Name: flow cytometry-based quantification and analysis of myocardial b-cells
Uploaded: 2022-08-17T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells at JoVE.com

Questo studio è stato finanziato dalle sovvenzioni NHLBI 5K08HLO145108-03 e 1R01HL160716-01 assegnate a Luigi Adamo.
Il citometro a flusso Aurora utilizzato per sviluppare questo studio è stato finanziato dal NIH Grant S10OD026859. Riconosciamo il supporto del JHU Ross Flow Cytometry Core.

Tutti gli esperimenti descritti in questo manoscritto sono stati eseguiti con l'approvazione della IACUC presso la Johns Hopkins University School of Medicine.
1. Preparativi
<ol><li>Preparare il buffer FACS, come descritto nella tabella 1.</li>
	<li>Assicurati che ci sia abbastanza CO2 per l'eutanasia degli animali.</li>
	<li>Preparare lo spazio di dissezione (posizionare il cuscinetto da banco e posizionare il nastro e gli strumenti di dissezion...

<ol>
	<li>Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+B+lymphocytes+in+cardiovascular+disease.">The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease.</a> Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).</li><li>Gowans, J. L., Knight, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+route+of+re-circulation+of+lymphocytes+in+the+rat.">The route of re-circulation of lymphocytes in the rat.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).</li><li>Kunkel, E. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+the+tissue-specific+migration+of+lymphocytes.">Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes.</a> Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+controlling+homeostatic+recirculation+and+tissue-specific+trafficking+of+lymphocytes.">Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).</li><li>Rocha-Resende, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+myocardial+B+cells+mirror+changes+in+B+cells+associated+with+different+organs.">Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs.</a> JCI Insight. 5 (16), (2020).</li><li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+B+cells+are+a+subset+of+circulating+lymphocytes+with+delayed+transit+through+the+heart.">Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart.</a> JCI Insight. 5 (3), 139377 (2020).</li><li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+subsets+of+cardiac+B+lymphocytes+improves+cardiac+function+after+acute+injury.">Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury.</a> JCI Insight. 3 (11), (2018).</li><li>Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+modulate+the+expression+of+MHC-II+on+cardiac+CCR2(-)+macrophages.">B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).</li><li>Zouggari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+trigger+monocyte+mobilization+and+impair+heart+function+after+acute+myocardial+infarction.">B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).</li><li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-10-producing+B+cells+are+enriched+in+murine+pericardial+adipose+tissues+and+ameliorate+the+outcome+of+acute+myocardial+infarction.">IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).</li><li>Heinrichs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+mobilizes+a+distinct+B-cell+subset+through+a+CXCL13-CXCR5-dependent+mechanism.">The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism.</a> Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splenic+marginal+zone+B+lymphocytes+regulate+cardiac+remodeling+after+acute+myocardial+infarction+in+mice.">Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice.</a> Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).</li><li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+dynamics+of+cardiac+immune+cell+accumulation+following+acute+myocardial+infarction.">Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).</li><li>Iwata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+against+the+second+extracellular+loop+of+beta(1)-adrenergic+receptors+induces+beta-adrenergic+receptor+desensitization+and+myocardial+hypertrophy+in+vivo.">Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo.</a> Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).</li><li>Jahns, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+a+beta+1-adrenergic+receptor-directed+autoimmune+attack+as+a+cause+of+idiopathic+dilated+cardiomyopathy.">Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).</li><li>Christ, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+against+the+beta1+adrenoceptor+from+patients+with+dilated+cardiomyopathy+prolong+action+potential+duration+and+enhance+contractility+in+isolated+cardiomyocytes.">Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).</li><li>Jane-wit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenergic+receptor+autoantibodies+mediate+dilated+cardiomyopathy+by+agonistically+inducing+cardiomyocyte+apoptosis.">Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis.</a> Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).</li><li>Ludwig, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+autoantibody-induced+pathology.">Mechanisms of autoantibody-induced pathology.</a> Frontiers in Immunology. 8, 603 (2017).</li><li>Haudek, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor+engagement+mediates+differentiation+of+cardiac+fibroblast+precursor+cells.">Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).</li><li>Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc(gamma)+receptors+IIa+on+cardiomyocytes+and+their+potential+functional+relevance+in+dilated+cardiomyopathy.">Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy.</a> Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+natural+IgM+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury.">The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+specific+self-reactive+IgM+antibody+that+initiates+intestinal+ischemia/reperfusion+injury.">Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).</li><li>Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+ADP-ATP+carrier--an+autoantigen+in+myocarditis+and+dilated+cardiomyopathy--impair+cardiac+function.">Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function.</a> Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).</li><li>Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+epitope+spreading+is+a+critical+step+for+the+switch+from+C-protein-induced+myocarditis+to+dilated+cardiomyopathy.">B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy.</a> The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).</li><li>Caforio, A. L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+state+of+knowledge+on+aetiology,+diagnosis,+management,+and+therapy+of+myocarditis:+a+position+statement+of+the+European+Society+of+Cardiology+Working+Group+on+Myocardial+and+Pericardial+Diseases.">Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases.</a> European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues.">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Horckmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericardial+adipose+tissue+regulates+granulopoiesis,+fibrosis+and+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction.</a> Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Bajpai, G., Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+macrophage+subsets+and+stromal+cells+from+human+and+mouse+myocardial+specimens.">Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60015 (2019).</li><li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes.">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li><li>Coffman, R. L., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B220:+a+B+cell-specific+member+of+th+T200+glycoprotein+family.">B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family.</a> Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).</li><li>Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+B+cell+development+in+the+fetus+and+adult.">B-1 B cell development in the fetus and adult.</a> Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).</li><li>Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+B+cells+in+cardiomyopathy+and+heart+failure.">The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure.</a> Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).</li><li>Zhao, T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rituximab+in+patients+with+acute+ST-elevation+myocardial+infarction:+an+experimental+medicine+safety+study.">Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).</li><li>Kushnir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B2+but+not+B1+cells+can+contribute+to+CD4++T-cell-mediated+clearance+of+rotavirus+in+SCID+mice.">B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice.</a> Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).</li></ol>

