Name: flow cytometry-based quantification and analysis of myocardial b-cells
Uploaded: 2022-08-17T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells at JoVE.com

이 연구는 Luigi Adamo에게 수여 된 NHLBI 보조금 5K08HLO145108-03 및 1R01HL160716-01의 지원을 받았습니다.
이 연구를 개발하는 데 사용 된 오로라 유세포 분석기는 NIH Grant S10OD026859의 자금 지원을 받았습니다. 우리는 JHU Ross Flow Cytometry Core의 지원을 인정합니다.

이 원고에 설명 된 모든 실험은 존스 홉킨스 의과 대학의 IACUC의 승인을 받아 수행되었습니다.
1. 준비
<ol><li>표 1에 설명된 대로 FACS 버퍼를 준비합니다.</li>
	<li>동물을 안락사시키기에 충분한CO2 가 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>해부 공간을 준비하십시오 (벤치 패드를 놓고 테이프와 해부 도구를 근처에 두십시오).</li>
	<li>15mL 튜브에 라벨을 ...

<ol>
	<li>Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+B+lymphocytes+in+cardiovascular+disease.">The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease.</a> Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).</li><li>Gowans, J. L., Knight, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+route+of+re-circulation+of+lymphocytes+in+the+rat.">The route of re-circulation of lymphocytes in the rat.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).</li><li>Kunkel, E. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+the+tissue-specific+migration+of+lymphocytes.">Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes.</a> Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+controlling+homeostatic+recirculation+and+tissue-specific+trafficking+of+lymphocytes.">Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).</li><li>Rocha-Resende, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+myocardial+B+cells+mirror+changes+in+B+cells+associated+with+different+organs.">Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs.</a> JCI Insight. 5 (16), (2020).</li><li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+B+cells+are+a+subset+of+circulating+lymphocytes+with+delayed+transit+through+the+heart.">Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart.</a> JCI Insight. 5 (3), 139377 (2020).</li><li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+subsets+of+cardiac+B+lymphocytes+improves+cardiac+function+after+acute+injury.">Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury.</a> JCI Insight. 3 (11), (2018).</li><li>Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+modulate+the+expression+of+MHC-II+on+cardiac+CCR2(-)+macrophages.">B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).</li><li>Zouggari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+trigger+monocyte+mobilization+and+impair+heart+function+after+acute+myocardial+infarction.">B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).</li><li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-10-producing+B+cells+are+enriched+in+murine+pericardial+adipose+tissues+and+ameliorate+the+outcome+of+acute+myocardial+infarction.">IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).</li><li>Heinrichs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+mobilizes+a+distinct+B-cell+subset+through+a+CXCL13-CXCR5-dependent+mechanism.">The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism.</a> Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splenic+marginal+zone+B+lymphocytes+regulate+cardiac+remodeling+after+acute+myocardial+infarction+in+mice.">Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice.</a> Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).</li><li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+dynamics+of+cardiac+immune+cell+accumulation+following+acute+myocardial+infarction.">Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).</li><li>Iwata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+against+the+second+extracellular+loop+of+beta(1)-adrenergic+receptors+induces+beta-adrenergic+receptor+desensitization+and+myocardial+hypertrophy+in+vivo.">Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo.</a> Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).</li><li>Jahns, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+a+beta+1-adrenergic+receptor-directed+autoimmune+attack+as+a+cause+of+idiopathic+dilated+cardiomyopathy.">Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).</li><li>Christ, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+against+the+beta1+adrenoceptor+from+patients+with+dilated+cardiomyopathy+prolong+action+potential+duration+and+enhance+contractility+in+isolated+cardiomyocytes.">Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).</li><li>Jane-wit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenergic+receptor+autoantibodies+mediate+dilated+cardiomyopathy+by+agonistically+inducing+cardiomyocyte+apoptosis.">Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis.