Name: flow cytometry-based quantification and analysis of myocardial b-cells
Uploaded: 2022-08-17T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells at JoVE.com

Diese Studie wurde durch die NHLBI-Zuschüsse 5K08HLO145108-03 und 1R01HL160716-01 finanziert, die an Luigi Adamo vergeben wurden.
Das Aurora-Durchflusszytometer, das zur Entwicklung dieser Studie verwendet wurde, wurde vom NIH Grant S10OD026859 finanziert. Wir danken für die Unterstützung des JHU Ross Flow Cytometry Core.

Alle in diesem Manuskript beschriebenen Experimente wurden mit Genehmigung der IACUC an der Johns Hopkins University School of Medicine durchgeführt.
1. Vorbereitungen
<ol><li>Bereiten Sie den FACS-Puffer vor, wie in Tabelle 1 beschrieben.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass genügend CO2 vorhanden ist, um die Tiere einzuschläfern.</li>
	<li>Bereiten Sie den Sezierraum vor (platzieren Sie das Tischpad und legen Sie das Klebeband und die Sezierwer...

<ol>
	<li>Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+B+lymphocytes+in+cardiovascular+disease.">The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease.</a> Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).</li><li>Gowans, J. L., Knight, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+route+of+re-circulation+of+lymphocytes+in+the+rat.">The route of re-circulation of lymphocytes in the rat.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).</li><li>Kunkel, E. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+the+tissue-specific+migration+of+lymphocytes.">Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes.</a> Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+controlling+homeostatic+recirculation+and+tissue-specific+trafficking+of+lymphocytes.">Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).</li><li>Rocha-Resende, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+myocardial+B+cells+mirror+changes+in+B+cells+associated+with+different+organs.">Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs.</a> JCI Insight. 5 (16), (2020).</li><li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+B+cells+are+a+subset+of+circulating+lymphocytes+with+delayed+transit+through+the+heart.">Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart.</a> JCI Insight. 5 (3), 139377 (2020).</li><li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+subsets+of+cardiac+B+lymphocytes+improves+cardiac+function+after+acute+injury.">Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury.</a> JCI Insight. 3 (11), (2018).</li><li>Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+modulate+the+expression+of+MHC-II+on+cardiac+CCR2(-)+macrophages.">B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).</li><li>Zouggari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+trigger+monocyte+mobilization+and+impair+heart+function+after+acute+myocardial+infarction.">B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).</li><li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-10-producing+B+cells+are+enriched+in+murine+pericardial+adipose+tissues+and+ameliorate+the+outcome+of+acute+myocardial+infarction.">IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).</li><li>Heinrichs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+mobilizes+a+distinct+B-cell+subset+through+a+CXCL13-CXCR5-dependent+mechanism.">The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism.</a> Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splenic+marginal+zone+B+lymphocytes+regulate+cardiac+remodeling+after+acute+myocardial+infarction+in+mice.">Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice.</a> Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).</li><li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+dynamics+of+cardiac+immune+cell+accumulation+following+acute+myocardial+infarction.">Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).</li><li>Iwata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+against+the+second+extracellular+loop+of+beta(1)-adrenergic+receptors+induces+beta-adrenergic+receptor+desensitization+and+myocardial+hypertrophy+in+vivo.">Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo.</a> Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).</li><li>Jahns, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+a+beta+1-adrenergic+receptor-directed+autoimmune+attack+as+a+cause+of+idiopathic+dilated+cardiomyopathy.">Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).</li><li>Christ, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+against+the+beta1+adrenoceptor+from+patients+with+dilated+cardiomyopathy+prolong+action+potential+duration+and+enhance+contractility+in+isolated+cardiomyocytes.">Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).</li><li>Jane-wit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenergic+receptor+autoantibodies+mediate+dilated+cardiomyopathy+by+agonistically+inducing+cardiomyocyte+apoptosis.">Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis.</a> Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).</li><li>Ludwig, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+autoantibody-induced+pathology.">Mechanisms of autoantibody-induced pathology.</a> Frontiers in Immunology. 8, 603 (2017).</li><li>Haudek, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor+engagement+mediates+differentiation+of+cardiac+fibroblast+precursor+cells.">Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).</li><li>Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc(gamma)+receptors+IIa+on+cardiomyocytes+and+their+potential+functional+relevance+in+dilated+cardiomyopathy.">Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy.</a> Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+natural+IgM+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury.">The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+specific+self-reactive+IgM+antibody+that+initiates+intestinal+ischemia/reperfusion+injury.">Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).</li><li>Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+ADP-ATP+carrier--an+autoantigen+in+myocarditis+and+dilated+cardiomyopathy--impair+cardiac+function.">Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function.</a> Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).</li><li>Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+epitope+spreading+is+a+critical+step+for+the+switch+from+C-protein-induced+myocarditis+to+dilated+cardiomyopathy.">B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy.</a> The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).</li><li>Caforio, A. L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+state+of+knowledge+on+aetiology,+diagnosis,+management,+and+therapy+of+myocarditis:+a+position+statement+of+the+European+Society+of+Cardiology+Working+Group+on+Myocardial+and+Pericardial+Diseases.">Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases.</a> European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues.">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Horckmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericardial+adipose+tissue+regulates+granulopoiesis,+fibrosis+and+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction.</a> Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Bajpai, G., Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+macrophage+subsets+and+stromal+cells+from+human+and+mouse+myocardial+specimens.">Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60015 (2019).</li><li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes.">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li><li>Coffman, R. L., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B220:+a+B+cell-specific+member+of+th+T200+glycoprotein+family.">B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family.</a> Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).</li><li>Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+B+cell+development+in+the+fetus+and+adult.">B-1 B cell development in the fetus and adult.</a> Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).</li><li>Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+B+cells+in+cardiomyopathy+and+heart+failure.">The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure.</a> Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).</li><li>Zhao, T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rituximab+in+patients+with+acute+ST-elevation+myocardial+infarction:+an+experimental+medicine+safety+study.">Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).</li><li>Kushnir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B2+but+not+B1+cells+can+contribute+to+CD4++T-cell-mediated+clearance+of+rotavirus+in+SCID+mice.">B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice.</a> Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).</li></ol>