Un numero crescente di evidenze indica che le cellule B svolgono un ruolo importante nel contesto della fisiologia miocardica e del rimodellamento/adattamento miocardico alle lesioni 7,8,9,10,11,12,13,36. La citometria a flusso è uno strumento eccellente p...

I linfociti B sono cellule immunitarie altamente specializzate che svolgono un ruolo importante nelle risposte immunitarie adattative e innate1. Ci sono due popolazioni principali di cellule B: una popolazione più piccola di cellule B1 che sono per lo più prodotte durante la vita embrionale e una popolazione preponderante di cellule B2 che vengono prodotte nella vita adulta nel midollo osseo1. Dopo la maturazione nel midollo osseo, le cellule B migrano verso gli organi linfoidi primari e secondari. Da lì ricircolano continuamente tra gli organi linfoidi che viaggiano attraverso i vasi sanguigni e i vasi linfatici2. Le cellule B esprimono anticorpi specifici sulla loro superficie, che funzionano come recettori. Quando le cellule B incontrano un antigene che si lega al loro recettore, può essere attivato un segnale di attivazione. Le cellule B attivate migrano verso il tessuto in cui è stato trovato l'antigene o tornano al midollo osseo dove possono maturare in plasmacellule produttrici di anticorpi 3,4.
Recentemente, è stato apprezzato che il cuore ospita una considerevole popolazione di cellule B. Studi su roditori hanno dimostrato che le cellule B colonizzano il cuore precocemente durante lo sviluppo embrionale5 e che le cellule B associate al miocardio sono per lo più cellule B2 intravascolari e naïve che aderiscono all'endotelio6,7, con una piccola percentuale di cellule B17. Ci sono ancora molte aree di incertezza, ma i dati disponibili indicano che le cellule B svolgono un ruolo importante sia nel cuore naïve che nel contesto dell'adattamento miocardico alle lesioni.
Studi sul cuore murino naïve hanno dimostrato che al basale le cellule B miocardiche si trovano principalmente nello spazio intravascolare, aderenti all'endotelio (>95% delle cellule B cardiache murine sono risultate localizzate nello spazio intravascolare). Queste cellule B sono risultate avere modelli di espressione genica diversi da quelli delle cellule B circolanti isolate dal sangue periferico. L'analisi dei cuori naïve di animali carenti di cellule B e i controlli singeneici hanno rilevato che gli animali privi di cellule B avevano cuori più piccoli e una frazione di eiezione più elevata6. Tutte queste evidenze suggeriscono che le cellule B potrebbero modulare la crescita miocardica e/o la funzione miocardica e che non solo le cellule B interstiziali ma anche intravascolari potrebbero essere responsabili di tali osservazioni. È stato anche scoperto che le cellule B modulano il fenotipo dei macrofagi residenti nel miocardio8.
Diversi studi hanno dimostrato che le cellule B svolgono un ruolo importante nel contesto dell'adattamento miocardico alle lesioni 8,9,10,11,12,13. Le cellule B si accumulano transitoriamente nel cuore danneggiato, probabilmente attraverso un meccanismo CXCL13-CXCR5 dipendente11,13. Da lì, le cellule B promuovono il rimodellamento cardiaco avverso attraverso diversi meccanismi che includono il reclutamento di monociti mediati da citochine 9,12. Inoltre, le cellule B possono produrre anticorpi contro le proteine cardiache che possono promuovere l'estensione del danno cardiaco e il rimodellamento cardiaco avverso attraverso diversi meccanismi 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . Le cellule B possono anche esercitare effetti protettivi sul cuore ferito attraverso la secrezione di IL-1010.
Man mano che cresce il numero di gruppi che studiano il ruolo delle cellule B nel cuore naïve e ferito, sta diventando sempre più importante definire protocolli condivisi per quantificare e valutare correttamente le cellule B del miocardio ed evitare così incongruenze che hanno già iniziato a comparire in letteratura. Finora le cellule B sono state infatti entrambe riportate come una delle cellule immunitarie più diffuse nel cuore dei roditori7 e per essere presenti con una prevalenza marcatamente inferiore rispetto alle cellule mieloidi26,27, o per essere piuttosto rare 28. Allo stesso modo, diversi gruppi hanno descritto che il numero di cellule B miocardiche aumenta dopo danno miocardico ischemico acuto 7,9,13, ma un gruppo non ha riportato cambiamenti nel numero di cellule B del miocardio danneggiato29. Gli studi sulle cellule immunitarie cardiache raramente forniscono dettagli sulle condizioni di perfusione e non vi è consenso sulle condizioni di digestione. Poiché nel cuore dei roditori una grande percentuale di cellule B sono intravascolari e l'estrazione delle cellule immunitarie dal miocardio dipende fortemente dal metodo di digestione utilizzato, le differenze riportate in letteratura potrebbero essere il risultato di differenze nella perfusione d'organo e nella digestione dei tessuti.