</a> Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).</li><li>Ludwig, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+autoantibody-induced+pathology.">Mechanisms of autoantibody-induced pathology.</a> Frontiers in Immunology. 8, 603 (2017).</li><li>Haudek, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor+engagement+mediates+differentiation+of+cardiac+fibroblast+precursor+cells.">Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).</li><li>Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc(gamma)+receptors+IIa+on+cardiomyocytes+and+their+potential+functional+relevance+in+dilated+cardiomyopathy.">Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy.</a> Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+natural+IgM+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury.">The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+specific+self-reactive+IgM+antibody+that+initiates+intestinal+ischemia/reperfusion+injury.">Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).</li><li>Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+ADP-ATP+carrier--an+autoantigen+in+myocarditis+and+dilated+cardiomyopathy--impair+cardiac+function.">Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function.</a> Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).</li><li>Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+epitope+spreading+is+a+critical+step+for+the+switch+from+C-protein-induced+myocarditis+to+dilated+cardiomyopathy.">B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy.</a> The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).</li><li>Caforio, A. L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+state+of+knowledge+on+aetiology,+diagnosis,+management,+and+therapy+of+myocarditis:+a+position+statement+of+the+European+Society+of+Cardiology+Working+Group+on+Myocardial+and+Pericardial+Diseases.">Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases.</a> European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues.">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Horckmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericardial+adipose+tissue+regulates+granulopoiesis,+fibrosis+and+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction.</a> Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Bajpai, G., Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+macrophage+subsets+and+stromal+cells+from+human+and+mouse+myocardial+specimens.">Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60015 (2019).</li><li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes.">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li><li>Coffman, R. L., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B220:+a+B+cell-specific+member+of+th+T200+glycoprotein+family.">B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family.</a> Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).</li><li>Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+B+cell+development+in+the+fetus+and+adult.">B-1 B cell development in the fetus and adult.</a> Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).</li><li>Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+B+cells+in+cardiomyopathy+and+heart+failure.">The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure.</a> Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).</li><li>Zhao, T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rituximab+in+patients+with+acute+ST-elevation+myocardial+infarction:+an+experimental+medicine+safety+study.">Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).</li><li>Kushnir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B2+but+not+B1+cells+can+contribute+to+CD4++T-cell-mediated+clearance+of+rotavirus+in+SCID+mice.">B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice.</a> Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).</li></ol>

점점 더 많은 증거에 따르면 B 세포는 심근 생리학 및 심근 리모델링 / 부상에 대한 적응 7,8,9,10,11,12,13,36의 맥락에서 중요한 역할을합니다. 유세포 분석은 모든 조직의 면역 세포 집단을 연구하는...

B-림프구는 적응면역 반응과 선천성 면역 반응 모두에서 중요한 역할을 하는 고도로 전문화된 면역 세포입니다1. B 세포의 두 가지 주요 집단이 있습니다 : 배아 생활 동안 주로 생성되는 B1 세포의 작은 집단과 골수1에서 성인 생활에서 생성되는 B2 세포의 우세한 집단. 골수에서 성숙 한 후 B 세포는 1 차 및 2 차 림프 기관으로 이동합니다. 거기에서 그들은 혈관과 림프관을 통해 이동하는 림프 기관 사이에서 지속적으로 재순환합니다2. B 세포는 수용체로 기능하는 표면에 특정 항체를 발현합니다. B 세포가 수용체에 결합하는 항원을 만나면 활성화 신호가 트리거 될 수 있습니다. 활성화된 B 세포는 항원이 발견된 조직으로 이동하거나 골수로 돌아가 항체 생성 형질 세포로 성숙할 수 있습니다 3,4.
최근에, 심장에는 상당한 수의 B 세포 집단이 있다는 것이 인식되고 있다. 설치류를 대상으로 한 연구에 따르면 B 세포는 배아 발달 초기에 심장에 식민지화되며5, 심근 관련 B 세포는 대부분 혈관 내 순진한 B2 세포이며 내피 6,7에 부착되어 있으며 B1세포는 적은 비율입니다7. 여전히 많은 불확실성이 있지만 사용 가능한 데이터는 B 세포가 순진한 심장과 부상에 대한 심근 적응의 맥락에서 중요한 역할을한다는 것을 나타냅니다.
