Name: flow cytometry-based quantification and analysis of myocardial b-cells
Uploaded: 2022-08-17T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי מענקי NHLBI 5K08HLO145108-03 ו- 1R01HL160716-01 שהוענקו ללואיג'י אדמו.
ציטומטר זרימת אורורה ששימש לפיתוח מחקר זה מומן על ידי NIH Grant S10OD026859. אנו מכירים בתמיכתה של ליבת הציטומטריה של זרימת JHU Ross.

כל הניסויים המתוארים בכתב יד זה בוצעו באישור IACUC בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס.
1. הכנות
<ol><li>הכן את מאגר FACS, כמתואר בטבלה 1.</li>
	<li>ודא שיש מספיק CO2 כדי להרדים את בעלי החיים.</li>
	<li>הכינו את חלל הנתיחה (הניחו את משטח הספסל והניחו את כלי הקלטת ...

<ol>
	<li>Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+B+lymphocytes+in+cardiovascular+disease.">The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease.</a> Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).</li><li>Gowans, J. L., Knight, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+route+of+re-circulation+of+lymphocytes+in+the+rat.">The route of re-circulation of lymphocytes in the rat.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).</li><li>Kunkel, E. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+the+tissue-specific+migration+of+lymphocytes.">Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes.</a> Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+controlling+homeostatic+recirculation+and+tissue-specific+trafficking+of+lymphocytes.">Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).</li><li>Rocha-Resende, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+myocardial+B+cells+mirror+changes+in+B+cells+associated+with+different+organs.">Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs.</a> JCI Insight. 5 (16), (2020).</li><li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+B+cells+are+a+subset+of+circulating+lymphocytes+with+delayed+transit+through+the+heart.">Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart.</a> JCI Insight. 5 (3), 139377 (2020).</li><li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+subsets+of+cardiac+B+lymphocytes+improves+cardiac+function+after+acute+injury.">Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury.</a> JCI Insight. 3 (11), (2018).</li><li>Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+modulate+the+expression+of+MHC-II+on+cardiac+CCR2(-)+macrophages.">B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).</li><li>Zouggari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+trigger+monocyte+mobilization+and+impair+heart+function+after+acute+myocardial+infarction.">B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).</li><li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-10-producing+B+cells+are+enriched+in+murine+pericardial+adipose+tissues+and+ameliorate+the+outcome+of+acute+myocardial+infarction.">IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).</li><li>Heinrichs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+mobilizes+a+distinct+B-cell+subset+through+a+CXCL13-CXCR5-dependent+mechanism.">The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism.</a> Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splenic+marginal+zone+B+lymphocytes+regulate+cardiac+remodeling+after+acute+myocardial+infarction+in+mice.">Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice.</a> Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).</li><li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+dynamics+of+cardiac+immune+cell+accumulation+following+acute+myocardial+infarction.">Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).</li><li>Iwata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+against+the+second+extracellular+loop+of+beta(1)-adrenergic+receptors+induces+beta-adrenergic+receptor+desensitization+and+myocardial+hypertrophy+in+vivo.">Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo.</a> Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).</li><li>Jahns, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+a+beta+1-adrenergic+receptor-directed+autoimmune+attack+as+a+cause+of+idiopathic+dilated+cardiomyopathy.">Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).</li><li>Christ, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+against+the+beta1+adrenoceptor+from+patients+with+dilated+cardiomyopathy+prolong+action+potential+duration+and+enhance+contractility+in+isolated+cardiomyocytes.">Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).</li><li>Jane-wit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenergic+receptor+autoantibodies+mediate+dilated+cardiomyopathy+by+agonistically+inducing+cardiomyocyte+apoptosis.">Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis.</a> Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).</li><li>Ludwig, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+autoantibody-induced+pathology.">Mechanisms of autoantibody-induced pathology.</a> Frontiers in Immunology. 8, 603 (2017).</li><li>Haudek, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor+engagement+mediates+differentiation+of+cardiac+fibroblast+precursor+cells.">Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).</li><li>Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc(gamma)+receptors+IIa+on+cardiomyocytes+and+their+potential+functional+relevance+in+dilated+cardiomyopathy.">Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy.</a> Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+natural+IgM+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury.">The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+specific+self-reactive+IgM+antibody+that+initiates+intestinal+ischemia/reperfusion+injury.">Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).</li><li>Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+ADP-ATP+carrier--an+autoantigen+in+myocarditis+and+dilated+cardiomyopathy--impair+cardiac+function.">Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function.</a> Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).</li><li>Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+epitope+spreading+is+a+critical+step+for+the+switch+from+C-protein-induced+myocarditis+to+dilated+cardiomyopathy.">B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy.</a> The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).</li><li>Caforio, A. L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+state+of+knowledge+on+aetiology,+diagnosis,+management,+and+therapy+of+myocarditis:+a+position+statement+of+the+European+Society+of+Cardiology+Working+Group+on+Myocardial+and+Pericardial+Diseases.">Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases.</a> European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues.">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Horckmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericardial+adipose+tissue+regulates+granulopoiesis,+fibrosis+and+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction.</a> Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Bajpai, G., Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+macrophage+subsets+and+stromal+cells+from+human+and+mouse+myocardial+specimens.">Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60015 (2019).</li><li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes.">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li><li>Coffman, R. L., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B220:+a+B+cell-specific+member+of+th+T200+glycoprotein+family.">B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family.</a> Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).</li><li>Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+B+cell+development+in+the+fetus+and+adult.">B-1 B cell development in the fetus and adult.</a> Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).</li><li>Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+B+cells+in+cardiomyopathy+and+heart+failure.">The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure.</a> Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).</li><li>Zhao, T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rituximab+in+patients+with+acute+ST-elevation+myocardial+infarction:+an+experimental+medicine+safety+study.">Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).</li><li>Kushnir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B2+but+not+B1+cells+can+contribute+to+CD4++T-cell-mediated+clearance+of+rotavirus+in+SCID+mice.">B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice.</a> Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).</li></ol>