Presentato qui è un metodo dettagliato per la quantificazione basata sulla citometria a flusso delle cellule B miocardiche murine che massimizza la resa del recupero delle cellule B ottimizzando le condizioni di perfusione e digestione e consente la discriminazionedelle cellule B miocardiche intravascolari rispetto a quelle extravascolari 6. Questo protocollo è un adattamento e un'ottimizzazione di altri protocolli simili che distinguono tra cellule immunitarie intravascolari e interstiziali 28,30,31.
In questo protocollo, standardizziamo la perfusione miocardica per eliminare le cellule B che galleggiano nello spazio intravascolare senza rimuovere le cellule B biologicamente rilevanti che aderiscono all'endotelio microvascolare. Inoltre, basandosi su protocolli precedenti che hanno descritto l'uso dell'iniezione endovenosa di anticorpi per distinguere le cellule immunitarie intravascolari da quelle interstiziali32, e sfruttando il fatto che le cellule B esprimono il marcatore di superficie B22033, dimostriamo come distinguere le cellule B miocardiche intravascolari da quelle extravascolari attraverso l'iniezione intravascolare di un anticorpo specifico B220 immediatamente prima del sacrificio animale e della perfusione cardiaca. Questo protocollo è rilevante per la ricerca di qualsiasi scienziato interessato a includere l'analisi delle cellule B miocardiche nel cuore naïve e ferito. L'implementazione diffusa di questo protocollo ridurrà le incongruenze tra i gruppi di ricerca, consentirà l'analisi dei cambiamenti nei pool di cellule B miocardiche intravascolari ed extravascolari e quindi rafforzerà il progresso delle scoperte nel campo dell'immunologia cardiaca.
In sintesi, il protocollo rappresenta un flusso di lavoro ottimizzato per quantificare e analizzare le cellule B del miocardio tramite citometria a flusso e allo stesso tempo distinguere tra cellule situate nello spazio extravascolare e nello spazio intravascolare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody</td>
			<td>101222</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100 &#181;g 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 &#181;m, Blue</td>
			<td>QBIAP303</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube</td>
			<td>1605-0000</td>
			<td>SealRite, USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Injection, USP</td>
			<td>114-055-101</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>0.90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>SealRite, USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11213810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11267810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free</td>
			<td>430052</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Way Stop Valve, Polycarbonate</td>
			<td>SVPT951</td>
			<td>ECT Manufacturing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td>T48402</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11208810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Way Stop Valve, Polycarbonate</td>
			<td>SVPT953</td>
			<td>ECT Manufacturing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style</td>
			<td>352054</td>
			<td>Falcon, a Corning Brand</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free</td>
			<td>430290</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63</td>
			<td>5810759005</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62</td>
			<td>22638289</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 &#8211; 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62</td>
			<td>22638246</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil 12 in x 75&#39; Roll .0007</td>
			<td>UPC 109153</td>
			<td>Reynolds Wrap</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Induction Chamber - Mouse</td>
			<td>RWD-AICMV-100</td>
			<td>Conduct Science</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL</td>
			<td>309626</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2&#34; 100-Pack</td>
			<td>CMD 2613</td>
			<td>Brandzig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody</td>
			<td>115537</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 &#181;m, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile</td>
			<td>T9009</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Dioxide USP E CGA 940&#160;</td>