순진한 쥐 심장에 대한 연구에 따르면 기준선에서 심근 B 세포는 대부분 혈관 내 공간에 위치하며 내피에 부착되어 있습니다 (> 쥐 심장 B 세포의 95 %가 혈관 내 공간에 위치하는 것으로 밝혀졌습니다). 이들 B 세포는 말초 혈액으로부터 분리된 순환 B 세포와 상이한 유전자 발현 패턴을 갖는 것으로 밝혀졌다. B 세포가 결핍 된 동물과 동종 대조군의 순진한 심장을 분석 한 결과, B 세포가없는 동물은 심장이 더 작고 분출률이 더 높은 것으로 나타났습니다6. 이 모든 증거는 B 세포가 심근 성장 및 / 또는 심근 기능을 조절할 수 있으며 간질뿐만 아니라 혈관 내 B 세포도 그러한 관찰을 담당 할 수 있음을 시사합니다. B 세포는 또한 심근 상주 대식세포의 표현형을 조절하는 것으로 밝혀졌습니다8.
여러 연구에 따르면 B 세포는 손상에 대한 심근 적응의 맥락에서 중요한 역할을합니다 8,9,10,11,12,13. B 세포는 CXCL13-CXCR5 의존성 메커니즘11,13을 통해 손상된 심장에 일시적으로 축적됩니다. 거기에서 B 세포는 사이토 카인 매개 단핵구 모집 9,12를 포함하는 여러 메커니즘을 통해 불리한 심장 리모델링을 촉진합니다. 또한, B- 세포는 여러 메커니즘을 통해 심장 손상 및 불리한 심장 리모델링의 확장을 촉진 할 수있는 심장 단백질에 대한 항체를 생산할 수 있습니다 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B 세포는 또한 IL-1010의 분비를 통해 손상된 심장에 보호 효과를 발휘할 수 있습니다.
순진하고 손상된 심장에서 B 세포의 역할을 조사하는 그룹의 수가 증가함에 따라 심근 B 세포를 적절하게 정량화하고 평가하여 이미 문헌에 나타나기 시작한 불일치를 피하기 위해 공유 프로토콜을 정의하는 것이 점점 더 중요 해지고 있습니다. 지금까지 B 세포는 실제로 설치류 심장에서 가장 널리 퍼진 면역 세포중 하나이며7 골수 세포26,27보다 현저히 낮은 유병률로 존재하거나 매우 드문 것으로 보고되었습니다28. 유사하게, 몇몇 그룹은 급성 허혈성 심근 손상후에 심근 B 세포의 수가 증가한다고 설명했지만, 한 그룹은 손상된 심근29의 B 세포 수에 변화가 없다고보고했다. 심장 면역 세포에 대한 연구는 관류 상태에 대한 세부 정보를 거의 제공하지 않으며 소화 조건에 대한 합의가 없습니다. 설치류 심장에서 B 세포의 상당 부분이 혈관 내이고 심근에서 면역 세포를 추출하는 것은 사용 된 소화 방법에 크게 의존하기 때문에 문헌에보고 된 차이는 장기 관류 및 조직 소화의 차이의 결과 일 수 있습니다.
여기에 제시된 것은 관류 및 소화 조건을 최적화하여 B 세포 회수의 수율을 최대화하고 혈관 내 대 혈관 외 심근 B 세포의 구별을 허용하는 쥐 심근 B 세포의 유세포 분석 기반 정량화에 대한 자세한 방법입니다6. 이 프로토콜은 혈관내 및 간질 면역 세포 28,30,31을 구별하는 다른 유사한 프로토콜의 적응 및 최적화이다.