גוף הולך וגדל של ראיות מצביע על כך שתאי B ממלאים תפקיד חשוב בהקשר של פיזיולוגיה של שריר הלב ושיפוץ/הסתגלות שריר הלב לפציעה 7,8,9,10,11,12,13,36. ציטומטר...

לימפוציטים מסוג B הם תאים חיסוניים מיוחדים מאוד הממלאים תפקיד חשוב הן בתגובה החיסונית הנרכשת והן בתגובה החיסונית המולדת1. ישנן שתי אוכלוסיות עיקריות של תאי B: אוכלוסייה קטנה יותר של תאי B1 המיוצרים בעיקר במהלך החיים העובריים, ואוכלוסייה מוקדמת של תאי B2 המיוצרים בחיים הבוגרים במח העצם1. לאחר ההתבגרות במח העצם, תאי B נודדים לאיברי לימפה ראשוניים ומשניים. משם הם חוזרים ללא הרף בין איברי הלימפה העוברים דרך כלי הדם וכלי הלימפה2. תאי B מבטאים נוגדנים ספציפיים על פני השטח שלהם, המתפקדים כקולטנים. כאשר תאי B נתקלים באנטיגן שנקשר לקולטן שלהם, ניתן להפעיל אות מפעיל. תאי B פעילים נודדים לרקמה שבה נמצא האנטיגן או חוזרים למח העצם, שם הם יכולים להבשיל לתאי פלזמה המייצרים נוגדנים 3,4.
לאחרונה, זה כבר מוערך כי הלב מכיל אוכלוסייה גדולה של תאי B. מחקרים במכרסמים הראו כי תאי B מאכלסים את הלב בשלב מוקדם במהלך ההתפתחות העוברית5, וכי תאי B הקשורים לשריר הלב הם בעיקר תאי B2 תוך-וסקולריים, נאיביים, הנצמדים לאנדותל6,7, עם אחוז קטן של תאי B1 7. ישנם עדיין תחומים רבים של אי ודאות, אך הנתונים הזמינים מצביעים על כך שתאי B ממלאים תפקיד חשוב הן בלב התמים והן בהקשר של הסתגלות שריר הלב לפציעה.
מחקרים בלב המורין התמים הראו כי בנקודת ההתחלה תאי B של שריר הלב ממוקמים בעיקר בחלל התוך-וסקולרי, דבוקים לאנדותל (>95% מתאי ה-B הלבביים של מורין נמצאו ממוקמים בחלל התוך-וסקולרי). נמצא כי לתאי B אלה יש דפוסי ביטוי גנים שונים מאלה של תאי B במחזור הדם שבודדו מהדם ההיקפי. ניתוח של לבבות תמימים מבעלי חיים עם מחסור בתאי B ובקרות סינגניות מצאו שלבעלי חיים חסרי תאי B היו לבבות קטנים יותר ולחלקפליטה גבוה יותר 6. כל הראיות הללו מצביעות על כך שתאי B עשויים לווסת את גדילת שריר הלב ו/או את תפקוד שריר הלב, וכי לא רק תאי B אינטרסטיציאליים אלא גם תוך-וסקולריים יכולים להיות אחראים לתצפיות כאלה. כמו כן, נמצאו תאי B המווסתים את הפנוטיפ של מקרופאגים המתגוררים בשריר הלב8.
מספר מחקרים הראו כי תאי B ממלאים תפקיד חשוב בהקשר של הסתגלות שריר הלב לפציעה 8,9,10,11,12,13. תאי B מצטברים באופן חולף בלב הפגוע, ככל הנראה באמצעות מנגנון תלוי CXCL13-CXCR511,13. משם, תאי B מקדמים שיפוץ לב שלילי באמצעות מספר מנגנונים הכוללים גיוסמונוציטים בתיווך ציטוקינים 9,12. בנוסף, תאי B יכולים לייצר נוגדנים נגד חלבוני לב שיכולים לקדם את הרחבת הנזק הלבבי ושיפוץ לב שלילי באמצעות מספר מנגנונים 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . תאי B יכולים גם להפעיל השפעה מגנה על הלב הפגוע באמצעות הפרשת IL-1010.
ככל שמספר הקבוצות החוקרות את תפקידם של תאי B בלב התמים והפצוע גדל, חשוב יותר ויותר להגדיר פרוטוקולים משותפים כדי לכמת ולהעריך כראוי תאי B שריר הלב ובכך למנוע חוסר עקביות שכבר החלו להופיע בספרות. עד כה דווח כי תאי B הם כאחד מתאי החיסון השכיחים ביותר בלב המכרסם7 ונמצאים בשכיחות נמוכה משמעותית מאשר תאים מיאלואידים 26,27, או נדירים למדי28. באופן דומה, מספר קבוצות תיארו כי מספר תאי B שריר הלב עולה לאחר פגיעה איסכמית חריפה בשריר הלב 7,9,13, אך קבוצה אחת לא דיווחה על שינויים במספר תאי B של שריר הלבהפגוע 29. מחקרים על תאי חיסון לבביים כמעט ולא נותנים פרטים על תנאי פרפוזיה ואין הסכמה על תנאי העיכול. מכיוון שבלב מכרסם חלק גדול מתאי B הם תוך-וסקולריים ומיצוי תאי מערכת החיסון משריר הלב תלוי מאוד בשיטת העיכול שבה נעשה שימוש, ההבדלים המדווחים בספרות עשויים להיות תוצאה של הבדלים בזליגת איברים ובעיכול רקמות.
מוצגת כאן שיטה מפורטת לכימות מבוסס ציטומטריה של זרימה של תאי B שריר הלב של מורין, אשר ממקסמת את התשואה של התאוששות תאי B על ידי אופטימיזציה של תנאי הזלוף והעיכול ומאפשרת הבחנה של תאי B תוך-וסקולרייםלעומת תאי B חוץ-וסקולריים 6. פרוטוקול זה הוא התאמה ואופטימיזציה של פרוטוקולים דומים אחרים המבחינים בין תאי חיסון תוך-וסקולריים ואינטרסטיציאליים 28,30,31.