			<td>CD USPE</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL</td>
			<td>UX-34502-46</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 2</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector brass chrome plated 1/4&#34; female NPT x 1/4&#34; barb</td>
			<td>Y992611-AG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytek Aurora Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td>Cytek Biosciences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP</td>
			<td>M-08-12</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I - 40,000 U</td>
			<td>D4527</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypet&#160;3 - Electronic Pipette Controller</td>
			<td>4430000018</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Balance, AX223/E</td>
			<td>30100606</td>
			<td>Ohaus Corp.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes</td>
			<td></td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.1</td>
			<td></td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100)</td>
			<td>Z740287</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]</td>
			<td>14025076</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>H3506</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostats, Straight</td>
			<td>13018-14</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL</td>
			<td>302831</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940</td>
			<td>M1-940-PG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McKesson Underpads, Moderate</td>
			<td>4033-CS150</td>
			<td>McKesson</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navigator Multi-Purpose Portable Balance</td>
			<td>NV2201</td>
			<td>Ohaus Corp.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]</td>
			<td>10010023</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody</td>
			<td>103208</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>200 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>103132</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100 &#181;g 500 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene</td>
			<td>FB0875711YZ</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02</td>
			<td>M08-1</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator</td>
			<td>LED-6W</td>
			<td>AmScope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm)</td>
			<td>305122</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO)</td>
			<td>553141</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company Biosciences</td>
			<td>0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 4.1.1</td>
			<td></td>
			<td>The R Foundation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>9501250000</td>
			<td>Accutec Blades Inc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet</td>
			<td>Y12244A320-AG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets</td>
			<td>Rotor A-4-62</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma label tape</td>
			<td>L8394</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroFlo 3.0.0</td>
			<td></td>
			<td>Cytek Biosciences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8&#34; Hose Barb; 1/EA</td>
			<td>MTLL230-6005</td>
			<td>Spex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8&#34; ID x 3/16&#34; OD x 1/32&#34; Wall x 50&#39; Long</td>
			<td>CG-730-003</td>
			<td>Excelon Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe PP/PE without needle, 3 mL</td>
			<td>Z683566</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>55-1199 (95-240)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500</td>
			<td>9371W13</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rack, 12&#160;positions, 6 for 5.0&#160;mL and 15&#160;mL tubes and 6 for 25&#160;mL and 50&#160;mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable</td>
			<td>30119835</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rack, 12&#160;positions, for 5.0&#160;mL and 15&#160;mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable</td>
			<td>30119827</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. &#215; O.D. 1/4 in. &#215; 3/8 in.</td>
			<td>T8913 (Millipore Sigma)</td>
			<td>Tygon, Saint-Gobain</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Scientific Industries, Inc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips</td>
			<td>89259-946</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4&#189;&#34;</td>
			<td>82027-578</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I</td>
			<td>12620-946</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>423102</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry-based quantification and analysis of myocardial b-cells