이 프로토콜에서 우리는 심근 관류를 표준화하여 미세 혈관 내피에 부착 된 생물학적으로 관련된 B 세포를 제거하지 않고 혈관 내 공간에 떠 다니는 B 세포를 제거합니다. 더욱이, 혈관내 면역 세포(32)와 간질 면역 세포(32)를 구별하기 위해 항체의 정맥내 주사의 사용을 기술한 이전 프로토콜을 구축하고, B-세포가 표면 마커 B220(33)을 발현한다는 사실을 이용하여, 동물 희생 및 심장 관류 직전에 B220-특이적 항체의 혈관내 주사를 통해 혈관내 대 혈관외 심근 B 세포를 구별하는 방법을 입증한다. 이 프로토콜은 순진하고 손상된 심장의 심근 B 세포 분석을 포함하는 데 관심이있는 모든 과학자의 연구와 관련이 있습니다. 이 프로토콜의 광범위한 구현은 연구 그룹 간의 불일치를 줄이고 혈관 내 및 혈관 외 심근 B 세포 풀의 변화를 분석 할 수있게하여 심장 면역학 분야의 발견을 강화할 것입니다.
요약하면, 이 프로토콜은 유세포분석을 통해 심근 B 세포를 정량화 및 분석하는 동시에 혈관외 공간과 혈관내 공간에 위치한 세포를 구별하는 최적화된 워크플로우를 나타냅니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody</td>
			<td>101222</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100 &#181;g 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 &#181;m, Blue</td>
			<td>QBIAP303</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube</td>
			<td>1605-0000</td>
			<td>SealRite, USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Injection, USP</td>
			<td>114-055-101</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>0.90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>SealRite, USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11213810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11267810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free</td>
			<td>430052</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Way Stop Valve, Polycarbonate</td>
			<td>SVPT951</td>
			<td>ECT Manufacturing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td>T48402</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11208810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Way Stop Valve, Polycarbonate</td>
			<td>SVPT953</td>
			<td>ECT Manufacturing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style</td>
			<td>352054</td>
			<td>Falcon, a Corning Brand</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free</td>
			<td>430290</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63</td>
			<td>5810759005</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62</td>
			<td>22638289</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 &#8211; 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62</td>
			<td>22638246</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil 12 in x 75&#39; Roll .0007</td>
			<td>UPC 109153</td>
			<td>Reynolds Wrap</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Induction Chamber - Mouse</td>
			<td>RWD-AICMV-100</td>
			<td>Conduct Science</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL</td>
			<td>309626</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2&#34; 100-Pack</td>
			<td>CMD 2613</td>
			<td>Brandzig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody</td>
			<td>115537</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 &#181;m, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile</td>
			<td>T9009</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Dioxide USP E CGA 940&#160;</td>
			<td>CD USPE</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL</td>
			<td>UX-34502-46</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 2</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector brass chrome plated 1/4&#34; female NPT x 1/4&#34; barb</td>
			<td>Y992611-AG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytek Aurora Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td>Cytek Biosciences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP</td>
			<td>M-08-12</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I - 40,000 U</td>
			<td>D4527</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypet&#160;3 - Electronic Pipette Controller</td>
			<td>4430000018</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Balance, AX223/E</td>
			<td>30100606</td>
			<td>Ohaus Corp.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes</td>
			<td></td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.1</td>
			<td></td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100)</td>
			<td>Z740287</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]</td>
			<td>14025076</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>H3506</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostats, Straight</td>
			<td>13018-14</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL</td>
			<td>302831</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940</td>
			<td>M1-940-PG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McKesson Underpads, Moderate</td>
			<td>4033-CS150</td>