Eine wachsende Zahl von Beweisen deutet darauf hin, dass B-Zellen eine wichtige Rolle im Zusammenhang mit der Myokardphysiologie und dem myokardialen Umbau/der Anpassung an Verletzungen spielen 7,8,9,10,11,12,13,36. Die Durchflusszytometrie ist ein hervorra...

B-Lymphozyten sind hochspezialisierte Immunzellen, die sowohl bei der adaptiven als auch bei der angeborenen Immunantwort eine wichtige Rolle spielen1. Es gibt zwei Hauptpopulationen von B-Zellen: eine kleinere Population von B1-Zellen, die hauptsächlich während des embryonalen Lebens produziert werden, und eine überwiegende Population von B2-Zellen, die im Erwachsenenalter im Knochenmark produziert werden1. Nach der Reifung im Knochenmark wandern B-Zellen zu primären und sekundären lymphatischen Organen. Von dort aus zirkulieren sie kontinuierlich zwischen lymphatischen Organen, die sich durch Blutgefäße und Lymphgefäße bewegen2. B-Zellen exprimieren auf ihrer Oberfläche spezifische Antikörper, die als Rezeptoren fungieren. Wenn B-Zellen auf ein Antigen treffen, das an ihren Rezeptor bindet, kann ein aktivierendes Signal ausgelöst werden. Aktivierte B-Zellen wandern entweder in das Gewebe, in dem das Antigen gefunden wurde, oder kehren ins Knochenmark zurück, wo sie zu Antikörper produzierenden Plasmazellen heranreifenkönnen 3,4.
In jüngster Zeit wurde erkannt, dass das Herz eine beträchtliche Population von B-Zellen beherbergt. Studien an Nagetieren haben gezeigt, dass B-Zellen das Herz früh während der Embryonalentwicklung besiedeln5 und dass myokardiale B-Zellen meist intravaskuläre, naive B2-Zellen sind, die am Endothel6,7 haften, mit einem kleinen Prozentsatz von B1-Zellen7. Es gibt noch viele Bereiche der Unsicherheit, aber die verfügbaren Daten deuten darauf hin, dass B-Zellen sowohl im naiven Herzen als auch im Zusammenhang mit der myokardialen Anpassung an Verletzungen eine wichtige Rolle spielen.
Studien am naiven murinen Herzen haben gezeigt, dass myokardiale B-Zellen zu Beginn der Studie hauptsächlich im intravaskulären Raum lokalisiert sind und an das Endothel gebunden sind (>95% der murinen kardialen B-Zellen befanden sich im intravaskulären Raum). Es wurde festgestellt, dass diese B-Zellen andere Genexpressionsmuster aufweisen als zirkulierende B-Zellen, die aus dem peripheren Blut isoliert wurden. Die Analyse naiver Herzen von B-Zell-defizienten Tieren und syngenen Kontrollen ergab, dass Tiere ohne B-Zellen kleinere Herzen und eine höhere Ejektionsfraktion hatten6. All diese Beweise deuten darauf hin, dass B-Zellen das Myokardwachstum und/oder die Myokardfunktion modulieren könnten und dass nicht nur interstitielle, sondern auch intravaskuläre B-Zellen für solche Beobachtungen verantwortlich sein könnten. Es wurde auch festgestellt, dass B-Zellen den Phänotyp von myokardialen residenten Makrophagen modulieren8.
Mehrere Studien haben gezeigt, dass B-Zellen eine wichtige Rolle im Zusammenhang mit der myokardialen Anpassung an Verletzungenspielen 8,9,10,11,12,13. B-Zellen reichern sich vorübergehend im verletzten Herzen an, wahrscheinlich durch einen CXCL13-CXCR5-abhängigen Mechanismus11,13. Von dort aus fördern B-Zellen den nachteiligen kardialen Umbau durch mehrere Mechanismen, zu denen auch die Zytokin-vermittelte Monozytenrekrutierung 9,12 gehört. Darüber hinaus können B-Zellen Antikörper gegen Herzproteine produzieren, die die Ausdehnung von Herzschäden und nachteiligen kardialen Umbau durch mehrere Mechanismen fördern können 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B-Zellen können durch die Sekretion von IL-1010 auch schützende Wirkungen auf das verletzte Herz ausüben.
Da die Zahl der Gruppen, die die Rolle von B-Zellen im naiven und verletzten Herzen untersuchen, wächst, wird es immer wichtiger, gemeinsame Protokolle zu definieren, um myokardiale B-Zellen richtig zu quantifizieren und zu bewerten und so Inkonsistenzen zu vermeiden, die bereits in der Literatur aufgetreten sind. Bisher wurde berichtet, dass B-Zellen eine der häufigsten Immunzellen im Nagetierherz sind7 und in einer deutlich geringeren Prävalenz als myeloische Zellen vorhanden sind 26,27 oder ziemlich selten 28. In ähnlicher Weise haben mehrere Gruppen beschrieben, dass die Anzahl der myokardialen B-Zellen nach akuter ischämischer Myokardverletzung zunimmt 7,9,13, aber eine Gruppe berichtete über keine Veränderungen in der Anzahl der B-Zellen des verletzten Myokards29. Studien an kardialen Immunzellen geben selten Details über die Durchblutungsbedingungen und es gibt keinen Konsens über die Verdauungsbedingungen. Da im Nagetierherz ein großer Teil der B-Zellen intravaskulär ist und die Extraktion von Immunzellen aus dem Myokard stark von der verwendeten Verdauungsmethode abhängt, könnten die in der Literatur berichteten Unterschiede auf Unterschiede in der Organdurchblutung und der Gewebeverdauung zurückzuführen sein.