Un numero crescente di prove dimostra che i linfociti B svolgono un ruolo importante nel contesto della fisiologia miocardica e dell'adattamento miocardico alle lesioni. Tuttavia, la letteratura riporta dati contrastanti sulla prevalenza delle cellule B del miocardio. È stato riportato che le cellule B sono tra le cellule immunitarie più diffuse nel cuore dei roditori o per essere presenti, ma con una prevalenza marcatamente inferiore rispetto alle cellule mieloidi, o per essere piuttosto rare. Allo stesso modo, diversi gruppi hanno descritto che il numero di cellule B miocardiche aumenta dopo il danno miocardico ischemico acuto, ma un gruppo non ha riportato cambiamenti nel numero di cellule B del miocardio danneggiato. L'implementazione di un metodo condiviso e riproducibile per valutare la prevalenza delle cellule B miocardiche è fondamentale per armonizzare le osservazioni di diversi gruppi di ricerca e quindi promuovere l'avanzamento dello studio delle interazioni miocardiche a cellule B. Sulla base della nostra esperienza, le osservazioni apparentemente contrastanti riportate in letteratura derivano probabilmente dal fatto che le cellule B miocardiche murine sono per lo più intravascolari e collegate all'endotelio microvascolare. Pertanto, il numero di cellule B recuperate da un cuore murino è squisitamente sensibile alle condizioni di perfusione utilizzate per pulire l'organo e al metodo di digestione utilizzato. Qui riportiamo un protocollo ottimizzato che tiene conto di queste due variabili critiche in modo specifico. Questo protocollo consente l'analisi riproducibile basata sulla citometria a flusso del numero di cellule B miocardiche murine e consente ai ricercatori di distinguere le cellule B miocardiche extravascolari da quelle intravascolari.