בפרוטוקול זה, אנו מבצעים סטנדרטיזציה של פרפוזיה שריר הלב כדי לחסל תאי B שצפים בחלל התוך-וסקולרי מבלי להסיר תאי B רלוונטיים ביולוגית שנדבקו לאנדותל המיקרו-וסקולרי. יתר על כן, בהתבסס על פרוטוקולים קודמים שתיארו את השימוש בהזרקה תוך ורידית של נוגדנים כדי להבחין בין תאי חיסון תוך-ורידיים לתאי חיסון אינטרסטיציאליים32, ותוך ניצול העובדה שתאי B מבטאים את סמן פני השטח B22033, אנו מדגימים כיצד להבחין בין תאי B תוך-וסקולריים לעומת תאי B חוץ-וסקולריים באמצעות הזרקה תוך-וסקולרית של נוגדן ספציפי ל-B220 מיד לפני הקרבת בעלי החיים וזליגת הלב. פרוטוקול זה רלוונטי למחקרו של כל מדען המעוניין לכלול ניתוח של תאי B שריר הלב בלב התמים והפצוע. יישום נרחב של פרוטוקול זה יפחית את חוסר העקביות בין קבוצות המחקר, יאפשר ניתוח של שינויים בבריכות תאי B תוך-וסקולריים וחוץ-וסקולריים, ובכך יחזק את קידום התגליות בתחום האימונולוגיה של הלב.
לסיכום, הפרוטוקול מייצג זרימת עבודה אופטימלית לכימות וניתוח תאי B שריר הלב באמצעות ציטומטריית זרימה, ובמקביל להבחין בין תאים הממוקמים בחלל החוץ-וסקולרי לבין החלל התוך-וסקולרי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody</td>
			<td>101222</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100 &#181;g 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 &#181;m, Blue</td>
			<td>QBIAP303</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube</td>
			<td>1605-0000</td>
			<td>SealRite, USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Injection, USP</td>
			<td>114-055-101</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>0.90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>SealRite, USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11213810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11267810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free</td>
			<td>430052</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Way Stop Valve, Polycarbonate</td>
			<td>SVPT951</td>
			<td>ECT Manufacturing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td>T48402</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11208810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Way Stop Valve, Polycarbonate</td>
			<td>SVPT953</td>
			<td>ECT Manufacturing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style</td>
			<td>352054</td>
			<td>Falcon, a Corning Brand</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free</td>
			<td>430290</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63</td>
			<td>5810759005</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62</td>
			<td>22638289</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 &#8211; 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62</td>
			<td>22638246</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil 12 in x 75&#39; Roll .0007</td>
			<td>UPC 109153</td>
			<td>Reynolds Wrap</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Induction Chamber - Mouse</td>
			<td>RWD-AICMV-100</td>
			<td>Conduct Science</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL</td>
			<td>309626</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2&#34; 100-Pack</td>
			<td>CMD 2613</td>
			<td>Brandzig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody</td>
			<td>115537</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 &#181;m, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile</td>
			<td>T9009</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Dioxide USP E CGA 940&#160;</td>
			<td>CD USPE</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL</td>
			<td>UX-34502-46</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 2</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector brass chrome plated 1/4&#34; female NPT x 1/4&#34; barb</td>
			<td>Y992611-AG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytek Aurora Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td>Cytek Biosciences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP</td>
			<td>M-08-12</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I - 40,000 U</td>
			<td>D4527</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypet&#160;3 - Electronic Pipette Controller</td>
			<td>4430000018</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Balance, AX223/E</td>
			<td>30100606</td>