Hier wird eine detaillierte Methode zur Durchflusszytometrie-basierten Quantifizierung von murinen myokardialen B-Zellen vorgestellt, die die Ausbeute der B-Zell-Erholung durch Optimierung der Perfusions- und Verdauungsbedingungen maximiert und die Unterscheidung von intravaskulären vs. extravaskulären myokardialen B-Zellen ermöglicht6. Dieses Protokoll ist eine Anpassung und Optimierung anderer ähnlicher Protokolle, die zwischen intravaskulären und interstitiellen Immunzellen unterscheiden 28,30,31.
In diesem Protokoll standardisieren wir die Myokardperfusion, um B-Zellen zu eliminieren, die im intravaskulären Raum schwimmen, ohne biologisch relevante B-Zellen zu entfernen, die am mikrovaskulären Endothel haften. Aufbauend auf früheren Protokollen, die die Verwendung der intravenösen Injektion von Antikörpern zur Unterscheidung von intravaskulären von interstitiellen Immunzellenbeschrieben haben 32, und unter Ausnutzung der Tatsache, dass B-Zellen den Oberflächenmarker B22033 exprimieren, zeigen wir, wie intravaskuläre vs. extravaskuläre myokardiale B-Zellen durch intravaskuläre Injektion eines B220-spezifischen Antikörpers unmittelbar vor der Tiertötung und Herzperfusion unterschieden werden können. Dieses Protokoll ist relevant für die Forschung eines jeden Wissenschaftlers, der daran interessiert ist, die Analyse von Myokard-B-Zellen im naiven und verletzten Herzen einzubeziehen. Die breite Implementierung dieses Protokolls wird Inkonsistenzen zwischen den Forschungsgruppen reduzieren, die Analyse von Veränderungen in den intravaskulären und extravaskulären myokardialen B-Zell-Pools ermöglichen und somit den Fortschritt der Entdeckungen auf dem Gebiet der kardialen Immunologie unterstützen.
Zusammenfassend stellt das Protokoll einen optimierten Workflow dar, um myokardiale B-Zellen mittels Durchflusszytometrie zu quantifizieren und zu analysieren und gleichzeitig zwischen Zellen im extravaskulären Raum und im intravaskulären Raum zu unterscheiden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody</td>
			<td>101222</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100 &#181;g 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 &#181;m, Blue</td>
			<td>QBIAP303</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube</td>
			<td>1605-0000</td>
			<td>SealRite, USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Injection, USP</td>
			<td>114-055-101</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>0.90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>SealRite, USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11213810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11267810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free</td>
			<td>430052</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Way Stop Valve, Polycarbonate</td>
			<td>SVPT951</td>
			<td>ECT Manufacturing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td>T48402</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11208810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Way Stop Valve, Polycarbonate</td>
			<td>SVPT953</td>
			<td>ECT Manufacturing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style</td>
			<td>352054</td>
			<td>Falcon, a Corning Brand</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free</td>
			<td>430290</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63</td>
			<td>5810759005</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62</td>
			<td>22638289</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 &#8211; 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62</td>
			<td>22638246</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil 12 in x 75&#39; Roll .0007</td>
			<td>UPC 109153</td>
			<td>Reynolds Wrap</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Induction Chamber - Mouse</td>
			<td>RWD-AICMV-100</td>
			<td>Conduct Science</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL</td>
			<td>309626</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2&#34; 100-Pack</td>
			<td>CMD 2613</td>
			<td>Brandzig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody</td>
			<td>115537</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 &#181;m, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile</td>
			<td>T9009</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Dioxide USP E CGA 940&#160;</td>
			<td>CD USPE</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL</td>