			<td>McKesson</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navigator Multi-Purpose Portable Balance</td>
			<td>NV2201</td>
			<td>Ohaus Corp.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]</td>
			<td>10010023</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody</td>
			<td>103208</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>200 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>103132</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100 &#181;g 500 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene</td>
			<td>FB0875711YZ</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02</td>
			<td>M08-1</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator</td>
			<td>LED-6W</td>
			<td>AmScope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm)</td>
			<td>305122</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO)</td>
			<td>553141</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company Biosciences</td>
			<td>0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 4.1.1</td>
			<td></td>
			<td>The R Foundation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>9501250000</td>
			<td>Accutec Blades Inc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet</td>
			<td>Y12244A320-AG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets</td>
			<td>Rotor A-4-62</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma label tape</td>
			<td>L8394</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroFlo 3.0.0</td>
			<td></td>
			<td>Cytek Biosciences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8&#34; Hose Barb; 1/EA</td>
			<td>MTLL230-6005</td>
			<td>Spex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8&#34; ID x 3/16&#34; OD x 1/32&#34; Wall x 50&#39; Long</td>
			<td>CG-730-003</td>
			<td>Excelon Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe PP/PE without needle, 3 mL</td>
			<td>Z683566</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>55-1199 (95-240)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500</td>
			<td>9371W13</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rack, 12&#160;positions, 6 for 5.0&#160;mL and 15&#160;mL tubes and 6 for 25&#160;mL and 50&#160;mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable</td>
			<td>30119835</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rack, 12&#160;positions, for 5.0&#160;mL and 15&#160;mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable</td>
			<td>30119827</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. &#215; O.D. 1/4 in. &#215; 3/8 in.</td>
			<td>T8913 (Millipore Sigma)</td>
			<td>Tygon, Saint-Gobain</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Scientific Industries, Inc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips</td>
			<td>89259-946</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4&#189;&#34;</td>
			<td>82027-578</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I</td>
			<td>12620-946</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>423102</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry-based quantification and analysis of myocardial b-cells

점점 더 많은 증거에 따르면 B- 림프구는 심근 생리학 및 심근 적응의 맥락에서 중요한 역할을합니다. 그러나 문헌은 심근 B 세포의 유병률에 대한 대조적 인 데이터를보고합니다. B 세포는 설치류 심장에서 가장 널리 퍼진 면역 세포 중 하나이거나 존재하는 것으로 보고되었지만 골수 세포보다 유병률이 현저히 낮거나 매우 드문 것으로 보고되었습니다. 유사하게, 몇몇 그룹은 급성 허혈성 심근 손상 후 심근 B 세포의 수가 증가한다고 설명했지만, 한 그룹은 손상된 심근의 B 세포 수에 변화가 없다고보고했다. 심근 B 세포의 유병률을 평가하기 위한 공유되고 재현 가능한 방법의 구현은 다양한 연구 그룹의 관찰을 조화시켜 B 세포 심근 상호 작용 연구의 발전을 촉진하는 데 중요합니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 문헌에보고 된 겉보기에 대조적 인 관찰은 쥐의 심근 B 세포가 대부분 혈관 내피에 연결되어 있고 미세 혈관 내피에 연결되어 있다는 사실에서 비롯된 것 같습니다. 따라서 쥐의 심장에서 회수 된 B 세포의 수는 장기를 청소하는 데 사용되는 관류 조건과 사용 된 소화 방법에 절묘하게 민감합니다. 여기에서는 이 두 가지 중요한 변수를 특정 방식으로 설명하는 최적화된 프로토콜을 보고합니다. 이 프로토콜은 쥐 심근 B 세포 수에 대한 재현 가능한 유세포 분석 기반 분석을 강화하고 연구원이 혈관 외 심근 B 세포와 혈관 내 심근 B 세포를 구별 할 수 있도록합니다.

수집이 완료되고 모든 이벤트가 수집되면 표준 유세포분석 관행에 따라 데이터를 분석해야 합니다. 분석의 초점은 각 실험의 개별 목표에 따라 다릅니다. 이 경우 혈관내 및 혈관외 B세포의 정량화를 추구하였으며, 조직 mg당 세포수로 표시하였다.
스펙트럼 세포분석기를 사용하는 경우 초기 게이팅으로 분석을 시작하여 면역 세포에 해당하는 범위에 있지 않은 크기의 파편을...

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Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells

여기서 우리는 유세포 분석을 사용하여 혈관 내 또는 내피 공간에서의 위치를 기반으로 심근 B- 림프구의 정량화 및 분화를위한 프로토콜을보고합니다.

유세포분석 기반 심근 B 세포의 정량화 및 분석

A growing body of evidence shows that B-lymphocytes play an important role in the context of myocardial physiology and myocardial adaptation to injury. ...