			<td>Ohaus Corp.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes</td>
			<td></td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.1</td>
			<td></td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100)</td>
			<td>Z740287</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]</td>
			<td>14025076</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>H3506</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostats, Straight</td>
			<td>13018-14</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL</td>
			<td>302831</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940</td>
			<td>M1-940-PG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McKesson Underpads, Moderate</td>
			<td>4033-CS150</td>
			<td>McKesson</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navigator Multi-Purpose Portable Balance</td>
			<td>NV2201</td>
			<td>Ohaus Corp.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]</td>
			<td>10010023</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody</td>
			<td>103208</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>200 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>103132</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100 &#181;g 500 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene</td>
			<td>FB0875711YZ</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02</td>
			<td>M08-1</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator</td>
			<td>LED-6W</td>
			<td>AmScope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm)</td>
			<td>305122</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO)</td>
			<td>553141</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company Biosciences</td>
			<td>0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 4.1.1</td>
			<td></td>
			<td>The R Foundation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>9501250000</td>
			<td>Accutec Blades Inc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet</td>
			<td>Y12244A320-AG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets</td>
			<td>Rotor A-4-62</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma label tape</td>
			<td>L8394</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroFlo 3.0.0</td>
			<td></td>
			<td>Cytek Biosciences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8&#34; Hose Barb; 1/EA</td>
			<td>MTLL230-6005</td>
			<td>Spex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8&#34; ID x 3/16&#34; OD x 1/32&#34; Wall x 50&#39; Long</td>
			<td>CG-730-003</td>
			<td>Excelon Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe PP/PE without needle, 3 mL</td>
			<td>Z683566</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>55-1199 (95-240)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500</td>
			<td>9371W13</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rack, 12&#160;positions, 6 for 5.0&#160;mL and 15&#160;mL tubes and 6 for 25&#160;mL and 50&#160;mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable</td>
			<td>30119835</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rack, 12&#160;positions, for 5.0&#160;mL and 15&#160;mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable</td>
			<td>30119827</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. &#215; O.D. 1/4 in. &#215; 3/8 in.</td>
			<td>T8913 (Millipore Sigma)</td>
			<td>Tygon, Saint-Gobain</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Scientific Industries, Inc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips</td>
			<td>89259-946</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4&#189;&#34;</td>
			<td>82027-578</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I</td>
			<td>12620-946</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>423102</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry-based quantification and analysis of myocardial b-cells