			<td>UX-34502-46</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 2</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector brass chrome plated 1/4&#34; female NPT x 1/4&#34; barb</td>
			<td>Y992611-AG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytek Aurora Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td>Cytek Biosciences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP</td>
			<td>M-08-12</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I - 40,000 U</td>
			<td>D4527</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypet&#160;3 - Electronic Pipette Controller</td>
			<td>4430000018</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Balance, AX223/E</td>
			<td>30100606</td>
			<td>Ohaus Corp.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes</td>
			<td></td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.1</td>
			<td></td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100)</td>
			<td>Z740287</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]</td>
			<td>14025076</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>H3506</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostats, Straight</td>
			<td>13018-14</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL</td>
			<td>302831</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940</td>
			<td>M1-940-PG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McKesson Underpads, Moderate</td>
			<td>4033-CS150</td>
			<td>McKesson</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navigator Multi-Purpose Portable Balance</td>
			<td>NV2201</td>
			<td>Ohaus Corp.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]</td>
			<td>10010023</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody</td>
			<td>103208</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>200 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>103132</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100 &#181;g 500 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene</td>
			<td>FB0875711YZ</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02</td>
			<td>M08-1</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator</td>
			<td>LED-6W</td>
			<td>AmScope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm)</td>
			<td>305122</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO)</td>
			<td>553141</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company Biosciences</td>
			<td>0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 4.1.1</td>
			<td></td>
			<td>The R Foundation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>9501250000</td>
			<td>Accutec Blades Inc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet</td>
			<td>Y12244A320-AG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets</td>
			<td>Rotor A-4-62</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma label tape</td>
			<td>L8394</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroFlo 3.0.0</td>
			<td></td>
			<td>Cytek Biosciences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8&#34; Hose Barb; 1/EA</td>
			<td>MTLL230-6005</td>
			<td>Spex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8&#34; ID x 3/16&#34; OD x 1/32&#34; Wall x 50&#39; Long</td>
			<td>CG-730-003</td>
			<td>Excelon Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe PP/PE without needle, 3 mL</td>
			<td>Z683566</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>55-1199 (95-240)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500</td>
			<td>9371W13</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rack, 12&#160;positions, 6 for 5.0&#160;mL and 15&#160;mL tubes and 6 for 25&#160;mL and 50&#160;mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable</td>
			<td>30119835</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rack, 12&#160;positions, for 5.0&#160;mL and 15&#160;mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable</td>
			<td>30119827</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. &#215; O.D. 1/4 in. &#215; 3/8 in.</td>
			<td>T8913 (Millipore Sigma)</td>
			<td>Tygon, Saint-Gobain</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Scientific Industries, Inc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips</td>
			<td>89259-946</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4&#189;&#34;</td>
			<td>82027-578</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I</td>
			<td>12620-946</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>423102</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry-based quantification and analysis of myocardial b-cells