문헌은 심근 B 세포의 유병률에 대한 대조적인 데이터를 보고합니다. 이것은 관류 및 소화 기술의 다양성에서 비롯된 것 같습니다. 당사의 프로토콜은 심근 B 세포에 대한 재현 가능한 유세포 분석 기반 분석을 지원합니다.이 기술은 B 세포의 회수 수율을 극대화하고 B 세포 및 심장 샘플의 다른 집단 간의 유세포 분석 수의 변동성을 줄입니다. 이 최적화된 분해 및 분리 방법은 심장의 다양한 면역 세포 유형을 연구하기 위해 확장된 항체 패널을 구현하도록 쉽게 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 폐 또는 간과 같은 다른 기관에도 적용하여 해당 기관과 관련된 B 세포를 연구 할 수 있습니다.시작하려면 12 주 된 수컷 마우스의 무게를 측정하십시오. 310cc 인슐린 주사기에 100마이크로리터의 B220 항체 용액을 로드합니다. 희석된 B220 항체를 역궤도 주입으로 주입하고 즉시 장기 적출 및 관류를 진행합니다.안락사 후, 상복부 부위에서 집게로 마우스의 피부를 잡으십시오. 가위를 사용하여 피부에 2mm 구멍을 만들고 집게를 사용하여 피부를 벗겨 근막 층을 드러냅니다. 근막과 복막을 통해 상복부를 자릅니다.지혈 집게를 사용하여 검상돌기를 고정하십시오. 양쪽의 쇄골 중간 선 수준에서 흉벽을 수직으로 자르고 전방 흉벽을 들어 올려 종격동 내용물을 드러냅니다. 집게를 사용하여 대동맥을 뒤에서 단단히 잡으십시오.주사기 바늘을 심장의 정점에 삽입하십시오. 분당 3 밀리리터의 속도로 3 밀리리터의 HBSS로 관류됩니다. 대동맥을 자르고 심장을 제거하십시오.HBSS로 페트리 접시에 담긴 심장을 씻으십시오. 고립 된 심장의 무게를 측정하고 밀리그램 단위의 무게를 기록하십시오. 실온에서 심장을 칼날로 작은 조각으로 만듭니다.심장 조각의 크기는 약 1.5 밀리미터 여야합니다. 저울을 사용하여 심장 조직의 질량을 측정하고 다진 심장 60mg을 HBSS 3ml와 함께 얼음 위의 15 밀리리터 튜브에 넣습니다. B220 항체 주사를 받지 않은 마우스에 대해 이 과정을 반복하고 HBSS 표지된 기준 대조 조직 3밀리리터와 함께 튜브에 넣습니다.다진 조직이 들어있는 각 튜브에 효소를 첨가하십시오. DNase I 밀리그램 당 0.5 마이크로 리터, 콜라게나제 II 밀리그램 당 0.5 마이크로 리터 및 히알루로니다 제 밀리그램 당 0.2 마이크로 리터를 첨가하십시오. 소화 반응을 분당 300 회전으로 30 분 동안 셰이커에 놓습니다.튜브는 약 25도 경사의 작은 각도로 셰이커에 배치됩니다. 15밀리리터 반응 튜브 각각에 HBSS 7밀리리터를 넣고 섭씨 4도에서 5분 동안 250G로 원심분리합니다. 상청액을 디캔팅한 후 각 펠릿을 5밀리리터의 ACK 용해 완충액에 재현탁합니다.실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 각 튜브에 10 밀리리터의 PBS를 첨가 한 후 40 마이크로 미터 스트레이너가있는 50 밀리리터 튜브에 혼합하고 여과합니다. 주사기 플런저로 필터의 파편을 부수어 모든 재료가 필터를 통과하도록 합니다.부피가 심장당 25밀리리터에 도달할 때까지 필터를 통해 PBS를 추가한 후 기준 대조 조직 튜브에 25밀리리터의 PBS를 추가하고 부피를 두 개의 다른 튜브로 나눕니다. 