גוף הולך וגדל של ראיות מראה כי לימפוציטים מסוג B ממלאים תפקיד חשוב בהקשר של פיזיולוגיה של שריר הלב והסתגלות שריר הלב לפציעה. עם זאת, הספרות מדווחת על נתונים מנוגדים על שכיחות תאי B שריר הלב. דווח כי תאי B הם גם בין תאי החיסון השכיחים ביותר בלב המכרסם או שהם נוכחים, אך בשכיחות נמוכה משמעותית מתאי מיאלואידים, או שהם נדירים למדי. באופן דומה, מספר קבוצות תיארו כי מספר תאי B שריר הלב עולה לאחר פגיעה איסכמית חריפה בשריר הלב, אך קבוצה אחת לא דיווחה על שינויים במספר תאי B של שריר הלב הפגוע. יישום שיטה משותפת הניתנת לשחזור כדי להעריך את השכיחות של תאי B שריר הלב הוא קריטי כדי ליצור הרמוניה בין תצפיות מקבוצות מחקר שונות ובכך לקדם את קידום המחקר של אינטראקציות שריר הלב של תאי B. בהתבסס על הניסיון שלנו, התצפיות המנוגדות לכאורה המדווחות בספרות נובעות ככל הנראה מהעובדה שתאי B של שריר הלב הם ברובם תוך-וסקולריים ומחוברים לאנדותל המיקרו-וסקולרי. לכן, מספר תאי B שהתאוששו מלב מורין רגיש להפליא לתנאי הזלוף המשמשים לניקוי האיבר ולשיטת העיכול המשמשת. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול אופטימלי המביא בחשבון את שני המשתנים הקריטיים הללו באופן ספציפי. פרוטוקול זה מעצים ניתוח מבוסס ציטומטריה של זרימה הניתנת לשחזור של מספר תאי B שריר הלב ומאפשר לחוקרים להבחין בין תאי B מיו-וסקולריים חוץ-וסקולריים לעומת תאי B תוך-וסקולריים.