Eine wachsende Zahl von Beweisen zeigt, dass B-Lymphozyten eine wichtige Rolle im Zusammenhang mit der Myokardphysiologie und der myokardialen Anpassung an Verletzungen spielen. In der Literatur gibt es jedoch widersprüchliche Daten zur Prävalenz von Myokard-B-Zellen. Es wurde berichtet, dass B-Zellen sowohl zu den am häufigsten vorkommenden Immunzellen im Nagetierherz gehören als auch vorhanden sind, jedoch mit einer deutlich geringeren Prävalenz als myeloische Zellen oder ziemlich selten sind. In ähnlicher Weise haben mehrere Gruppen beschrieben, dass die Anzahl der myokardialen B-Zellen nach akuter ischämischer Myokardverletzung zunimmt, aber eine Gruppe berichtete über keine Veränderungen in der Anzahl der B-Zellen des verletzten Myokards. Die Implementierung einer gemeinsamen, reproduzierbaren Methode zur Beurteilung der Prävalenz von myokardialen B-Zellen ist entscheidend, um die Beobachtungen verschiedener Forschungsgruppen zu harmonisieren und so die Weiterentwicklung der Untersuchung von B-Zell-Myokardinteraktionen zu fördern. Basierend auf unseren Erfahrungen stammen die scheinbar gegensätzlichen Beobachtungen, die in der Literatur berichtet werden, wahrscheinlich auf die Tatsache, dass murine myokardiale B-Zellen meist intravaskulär und mit dem mikrovaskulären Endothel verbunden sind. Daher ist die Anzahl der B-Zellen, die aus einem murinen Herzen gewonnen werden, äußerst empfindlich gegenüber den Perfusionsbedingungen, die zur Reinigung des Organs verwendet werden, und von der verwendeten Verdauungsmethode. Hier berichten wir über ein optimiertes Protokoll, das diese beiden kritischen Variablen auf spezifische Weise berücksichtigt. Dieses Protokoll ermöglicht eine reproduzierbare, auf Durchflusszytometrie basierende Analyse der Anzahl der murinen myokardialen B-Zellen und ermöglicht es den Forschern, extravaskuläre vs. intravaskuläre myokardiale B-Zellen zu unterscheiden.

