wordt een tabel weergegeven. Typ de bijbehorende celmarkering in de eerste rij van elke fluoro-4-kolom en druk op Enter. Klik tweemaal op Volgende om naar het tabblad Acquisitie te gaan.Typ 10 miljoen in Gebeurtenissen om de experimentele monsters vast te leggen en typ 200, 000 in hetzelfde veld voor de referentiegroepregel. Klik op Opslaan en openen. Klik linksonder op Instrument Control.Stel de spanning in op FSC 50, SSC 175, SSC-B 175. Selecteer het acquisitiebesturingselement. Voor de debietoptie selecteert u Hoog in het vervolgkeuzemenu.Vortex de onbevlekte hartbuis en plaats deze stevig op de injectiepoort van het monster. Zorg ervoor dat de groene indicatorpijl naar het juiste voorbeeld wijst. Klik vervolgens op Opnemen en wacht tot de gebeurtenissen zijn opgenomen.Doe hetzelfde voor het levend/dood gekleurd hartweefsel. Selecteer het menu Onmengingen en stel de besturingselementen in. Schakel het selectievakje autofluorescentie als fluorescentietag in.Klik vervolgens op Volgende om door te gaan naar het tabblad Positieve/negatieve populaties identificeren. Op dit tabblad wordt een plot van voorwaarts spreidingsgebied versus zijspreidingsgebied weergegeven. Klik en sleep de punten van de veelhoek om een gebied tussen 1 en 4 miljoen op de as van het voorwaartse spreidingsgebied en tussen 0,2 en 3 miljoen op de as van het spreidingsgebied aan de zijkant te selecteren.In de volgende plot aan de rechterkant wordt V5-A weergegeven op de X-as. Verplaats de poorten om de helft van de piek uiterst rechts als positief te selecteren en een gebied aan de linkerkant van het plot als negatief. Selecteer in de plot met de titel Reference Group-Unstained een populatie in een vergelijkbaar bereik.Voor de niet-bevlekte hoeft geen positief/negatief te worden geselecteerd. Klik op de knop Live unmixing. Verkrijg nu de experimentele monsters, vortex de buis en plaats deze veilig op de SIP.Zorg ervoor dat de groene indicatorpijl naar het juiste voorbeeld wijst. Klik vervolgens op Record in het deelvenster Acquisitiecontrole van de cytometersoftware en wacht tot de gebeurtenissen zijn vastgelegd. Selecteer het tabblad Standaard niet-gemengd werkblad.Maak een FCS-A versus SSC-A plot met behulp van de dot plot tool bovenaan. Selecteer gebeurtenissen hoger dan 0,4 miljoen op de FSC-A-as en hoger dan 0,8 miljoen op de SSC-A-as met behulp van het gereedschap polygoonselectie. Maak een nieuwe plot door te dubbelklikken op de selectie en klik in deze nieuwe plot met de rechtermuisknop op het Y-aslabel en selecteer live / dode vlek.Klik met de rechtermuisknop op het X-aslabel en selecteer Autofluorescentie A.Selecteer alle gebeurtenissen onder 10 tot de vijfde op de live / dode-as. Dit zijn de levende cellen. Dubbelklik in deze selectie.Selecteer in de nieuwe plot PerCP-Cy5.5A voor de X-as en SSC-A voor de Y-as. Selecteer de populaties aan de rechterkant van de PerCP-Cy5.5A. Dit zijn de immuuncellen.Dubbelklik op de selectie. Selecteer op het nieuwe perceel FSC-A voor de X-as en voorwaartse spreidingshoogte voor de Y-as. Selecteer de gebeurtenissen die een trend volgen waarin de FSC-A-waarde en SSC-A-waarde hetzelfde zijn.Dit selecteert enkele cellen en elimineert doubletten. Dubbelklik op deze selectie om een nieuwe plot weer te geven in de CD45-positieve eencellige populatie. Selecteer uit de CD45-positieve eencellige populatieplot briljant violet 421 op de X-as versus SSC-A op de Y-as.Selecteer de populatie rechts op de schitterende violette 421-as. Dit is de B-celpopulatie. Dubbelklik twee keer in deze populatie om twee nieuwe percelen te maken met de B-celpopulatie.Zet de eerste B-celplot op met PEA op de X-as en briljant violet 421A op de Y-as. De populatie rechts komt overeen met de intervasculaire B-cellen en de populatie links vertegenwoordigt de interstitiële B-cellen. Selecteer beide.Stel de tweede B-celplot in met Alexa Fluor 700A op de X-as en SSC-A op de Y-as. De populatie aan de linkerkant komt overeen met de CD11b-negatieve cellen en de gebeurtenissen aan de rechterkant komen overeen met de CD11b-positieve cellen. Klik met de rechtermuisknop op elke sectie en klik vervolgens op Gate-eigenschappen.Klik op Aantal en ouder om het aantal gebeurtenissen en percentages van de bovenliggende populaties weer te geven. Noteer het aantal gebeurtenissen en percentages voor verdere gegevensanalyse. Na het verwijderen van doubletten in een naïef ongewond hart, wordt verwacht dat ongeveer 20% van de CD45-positieve cellen CD19-positieve B-cellen zullen zijn.Van deze cellen bevindt zich gemiddeld 5,5% in de interstitiële ruimte. 94,5% bevindt zich in de intravasculaire ruimte. Van de hele B-celpopulatie in het hart komt slechts ongeveer 1,6% overeen met B1-cellen op basis van de oppervlaktemarker CD11b en de andere 98,4% komt overeen met B2-cellen.Bij het analyseren van myocardiale B-cellen via flowcytometrie is het cruciaal om het hart goed te doordringen en te hakken volgens het protocol. Een goede filtratie van het verteerde hart is ook essentieel om het herstel van immuuncellen te maximaliseren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Muizenmodel van CD40-activatie van B-cellen

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Recombinante retrovirale Productie en Infectie van B-cellen

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

De isolatie, differentiatie en kwantificering van menselijk antilichaam-uitscheidende B-cellen uit bloed: ELISpot als functionele Uitlezing van humorale immuniteit

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Flowcytometrie-gebaseerde test voor het toezicht op NK celfuncties

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Het beoordelen van het netvlies Microgliale fagocytosefunctietesten<em&gt; In Vivo</em&gt; Met behulp van een flowcytometrie-gebaseerde test

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Detectie en Verrijking van zeldzame antigeen-specifieke B-cellen voor analyse van fenotype en functie

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Een stroom Cytometry gebaseerde cytotoxiciteit Assay voor de beoordeling van menselijke NK cel activiteit

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Analyse van Shear Flow-geïnduceerde migratie van RattenUitrustingen Marginal Zone B cellen In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Multicolor Stroom Cytometry gebaseerde kwantificering van Mitochondria en lysosomen in T cellen

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Het meten van natuurlijk verworven phagocytose-inducerende antilichamen tegen Plasmodium falciparum parasieten door een Flow Cytometrie-Gebaseerde Test

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...