לאחר השלמת הרכישה ואיסוף כל האירועים, יש לנתח את הנתונים על פי תרגול ציטומטריה של זרימה סטנדרטית. מוקד הניתוח ישתנה בהתאם למטרה האישית של כל ניסוי. במקרה זה, כימות של תאי B תוך-וסקולריים וחוץ-וסקולריים נרדף, והוא בא לידי ביטוי כמספר התאים למ"ג רקמה.
בעת שימוש בציטומטר ספקטרלי, ...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells at JoVE.com

Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול לכימות והתמיינות של לימפוציטים B שריר הלב בהתבסס על מיקומם בחלל התוך-וסקולרי או האנדותל באמצעות ציטומטריה של זרימה.

כימות וניתוח מבוססי ציטומטריה של זרימה של תאי B שריר הלב

A growing body of evidence shows that B-lymphocytes play an important role in the context of myocardial physiology and myocardial adaptation to injury. ...

הספרות מדווחת על נתונים מנוגדים על שכיחות תאי B שריר הלב. זה נובע ככל הנראה משונות בטכניקות הזלוף והעיכול. הפרוטוקול שלנו מעצים ניתוח מבוסס ציטומטריה של זרימה הניתנת לשחזור על תאי B שריר הלב.טכניקה זו ממקסמת את תנובת ההתאוששות של תאי B ומפחיתה את השונות בספירת הציטומטריה של הזרימה בקרב תאי B ואוכלוסיות אחרות מדגימות לב. ניתן לשנות בקלות את שיטת העיכול והבידוד הממוטבת הזו כדי ליישם פאנל נוגדנים מורחב כדי לחקור סוגים שונים של תאי חיסון בלב. הפרוטוקול יכול להיות מיושם גם על איברים אחרים, כגון ריאות או כבד, כדי לחקור תאי B הקשורים לאיברים אלה.כדי להתחיל, לשקול עכבר זכר בן 12 שבועות. העמיסו מזרק אינסולין בנפח 310 סמ"ק עם 100 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים B220. הזריקו את הנוגדן המדולל B220 בהזרקה רטרו-אורביטלית והמשיכו מיד לקצירת איברים ולזלוף.לאחר המתת חסד, להחזיק את העור של העכבר עם מלקחיים באזור epigastric. צרו פתח של שני מילימטרים בעור באמצעות מספריים והשתמשו במלקחיים כדי לקלף את העור ולחשוף את שכבת החיתולית. חותכים באפיגסטריום דרך החיתולית והצפק.מהדק את תהליך xiphoid באמצעות מלקחיים hemostatic. בצע חיתוך אנכי דרך דופן בית החזה בגובה קו האמצע בכל צד והרם את דופן החזה הקדמית כדי לחשוף את תוכן המדיה-סטינום. החזיקו את אבי העורקים היטב מאחור באמצעות מלקחיים.הציגו את מחט המזרק לתוך קצה הלב. מתמזג עם שלושה מיליליטר של HBSS בקצב של שלושה מיליליטר לדקה. חותכים את אבי העורקים ומסירים את הלב.לשטוף את הלב בצלחת פטרי עם HBSS. שקלו את הלב המבודד ושימו לב למשקל במיליגרמים. טחנו את הלב בטמפרטורת החדר לחתיכות קטנות עם להב.חתיכות הלב צריך להיות כ 1.5 מ"מ בגודל. מדוד את המסה של רקמת הלב באמצעות איזון והניח 60 מיליגרם של הלב הטחון כדי להתעכל בצינור 15 מיליליטר על קרח עם שלושה מיליליטר של HBSS. חזור על תהליך זה עבור עכבר שלא קיבל את זריקת הנוגדן B220 והנח אותו בצינור עם שלושה מיליליטר של רקמת בקרת ייחוס המסומנת HBSS.הוסיפו אנזימים לכל צינור המכיל רקמות טחונות. הוסף 0.5 מיקרוליטר למיליגרם של DNase I, 0.5 מיקרוליטר אחד למיליגרם של קולגןאז II, ו-0.2 מיקרוליטר למיליגרם של היאלורונידז. מניחים את תגובת העיכול בשייקר למשך 30 דקות במהירות של 300 סיבובים לדקה.צינורות ממוקמים בשייקר בזווית קטנה, על 25 מעלות של שיפוע. הוסף שבעה מיליליטר של HBSS לכל אחד מצינורות התגובה של 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב-250 G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר נטרול הסופר-נטנט, יש להשעות כל כדור בחמישה מיליליטר של חיץ ליזיס ACK.לדגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הוספת 10 מיליליטר של PBS לכל צינור, מערבבים ומסננים לתוך צינור 50 מיליליטר עם מסננת 40 מיקרומטר. יש לרסק את כל הפסולת שעל המסנן באמצעות בוכנה מזרק כדי להבטיח שכל החומר יעבור דרך המסנן.