Sobald die Erfassung abgeschlossen ist und alle Ereignisse erfasst sind, sollten die Daten gemäß der Standard-Durchflusszytometrie analysiert werden. Der Fokus der Analyse variiert je nach individuellem Ziel des jeweiligen Experiments. In diesem Fall wurde die Quantifizierung von intravaskulären und extravaskulären B-Zellen durchgeführt, die als Anzahl der Zellen pro mg Gewebe ausgedrückt wurde.
Bei der Verwendung eines Spektralzytometers wird empfohlen, die Analyse mit einem ersten Gati...

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Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells

Hier berichten wir über ein Protokoll zur Quantifizierung und Differenzierung von myokardialen B-Lymphozyten basierend auf ihrer Lage im intravaskulären oder endothelialen Raum mittels Durchflusszytometrie.

Durchflusszytometrie-basierte Quantifizierung und Analyse von Myokard-B-Zellen

A growing body of evidence shows that B-lymphocytes play an important role in the context of myocardial physiology and myocardial adaptation to injury. ...

Die Literatur berichtet von widersprüchlichen Daten zur Prävalenz von Myokard-B-Zellen. Dies ist wahrscheinlich auf die Variabilität der Perfusions- und Verdauungstechniken zurückzuführen. Unser Protokoll ermöglicht eine reproduzierbare Durchflusszytometrie-basierte Analyse von Myokard-B-Zellen.Diese Technik maximiert die Ausbeute an B-Zellen und reduziert die Variabilität der Durchflusszytometrie-Zahlen zwischen B-Zellen und anderen Populationen aus Herzproben. Diese optimierte Verdauungs- und Isolierungsmethode kann leicht modifiziert werden, um ein erweitertes Antikörperpanel zu implementieren, um verschiedene Immunzelltypen im Herzen zu untersuchen. Das Protokoll kann auch auf andere Organe wie Lunge oder Leber angewendet werden, um B-Zellen zu untersuchen, die mit diesen Organen assoziiert sind.Wiegen Sie zunächst eine 12 Wochen alte männliche Maus. Beladen Sie eine 310-cm³-Insulinspritze mit 100 Mikrolitern der B220-Antikörperlösung. Injizieren Sie den verdünnten B220-Antikörper durch retroorbitale Injektion und fahren Sie sofort mit der Organentnahme und Perfusion fort.Halten Sie nach der Euthanasie die Haut der Maus mit einer Pinzette im Oberbauchbereich. Machen Sie mit einer Schere eine zwei Millimeter große Öffnung in der Haut und ziehen Sie die Haut mit der Pinzette ab, um die Faszienschicht freizulegen. Schneiden Sie am Epigastrium durch die Faszie und das Peritoneum.Klemmen Sie den Xiphoid-Prozess mit einer hämostatischen Pinzette. Machen Sie einen vertikalen Schnitt durch die Brustwand auf Höhe der Mittelklavikularlinie auf jeder Seite und heben Sie die vordere Brustwand an, um den Mediastinuminhalt freizulegen. Halten Sie die Aorta mit einer Pinzette sicher von hinten.Führen Sie die Spritzennadel in die Herzspitze ein. Perfundiert mit drei Millilitern HBSS mit einer Geschwindigkeit von drei Millilitern pro Minute. Schneiden Sie die Aorta und entfernen Sie das Herz.Waschen Sie das Herz in der Petrischale mit HBSS. Wiegen Sie das isolierte Herz und notieren Sie das Gewicht in Milligramm. Zerkleinern Sie das Herz bei Raumtemperatur mit einer Klinge in kleine Stücke.Die Herzstücke sollten etwa 1,5 Millimeter groß sein. Messen Sie die Masse des Herzgewebes mit einer Waage und geben Sie 60 Milligramm des zu verdauenden Hackfleisches in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit drei Millilitern HBSS auf Eis. Wiederholen Sie diesen Vorgang für eine Maus, die die B220-Antikörperinjektion nicht erhalten hat, und legen Sie sie in das Röhrchen mit drei Millilitern HBSS-markiertem Referenzkontrollgewebe.Fügen Sie Enzyme zu jedem Röhrchen hinzu, das Hackgewebe enthält. Fügen Sie 0,5 Mikroliter pro Milligramm DNase I, 0,5 Mikroliter pro Milligramm Kollagenase II und 0,2 Mikroliter pro Milligramm Hyaluronidase hinzu. Legen Sie die Verdauungsreaktion für 30 Minuten mit 300 Umdrehungen pro Minute in den Schüttler.Die Rohre werden in einem kleinen Winkel von etwa 25 Grad Neigung in den Shaker gelegt. In jedes der 15-Milliliter-Reaktionsröhrchen sieben Milliliter HBSS geben und fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 250 g zentrifugieren. Nach dem Dekantieren des Überstands wird jedes Pellet in fünf Milliliter ACK-Lysepuffer resuspendiert.Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nachdem Sie 10 Milliliter PBS in jedes Röhrchen gegeben haben, mischen und filtrieren Sie es in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit einem 40-Mikrometer-Sieb. Zertrümmern Sie alle Schmutzpartikel auf dem Filter mit einem Spritzenkolben, um sicherzustellen, dass das gesamte Material durch den Filter gelangt.Nach der Zugabe von PBS durch den Filter, bis das Volumen 25 Milliliter pro Herz erreicht, fügen Sie weitere 25 Milliliter PBS in das Referenzkontrollgeweberöhrchen hinzu und teilen Sie das Volumen in zwei verschiedene Röhrchen auf. Beschriften Sie eine der Röhrchen als unbefleckt und die andere als lebend / tot. Nach dem Zentrifugieren bei 250 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius dekantiert der Überstand und resuspendiert das ungefärbte Röhrchen in 100 Mikroliter PBS und jedes der anderen Pellets in 100 Mikroliter der lebenden/toten Fleckenlösung.30 Minuten im Dunkeln auf Eis brüten. Nachdem Sie jeder Probe 500 Mikroliter FACS-Puffer zugesetzt haben, geben Sie sie durch einen 40-Mikrometer-Filter in ein FACS-Röhrchen. Nachdem Sie die FACS-Röhrchen bei 250 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius abgelehnt und den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikroliter FACS-Puffer.Fügen Sie 50 Mikroliter FC-Blockierungslösung zu jedem Röhrchen hinzu, mit Ausnahme der ungefärbten und lebenden/toten Röhrchen. Mischen und fünf Minuten lang inkubieren. Nach Zugabe von 50 Mikrolitern Antikörper-Mischlösung zu jedem Röhrchen, mit Ausnahme der ungefärbten und lebenden/toten Röhrchen, inkubieren Sie für 30 Minuten im Dunkeln und bedecken Sie den Eiskübel mit Aluminiumfolie.Wie beim lebenden/toten Fleck erneut mit 500 Mikrolitern FACS-Puffer waschen und in 300 bis 500 Mikrolitern FACS-Puffer resuspendieren. Öffnen Sie die Instrumentensteuerungssoftware. Wählen Sie oben im Fenster die Registerkarte Akquisition und klicken Sie auf Neu.Geben Sie im Bibliotheksbereich im Feld Zu filternden Typ PE, PerCP-Cy5.5, Brillantviolett 421, Alexa Fluor 700 und Zombie Aqua ein, wählen Sie das Fluoro-4 aus und klicken Sie nach der Eingabe auf Hinzufügen. Klicken Sie dann auf Weiter, um zur Registerkarte Gruppen zu gelangen. Klicken Sie nun auf das Symbol mit einer Röhre, um das Herz für die Analyse hinzuzufügen.Klicken Sie auf die Referenzgruppe und es öffnet sich ein Fenster. Wählen Sie in der Spalte fluoreszierende Tags Zombie Aqua als fluoreszierendes Tag aus und löschen Sie alle anderen, indem Sie auf das rote Papierkorbsymbol daneben klicken. Wählen Sie dann im Symbol "Steuerelementtyp" die Option "Zellen" aus.Klicken Sie dann auf Speichern. Klicken Sie auf Weiter. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Marker.Eine Tabelle wird angezeigt. Geben Sie die entsprechende Zellmarkierung in die erste Zeile jeder Fluor-4-Spalte ein und drücken Sie die Eingabetaste. Klicken Sie zweimal auf Weiter, um zur Registerkarte Erfassung zu gelangen.Geben Sie im Feld Ereignisse zur Aufzeichnung der experimentellen Stichproben 10 Millionen und im selben Feld für die Referenzgruppenzeile 200.000 ein. Klicken Sie auf Speichern und öffnen. Klicken Sie unten links auf Instrument Control.Stellen Sie die Spannung auf FSC 50, SSC 175, SSC-B 175 ein. Wählen Sie das Erfassungssteuerelement aus. Wählen Sie für die Option "Durchflussrate" im Dropdown-Menü die Option "Hoch" aus.Wirbeln Sie den ungefärbten Herzschlauch vor und legen Sie ihn sicher auf die Probeninjektionsöffnung. Stellen Sie sicher, dass der grüne Indikatorpfeil auf die richtige Stichprobe zeigt. Klicken Sie dann auf Aufzeichnen und warten Sie, bis die Ereignisse aufgezeichnet wurden.Machen Sie dasselbe für das lebende/tote gefärbte Herzgewebe. Wählen Sie das Menü "Unmix" und legen Sie die Steuerelemente fest. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Autofluoreszenz als fluoreszierendes Tag.Klicken Sie dann auf Weiter, um zur Registerkarte Positive/Negative Populationen identifizieren zu gelangen. Auf dieser Registerkarte wird ein Diagramm des Forward-Scatter-Bereichs im Vergleich zum Side-Scatter-Bereich angezeigt. Klicken Sie auf die Punkte des Polygons, und ziehen Sie sie, um einen Bereich zwischen 1 und 4 Millionen auf der Achse des vorderen Punktbereichs und zwischen 0,2 und 3 Millionen auf der Achse des seitlichen Punktbereichs auszuwählen.Im nächsten Diagramm rechts wird V5-A auf der X-Achse angezeigt. Verschieben Sie die Tore, um die Hälfte des Gipfels ganz rechts als positiv und einen Bereich auf der linken Seite des Diagramms als negativ auszuwählen. Wählen Sie im Diagramm mit dem Titel "Referenzgruppe-Ungefärbt" eine Grundgesamtheit in einem ähnlichen Bereich aus.Für die Ungefärbten muss kein Positiv/Negativ ausgewählt werden. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Live Unmixing". Erfassen Sie nun die experimentellen Proben, wirbeln Sie das Röhrchen und legen Sie es sicher auf das SIP.Stellen Sie sicher, dass der grüne Indikatorpfeil auf die richtige Stichprobe zeigt. Klicken Sie dann im Bereich "Erfassungssteuerung" der Zytometersoftware auf "Aufzeichnen" und warten Sie, bis die Ereignisse aufgezeichnet wurden. Wählen Sie die Registerkarte Ungemischtes Standardarbeitsblatt aus.Erstellen Sie ein FCS-A- und SSC-A-Diagramm mit dem Punktdiagramm-Werkzeug oben. Wählen Sie Ereignisse mit mehr als 0,4 Millionen auf der FSC-A-Achse und mehr als 0,8 Millionen auf der SSC-A-Achse mit dem Polygonauswahlwerkzeug aus. Erstellen Sie ein neues Diagramm, indem Sie auf die Auswahl doppelklicken, und klicken Sie in diesem neuen Diagramm mit der rechten Maustaste auf die Y-Achsenbeschriftung und wählen Sie lebenden/toten Fleck aus.Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Beschriftung der X-Achse und wählen Sie Autofluoreszenz A. Wählen Sie alle Ereignisse unter 10 bis zum fünften auf der Lebend-/Tot-Achse aus. Dies sind die lebenden Zellen. Doppelklicken Sie in diese Auswahl.Wählen Sie im neuen Diagramm PerCP-Cy5.5A für die X-Achse und SSC-A für die Y-Achse aus. Wählen Sie die Populationen auf der rechten Seite des PerCP-Cy5.5A aus. Das sind die Immunzellen.Doppelklicken Sie auf die Auswahl. Wählen Sie im neuen Diagramm FSC-A für die X-Achse und Vorwärtsstreuhöhe für die Y-Achse aus. Wählen Sie die Ereignisse aus, die einem Trend folgen, bei dem der FSC-A-Wert und der SSC-A-Wert identisch sind.Dadurch werden einzelne Zellen selektiert und Dubletten eliminiert. Doppelklicken Sie auf diese Auswahl, um ein neues Diagramm in der CD45-positiven Einzelzellpopulation anzuzeigen. Wählen Sie aus dem CD45-positiven Einzelzellpopulationsdiagramm brillantes Violett 421 auf der X-Achse gegenüber SSC-A auf der Y-Achse aus.Wählen Sie die Grundgesamtheit rechts auf der leuchtend violetten 421-Achse aus. Dies ist die B-Zell-Population. Doppelklicken Sie zweimal auf diese Grundgesamtheit, um zwei neue Diagramme mit der B-Zell-Grundgesamtheit zu erstellen.Richten Sie das erste B-Zell-Diagramm mit PEA auf der X-Achse und brillantem Violett 421A auf der Y-Achse ein. Die Population auf der rechten Seite entspricht den intervaskulären B-Zellen und die Population auf der linken Seite repräsentiert die interstitiellen B-Zellen. Wählen Sie beides aus.Richten Sie das zweite B-Zell-Diagramm mit Alexa Fluor 700A auf der X-Achse und SSC-A auf der Y-Achse ein. Die Population auf der linken Seite entspricht den CD11b-negativen Zellen, und die Ereignisse auf der rechten Seite entsprechen den CD11b-positiven Zellen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die einzelnen Abschnitte, und klicken Sie dann auf Gate-Eigenschaften.Klicken Sie auf Anzahl und Eltern, um die Anzahl der Ereignisse und Prozentsätze der übergeordneten Populationen anzuzeigen. Zeichnen Sie die Anzahl der Ereignisse und Prozentsätze für die weitere Datenanalyse auf. Nach der Entfernung von Dubletten in einem naiven unverletzten Herzen wird erwartet, dass etwa 20% der CD45-positiven Zellen CD19-positive B-Zellen sein werden.Von diesen Zellen befinden sich durchschnittlich 5,5% im interstitiellen Raum. 94,5% befinden sich im intravaskulären Raum. Von der gesamten B-Zell-Population im Herzen entsprechen nur etwa 1,6 % B1-Zellen, basierend auf dem Oberflächenmarker CD11b, und die anderen 98,4 % entsprechen B2-Zellen.Bei der Analyse von Myokard-B-Zellen mittels Durchflusszytometrie ist es entscheidend, das Herz gemäß dem Protokoll richtig zu perfundiert und zu zerkleinern. Die richtige Filtration des verdauten Herzens ist ebenfalls wichtig, um die Erholung der Immunzellen zu maximieren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Mausmodell der CD40-Aktivierung von B-Zellen

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Forschung

Immunologie und Infektion

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Die Isolation, Differenzierung und Quantifizierung von Human-Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus Blut: ELISpot als Functional Readout der humoralen Immunität

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Durchflusszytometrie-basierte Assay zur Überwachung von NK-Zell-Funktionen

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion<em&gt; In Vivo</em&gt; Mit einem Durchfluss-Zytometrie basierten Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Detektion und Anreicherung von Rare Antigen-spezifische B-Zellen für die Analyse von Phänotypen und Funktion

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Ein Flow Cytometry-basierte Zytotoxizität Assay für die Beurteilung der menschlichen NK-Zell-Aktivität

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Eine einfache Durchflusszytometrie basierten Test um festzustellen, In-vitro- Antikörper abhängige Verbesserung des Dengue-Virus mit Zika-Virus genesenden Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Analyse der Scherung strömungsinduzierte Migration der Murine Marginal Zone B-Zellen In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Multicolor Flow Cytometry-basierte Quantifizierung der Mitochondrien, Lysosomen in T-Zellen

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...