Una volta completata l'acquisizione e raccolti tutti gli eventi, i dati devono essere analizzati secondo la pratica standard della citometria a flusso. Il focus dell'analisi varierà a seconda dell'obiettivo individuale di ciascun esperimento. In questo caso, è stata perseguita la quantificazione delle cellule B intravascolari ed extravascolari ed è stata espressa come numero di cellule per mg di tessuto.
Quando si utilizza un citometro spettrale, si consiglia di iniziare l'analisi con un ga...

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Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells

Qui riportiamo un protocollo per la quantificazione e la differenziazione dei linfociti B miocardici in base alla loro posizione nello spazio intravascolare o endoteliale utilizzando la citometria a flusso.

Quantificazione e analisi basate sulla citometria a flusso delle cellule B miocardiche

A growing body of evidence shows that B-lymphocytes play an important role in the context of myocardial physiology and myocardial adaptation to injury. ...

La letteratura riporta dati contrastanti sulla prevalenza delle cellule B miocardiche. Ciò deriva probabilmente dalla variabilità nelle tecniche di perfusione e digestione. Il nostro protocollo consente l'analisi riproducibile basata sulla citometria a flusso sulle cellule B del miocardio.Questa tecnica massimizza la resa di recupero delle cellule B e riduce la variabilità nella conta della citometria a flusso tra le cellule B e altre popolazioni da campioni cardiaci. Questo metodo di digestione e isolamento ottimizzato può essere facilmente modificato per implementare un pannello anticorpale esteso per studiare diversi tipi di cellule immunitarie nel cuore. Il protocollo può anche essere applicato ad altri organi, come il polmone o il fegato, per studiare le cellule B associate a tali organi.Per iniziare, pesa un topo maschio di 12 settimane. Caricare una siringa da insulina da 310 cc con 100 microlitri della soluzione anticorpale B220. Iniettare l'anticorpo B220 diluito mediante iniezione retroorbitale e procedere prontamente al prelievo di organi e alla perfusione.Dopo l'eutanasia, tenere la pelle del topo con una pinza nella zona epigastrica. Fai un'apertura di due millimetri nella pelle usando le forbici e usa la pinza per staccare la pelle per rivelare lo strato di fascia. Tagliare all'epigastrio attraverso la fascia e il peritoneo.Bloccare il processo xifoideo usando una pinza emostatica. Fare un taglio verticale attraverso la parete toracica a livello della linea medioclavicolare su ciascun lato e sollevare la parete toracica anteriore per rivelare il contenuto del mediastino. Tenere saldamente l'aorta da dietro usando una pinza.Introdurre l'ago della siringa nell'apice del cuore. Perfuso con tre millilitri di HBSS ad una velocità di tre millilitri al minuto. Tagliare l'aorta e rimuovere il cuore.Lavare il cuore nella capsula di Petri con HBSS. Pesare il cuore isolato e annotare il peso in milligrammi. Tritare il cuore a temperatura ambiente in piccoli pezzi con una lama.I pezzi di cuore dovrebbero avere una dimensione di circa 1,5 millimetri. Misurare la massa del tessuto cardiaco utilizzando una bilancia e posizionare 60 milligrammi di cuore tritato da digerire in un tubo da 15 millilitri su ghiaccio con tre millilitri di HBSS. Ripetere questo processo per un topo che non ha ricevuto l'iniezione di anticorpi B220 e posizionarlo nel tubo con tre millilitri di tessuto di controllo di riferimento marcato con HBSS.Aggiungere enzimi a ciascun tubo contenente tessuti tritati. Aggiungere 0,5 microlitri per milligrammi di DNasi I, uno 0,5 microlitri per milligrammo di collagenasi II e 0,2 microlitri per milligrammo di ialuronidasi. Posizionare la reazione di digestione nello shaker per 30 minuti a 300 rotazioni al minuto.I tubi sono posizionati nello shaker con una piccola angolazione, circa 25 gradi di inclinazione. Aggiungere sette millilitri di HBSS a ciascuna delle provette di reazione da 15 millilitri e centrifugare a 250 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver travasato il surnatante, risospendere ogni pellet in cinque millilitri di tampone di lisi ACK.Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo aver aggiunto 10 millilitri di PBS a ciascun tubo, mescolare e filtrare in un tubo da 50 millilitri con un filtro da 40 micrometri. Distruggere eventuali detriti sul filtro con uno stantuffo della siringa per assicurarsi che tutto il materiale passi attraverso il filtro.Dopo aver aggiunto PBS attraverso il filtro fino a quando il volume raggiunge 25 millilitri per cuore, aggiungere altri 25 millilitri di PBS al tubo tissutale di controllo di riferimento e dividere il volume in due tubi diversi. Etichettare uno dei tubi non macchiato e l'altro vivo / morto. Dopo aver centrifugato a 250 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius, decantare il surnatante e risospendere il tubo non colorato in 100 microlitri di PBS e ciascuno degli altri pellet in 100 microlitri della soluzione di colorazione viva / morta.Incubare sul ghiaccio per 30 minuti al buio. Dopo aver aggiunto 500 microlitri di tampone FACS a ciascun campione, trasferirlo in un tubo FACS attraverso un filtro da 40 micrometri. Dopo aver rifiutato i tubi FACS a 250 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e aver scartato il surnatante, risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone FACS.Aggiungere 50 microlitri di soluzione bloccante FC a ciascun tubo, ad eccezione dei tubi non colorati e vivi / morti. Mescolare e incubare per cinque minuti. Dopo aver aggiunto 50 microlitri di soluzione di miscela anticorpale a ciascun tubo, ad eccezione dei tubi non colorati e vivi / morti, incubare per 30 minuti al buio, coprendo il secchiello del ghiaccio con un foglio di alluminio.Come per la macchia viva / morta, lavare nuovamente con 500 microlitri di tampone FACS e risospendere in 300-500 microlitri di tampone FACS. Aprire il software di controllo dello strumento. Nella parte superiore della finestra, seleziona la scheda Acquisizione e fai clic su Nuovo.Nella sezione libreria, nel campo Tipo da filtrare, digitare PE, PerCP-Cy5.5, viola brillante 421, Alexa Fluor 700 e Zombie Aqua, selezionando il fluoro-4 e facendo clic su Aggiungi dopo aver digitato ciascuno. Quindi, fare clic su Avanti per passare alla scheda Gruppi. Ora fai clic sul simbolo con un tubo per aggiungere il cuore per l'analisi.Fare clic sul gruppo di riferimento e verrà visualizzata una finestra. Nella colonna dei tag fluorescenti, seleziona Zombie Aqua come tag fluorescente, eliminando tutti gli altri facendo clic sull'icona rossa del cestino accanto a ciascuno. Quindi, nell'icona Tipo di controllo, selezionare Celle.Quindi, fai clic su Salva. Fare clic su Avanti. Quindi, fare clic sulla scheda Marcatori.Verrà visualizzata una tabella. Digitare l'indicatore di cella corrispondente nella prima riga di ogni colonna fluoro-4 e premere Invio. Fare clic su Avanti due volte per passare alla scheda Acquisizione.In Events To Record dei campioni sperimentali, tipo 10 milioni, e nello stesso campo per la linea del gruppo di riferimento, tipo 200, 000. Fai clic su Salva e apri. In basso a sinistra, fai clic su Controllo strumento.Impostare la tensione su FSC 50, SSC 175, SSC-B 175. Selezionare il controllo acquisizione. Per l'opzione portata, selezionare Alta dal menu a discesa.Vortice il tubo cardiaco non colorato e posizionarlo saldamente sulla porta di iniezione del campione. Assicurarsi che la freccia dell'indicatore verde punti al campione corretto. Quindi, fai clic su Registra e attendi fino a quando gli eventi non vengono registrati.Fai lo stesso per il tessuto cardiaco macchiato vivo / morto. Selezionare il menu Unmix e impostare i controlli. Selezionare la casella di controllo Autofluorescenza come tag fluorescente.Quindi, fare clic su Avanti per passare alla scheda Identifica popolazioni positive/negative. In questa scheda, verrà visualizzato un grafico dell'area di dispersione in avanti rispetto all'area di dispersione laterale. Fare clic e trascinare i punti del poligono per selezionare un'area compresa tra 1 e 4 milioni sull'asse dell'area di dispersione diretta e tra 0,2 e 3 milioni sull'asse dell'area di dispersione laterale.Nel grafico successivo a destra, V5-A verrà visualizzato sull'asse X. Sposta le porte per selezionare metà del picco all'estrema destra come positivo e una regione sul lato sinistro del grafico come negativo. Nel grafico intitolato Gruppo di riferimento-Non macchiato, selezionare una popolazione in un intervallo simile.Per i non macchiati, non deve essere selezionato alcun positivo/negativo. Fate clic sul pulsante Live Unmixing (Live Unmixing). Ora acquisisci i campioni sperimentali, vortice il tubo e posizionalo saldamente sul SIP.Assicurarsi che la freccia dell'indicatore verde punti al campione corretto. Quindi, fare clic su Registra nel pannello Controllo acquisizione del software del citometro e attendere fino a quando gli eventi non vengono registrati. Selezionare la scheda Foglio di lavoro non misto predefinito.Create un grafico FCS-A rispetto a SSC-A utilizzando lo strumento di mappatura dei punti in alto. Selezionare eventi superiori a 0,4 milioni sull'asse FSC-A e superiori a 0,8 milioni sull'asse SSC-A utilizzando lo strumento di selezione dei poligoni. Create un nuovo plottaggio facendo doppio clic sulla selezione e, in questo nuovo plottaggio, fate clic con il pulsante destro del mouse sull'etichetta dell'asse Y e selezionate la macchia viva o morta.Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'etichetta dell'asse X e selezionare Autofluorescenza A.Selezionare tutti gli eventi inferiori a 10 e quinti sull'asse vivi/morti. Queste sono le cellule viventi. Fare doppio clic su questa selezione.Nel nuovo plottaggio, selezionate PerCP-Cy5.5A per l'asse X e SSC-A per l'asse Y. Selezionare le popolazioni sul lato destro del PerCP-Cy5.5A. Queste sono le cellule immunitarie.Fare doppio clic sulla selezione. Nel nuovo plottaggio, selezionate FSC-A per l'asse X e Altezza dispersione diretta per l'asse Y. Selezionare gli eventi che seguono una tendenza in cui il valore FSC-A e il valore SSC-A sono uguali.Questo seleziona singole celle ed elimina doppietti. Fare doppio clic su questa selezione per visualizzare un nuovo grafico nella popolazione monocellulare CD45-positiva. Dal grafico della popolazione monocellulare CD45-positiva, selezionare il viola brillante 421 sull'asse X rispetto a SSC-A sull'asse Y.Selezionate la popolazione a destra sull'asse 421 viola brillante. Questa è la popolazione di cellule B. Fare doppio clic due volte in questa popolazione per creare due nuovi grafici con la popolazione di cellule B.Impostare il primo grafico a celle B con PEA sull'asse X e 421A viola brillante sull'asse Y. La popolazione a destra corrisponde alle cellule B intervascolari e la popolazione a sinistra rappresenta le cellule B interstiziali. Selezionare entrambi.Configura il secondo plottaggio delle celle B con Alexa Fluor 700A sull'asse X e SSC-A sull'asse Y. La popolazione a sinistra corrisponde alle cellule CD11b-negative, e gli eventi a destra corrispondono alle cellule CD11b-positive. Fare clic con il pulsante destro del mouse su ciascuna sezione e quindi fare clic su Proprietà gate.Fare clic su Conteggio e genitore per visualizzare il numero di eventi e le percentuali delle popolazioni genitore. Registrare il numero di eventi e le percentuali per ulteriori analisi dei dati. Dopo la rimozione delle doppiette in un cuore ingenuo non ferito, si prevede che circa il 20% delle cellule CD45-positive saranno cellule B CD19-positive.Di queste cellule, in media, il 5,5% si trova nello spazio interstiziale. Il 94,5% si trova nello spazio intravascolare. Dell'intera popolazione di cellule B presenti nel cuore, solo circa l'1,6% corrisponde alle cellule B1 in base al marcatore di superficie CD11b e l'altro 98,4% corrisponde alle cellule B2.Quando si analizzano le cellule B del miocardio tramite citometria a flusso, è fondamentale perfondere e tritare correttamente il cuore seguendo il protocollo. Una corretta filtrazione del cuore digerito è anche essenziale per massimizzare il recupero delle cellule immunitarie.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Modello murino di CD40-attivazione delle cellule B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

L&#39;isolamento, la differenziazione e quantificazione di Human anticorpo-secernenti cellule B da sanguigno: ELISpot come una lettura funzionale del umorale immunità

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Citometria a flusso basato su test per il monitoraggio delle funzioni delle cellule NK

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

La valutazione della retina microglia fagocitaria Funzione<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando un test citometria a flusso basato su

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Rilevamento e l&#39;arricchimento di Rare antigene-specifiche cellule B per l&#39;analisi del fenotipo e funzione

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Un'analisi di citotossicità di base di citometria a flusso per la valutazione dell'attività delle cellule NK umane

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Base di un semplice flusso Cytometry Assay per determinare In Vitro dell'anticorpo dipendente valorizzazione del Virus di febbre rompiossa utilizzando siero convalescente Zika Virus

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Analisi di taglio indotta da flusso di migrazione delle cellule di B di zona marginale murino In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Quantificazione di basata su citometria a flusso multicolor dei mitocondri e lisosomi in cellule di T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Preparazione del midollo osseo intero per l'analisi della citometria di massa delle cellule di lignaggio neutrofilo

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...