튜브 중 하나는 얼룩이 없고 다른 하나는 살아/죽은 것으로 표시합니다. 섭씨 4도에서 5분 동안 250G에서 원심분리한 후, 상청액을 디캔트하고 염색되지 않은 튜브를 100마이크로리터의 PBS에 재현탁하고 각각의 다른 펠릿을 100마이크로리터의 살아있는/죽은 염색 용액에 재현탁합니다.어둠 속에서 30 분 동안 얼음 위에서 배양하십시오. 각 샘플에 500 마이크로 리터의 FACS 버퍼를 추가 한 후 40 마이크로 미터 필터를 통해 FACS 튜브로 옮깁니다. 섭씨 4도에서 5분 동안 250G에서 FACS 튜브를 거부하고 상청액을 버린 후, 펠렛을 500 마이크로리터의 FACS 완충액에 재현탁시켰다.염색되지 않은 튜브와 살아있는/죽은 튜브를 제외한 각 튜브에 50마이크로리터의 FC 차단 용액을 추가합니다. 5 분 동안 혼합하고 배양하십시오. 염색되지 않은 살아있는 / 죽은 튜브를 제외하고 각 튜브에 50 마이크로 리터의 항체 혼합 용액을 추가 한 후 얼음 통을 알루미늄 호일로 덮고 어둠 속에서 30 분 동안 배양합니다.살아있는 / 죽은 얼룩과 마찬가지로 500 마이크로 리터의 FACS 완충액으로 다시 세척하고 300 내지 500 마이크로 리터의 FACS 완충액에 재현탁하십시오. 계측기 제어 소프트웨어를 엽니다. 창 상단에서 획득 탭을 선택하고 새로 만들기를 클릭합니다.라이브러리 섹션의 필터링할 유형 필드에 PE, PerCP-Cy5.5, 브릴리언트 바이올렛 421, Alexa Fluor 700 및 좀비 아쿠아를 입력하고 플루오로-4를 선택하고 각각을 입력한 후 추가를 클릭합니다. 그런 다음 다음을 클릭하여 그룹 탭으로 이동합니다. 이제 튜브가있는 기호를 클릭하여 분석을위한 하트를 추가하십시오.참조 그룹을 클릭하면 창이 표시됩니다. 형광 태그 열에서 형광 태그로 Zombie Aqua를 선택하고 각 태그 옆에 있는 빨간색 휴지통 아이콘을 클릭하여 다른 태그를 삭제합니다. 그런 다음 컨트롤 형식 아이콘에서 셀을 선택합니다.그런 다음 저장을 클릭합니다. 다음을 클릭합니다. 그런 다음 마커 탭을 클릭합니다.테이블이 표시됩니다. 각 fluoro-4 열의 첫 번째 행에 해당 셀 마커를 입력하고 Enter 키를 누릅니다. 다음을 두 번 클릭하여 획득 탭으로 이동합니다.실험 샘플의 기록할 이벤트에 1,000만 개를 입력하고 참조 그룹 줄에 대해 동일한 필드에 200, 000을 입력합니다. 저장 후 열기를 클릭합니다. 왼쪽 하단에서 악기 제어를 클릭합니다.전압을 FSC 50, SSC 175, SSC-B 175로 설정합니다. 획득 컨트롤을 선택합니다. 유량 옵션의 경우 드롭다운 메뉴에서 높음을 선택합니다.염색되지 않은 심장 튜브를 소용돌이 치고 샘플 주입 포트에 단단히 놓습니다. 녹색 표시기 화살표가 올바른 샘플을 가리키고 있는지 확인하십시오. 그런 다음 녹화를 클릭하고 이벤트가 녹화될 때까지 기다립니다.살아 있거나 죽은 염색 된 심장 조직에 대해서도 똑같이하십시오. Unmix 메뉴를 선택하고 컨트롤을 설정합니다. 형광 태그로 자동 형광 확인란을 선택합니다.그런 다음 다음을 클릭하여 양성/음수 모집단 식별 탭으로 이동합니다. 이 탭에는 전방 산란 영역 대 측면 산란 영역의 플롯이 표시됩니다. 다각형의 점을 클릭하고 드래그하여 전방 산란 영역 축에서 1-4백만 사이의 영역과 측면 산란 영역 축에서 0.2-3백만 사이의 영역을 선택합니다.