לאחר הוספת PBS דרך המסנן עד שהנפח מגיע ל -25 מיליליטר ללב, הוסף 25 מיליליטר נוספים של PBS לצינור רקמת בקרת הייחוס וחלק את הנפח לשני צינורות שונים. תייג את אחד הצינורות לא מוכתם והשני חי / מת. לאחר צנטריפוגה ב-250 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, יש לנטרל את הסופר-נטנט ולתלות מחדש את הצינור הלא מוכתם ב-100 מיקרוליטרים של PBS וכל אחד מהכדורים האחרים ב-100 מיקרוליטרים של תמיסת הכתם החי/מת.דגירה על קרח במשך 30 דקות בחושך. לאחר הוספת 500 מיקרוליטרים של מאגר FACS לכל דגימה, העבר אותו לצינור FACS דרך מסנן של 40 מיקרומטר. לאחר סירוב צינורות FACS ב 250 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס והשלכת supernatant, להשעות את הכדור ב 500 microliters של חיץ FACS.הוסף 50 מיקרוליטרים של תמיסת חסימת FC לכל צינור, למעט הצינורות הלא מוכתמים והחיים/מתים. מערבבים ודוגרים במשך חמש דקות. לאחר הוספת 50 מיקרוליטרים של תמיסת תערובת נוגדנים לכל צינור, למעט הצינורות הלא מוכתמים והחיות/מתות, דוגרים במשך 30 דקות בחושך, ומכסים את דלי הקרח ברדיד אלומיניום.כמו עם הכתם החי/מת, יש לשטוף שוב עם 500 מיקרוליטרים של חיץ FACS ולהשהות מחדש ב-300 עד 500 מיקרוליטרים של חיץ FACS. פתח את תוכנת בקרת המכשירים. בחלק העליון של החלון, בחר את רכישה הכרטיסייה ולחץ על חדש.במקטע הספרייה, בשדה סוג לסינון, הקלד PE, PerCP-Cy5.5, סגול מבריק 421, Alexa Fluor 700 ו- Zombie Aqua, בחירת הפלואורו-4 ולחיצה על הוסף לאחר הקלדת כל אחד מהם. לאחר מכן, לחץ על הבא כדי להמשיך לכרטיסייה קבוצות. עכשיו לחץ על הסמל עם צינור כדי להוסיף את הלב לניתוח.לחץ על קבוצת ההפניות ויוצג חלון. בעמודת התגים הפלואורסצנטיים, בחר Zombie Aqua כתג הפלואורסצנטי, ומחק את כל האחרים על ידי לחיצה על סמל אדום האשפה לצד כל אחד מהם. לאחר מכן, בסמל סוג בקרה, בחר תאים.לאחר מכן, לחץ על שמור. לחץ על הבא. לאחר מכן, לחץ על הכרטיסייה סמנים.תוצג טבלה. הקלד את סמן התא המתאים בשורה הראשונה של כל עמודה של פלואורו-4 והקש Enter. לחץ על הבא פעמיים כדי לעבור לכרטיסיה רכישה.ב- Events To Record של דגימות הניסוי, הקלד 10 מיליון, ובאותו שדה עבור שורת קבוצת הייחוס, הקלד 200, 000. לחץ על שמור ופתח. בפינה השמאלית התחתונה, לחץ על בקרת מכשירים.הגדר מתח ל- FSC 50, SSC 175, SSC-B 175. בחר את פקד הרכישה. עבור אפשרות קצב הזרימה, בחר גבוה מהתפריט הנפתח.מערבבים את צינור הלב הלא מוכתם ומניחים אותו בבטחה על יציאת הזרקת הדגימה. ודא שחץ המחוון הירוק מצביע על הדגימה הנכונה. לאחר מכן, לחץ על הקלט והמתן עד להקלטת האירועים.עשו את אותו הדבר עבור רקמת הלב המוכתמת חיה/מתה. בחר בתפריט Unmix והגדר את הפקדים. בחר/י בתיבת הסימון עבור ״פלואורסצנציה אוטומטית״ כתג פלואורסצנטי.לאחר מכן, לחץ על הבא כדי להמשיך לכרטיסייה זיהוי אוכלוסיות חיוביות/שליליות. בכרטיסייה זו תוצג התווה של אזור פיזור קדימה לעומת אזור פיזור צדדי. לחצו וגררו את נקודות המצולע כדי לבחור אזור בין 1 ל- 4 מיליון בציר אזור הפיזור הקדמי ובין 0.2 ל- 3 מיליון בציר אזור הפיזור הצדדי.בחלקה הבאה מימין, V5-A יוצג על ציר X. הזז את השערים כדי לבחור מחצית מהפסגה בקצה הימני כחיובית, ואזור בצד שמאל של העלילה כשלילי. בעלילה שכותרתה קבוצת ייחוס-לא מוכתמת, בחר אוכלוסייה בטווח דומה.עבור הלא מוכתם, אין לבחור חיובי/שלילי. לחצו על הלחצן 'ביטול ערבוב חי'. כעת רכשו את דגימות הניסוי, מערבבים את הצינור, ומניחים אותו בבטחה על ה- SIP.ודא שחץ המחוון הירוק מצביע על הדגימה הנכונה. לאחר מכן, לחץ להקליט בחלונית בקרת רכישה של תוכנת הציטומטר והמתן עד שהאירועים יתועדו. בחר את הכרטיסיה ברירת מחדל לגליון עבודה לא מעורבב.צור מתווה FCS-A לעומת SSC-A באמצעות כלי התוויית הנקודות שמעליו. בחר אירועים הגבוהים מ- 0.4 מיליון בציר FSC-A וגבוהים מ- 0.8 מיליון בציר SSC-A באמצעות כלי בחירת המצולעים. צור מגרש חדש על-ידי לחיצה כפולה על הבחירה, ובעלילה חדשה זו, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על תווית ציר Y ובחר כתם חי/מת.לחץ לחיצה ימנית על תווית ציר X ובחר Autofluorescence A.בחר את כל האירועים מתחת 10 עד החמישי על ציר חי / מת. אלה התאים החיים. לחץ פעמיים בבחירה זו.בחלקה החדשה, בחר PerCP-Cy5.5A עבור ציר X ו- SSC-A עבור ציר Y. בחר את האוכלוסיות בצד ימין של PerCP-Cy5.5A. אלה הם תאי החיסון.לחץ פעמיים על הבחירה. בהתווייה החדשה, בחר FSC-A עבור ציר X וגובה פיזור קדימה עבור ציר Y. בחר את האירועים העוקבים אחר מגמה שבה הערך FSC-A וערך SSC-A זהים.פעולה זו בוחרת תאים בודדים ומבטלת כפילויות. לחץ פעמיים על בחירה זו כדי להציג עלילה חדשה באוכלוסיית התאים הבודדים החיוביים ל-CD45. מתוך עלילת האוכלוסייה החד-תאית החיובית ל-CD45, בחר סגול מבריק 421 על ציר ה-X לעומת SSC-A על ציר ה-Y.בחר את האוכלוסייה מימין על ציר 421 סגול מבריק. זוהי אוכלוסיית תאי B. לחץ פעמיים באוכלוסייה זו כדי ליצור שתי חלקות חדשות עם אוכלוסיית תאי B.הגדר את עלילת תאי B הראשונה עם PEA על ציר X וסגול מבריק 421A על ציר Y. האוכלוסייה מימין מתאימה לתאי B הבין-וסקולריים, והאוכלוסייה משמאל מייצגת את תאי B הבין-ביתיים. בחר את שניהם.הגדר את עלילת תאי B השנייה עם Alexa Fluor 700A על ציר X ו- SSC-A על ציר Y. האוכלוסייה משמאל מתאימה לתאים השליליים של CD11b, והאירועים מימין מתאימים לתאים החיוביים ל- CD11b. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על כל מקטע ולאחר מכן לחץ על מאפייני שער.לחץ על ספירה והורה כדי להציג את מספרי האירועים והאחוזים של אוכלוסיות ההורים. תעד את מספר האירועים והאחוזים לניתוח נתונים נוסף. לאחר הסרת כפילויות בלב נאיבי שאינו נגוע, צפוי שכ-20% מהתאים החיוביים ל-CD45 יהיו תאי B חיוביים ל-CD19.מתוך תאים אלה, בממוצע, 5.5% ממוקמים בחלל interstitial. 94.5% נמצאים בחלל התוך-וסקולרי. מתוך כל אוכלוסיית תאי B שנמצאת בלב, רק כ-1.6% מתאימים לתאי B1 המבוססים על סמן פני השטח CD11b ו-98.4% האחרים מתאימים לתאי B2.כאשר מנתחים תאי B שריר הלב באמצעות ציטומטריה של זרימה, חיוני לחדור ולטחון את הלב כראוי בהתאם לפרוטוקול. סינון נכון של הלב המעוכל הוא גם חיוני כדי למקסם את ההתאוששות של תאים חיסוניים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

דגם Murine של הפעלת-CD40 בתאי B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

הבידוד, בידול, וכימות של האדם נוגדן מפריש תאים B מדם: ELISPOT בתור Readout פונקציונלי של חסינות הלחות

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Flow Cytometry מבוסס Assay עבור הניטור של פונקציות תא NK

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

איתור והעשרה של נדיר- אנטיגן ספציפי בתאי B עבור ניתוח של הפנוטיפ ותפקוד

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

וזמינותו Cytotoxicity מבוססי Cytometry זרימה להערכה של פעילות תאי NK אנושי

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Cytometry זרימה פשוטים מבוסס Assay כדי לקבוע במבחנה נוגדן התלויים שיפור של וירוס דנגה באמצעות נסיוב הבראה Zika וירוס

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

ניתוח של הטיה הנוצרות על-ידי זרימת נדידה של תאי B מאתר אזור שולי במבחנה

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...