오른쪽의 다음 플롯에서 V5-A가 X 축에 표시됩니다. 게이트를 이동하여 맨 오른쪽에 있는 피크의 절반을 양수로 선택하고 플롯의 왼쪽에 있는 영역을 음수로 선택합니다. 참조 그룹-염색되지 않음이라는 제목의 플롯에서 유사한 범위의 모집단을 선택합니다.염색되지 않은 경우 양성/음수를 선택해야 합니다. 라이브 믹싱 해제 버튼을 클릭합니다. 이제 실험 샘플을 획득하고 튜브를 와류시킨 다음 SIP에 단단히 놓습니다.녹색 표시기 화살표가 올바른 샘플을 가리키고 있는지 확인하십시오. 그런 다음 세포분석기 소프트웨어의 획득 제어판에서 기록을 클릭하고 이벤트가 기록될 때까지 기다립니다. 혼합되지 않은 기본 워크시트 탭을 선택합니다.맨 위에 있는 점도표 도구를 사용하여 FCS-A 대 SSC-A 플롯을 생성합니다. 다각형 선택 도구를 사용하여 FSC-A 축에서 40만 개 이상, SSC-A 축에서 80만 개 이상의 이벤트를 선택합니다. 선택 영역을 두 번 클릭하여 새 플롯을 만들고 이 새 플롯에서 Y축 레이블을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 라이브/데드 스테인을 선택합니다.X축 레이블을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 자가형광 A.살아있는/죽은 축에서 10에서 다섯 번째 사이의 모든 이벤트를 선택합니다. 이들은 살아있는 세포입니다. 이 선택 항목을 두 번 클릭합니다.새 플롯에서 X축에 대해 PerCP-Cy5.5A를 선택하고 Y축에 대해 SSC-A를 선택합니다. PerCP-Cy5.5A의 오른쪽에 있는 모집단을 선택합니다. 이들은 면역 세포입니다.선택 항목을 두 번 클릭합니다. 새 플롯에서 X축에 대해 FSC-A를 선택하고 Y축에 대해 전방 산란 높이를 선택합니다. FSC-A 값과 SSC-A 값이 동일한 추세를 따르는 이벤트를 선택합니다.이것은 단일 셀을 선택하고 이중선을 제거합니다. 이 선택 항목을 두 번 클릭하면 CD45 양성 단일 세포 집단에 새 그림이 표시됩니다. CD45 양성 단일 세포 모집단 플롯에서 X축의 브릴리언트 바이올렛 421과 Y축의 SSC-A를 선택합니다.화려한 보라색 421 축에서 오른쪽의 인구를 선택합니다. 이것은 B 세포 집단입니다. 이 모집단을 두 번 두 번 클릭하여 B 셀 모집단이 있는 두 개의 새 플롯을 생성합니다.X축에 PEA가 있고 Y축에 화려한 보라색 421A가 있는 첫 번째 B 셀 플롯을 설정합니다. 오른쪽의 집단은 혈관 간 B 세포에 해당하고 왼쪽의 집단은 간질 B 세포를 나타냅니다. 둘 다 선택합니다.X축에 Alexa Fluor 700A가 있고 Y축에 SSC-A가 있는 두 번째 B 셀 플롯을 설정합니다. 왼쪽의 집단은 CD11b 음성 세포에 해당하고 오른쪽의 이벤트는 CD11b 양성 세포에 해당합니다. 각 섹션을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 게이트 속성을 클릭합니다.Count 및 Parent를 클릭하여 사건 수와 부모 모집단의 백분율을 표시합니다. 추가 데이터 분석을 위해 이벤트 수와 백분율을 기록합니다. 순진한 손상되지 않은 심장에서 이중선을 제거한 후 CD45 양성 세포의 약 20%가 CD19 양성 B 세포가 될 것으로 예상됩니다.이 세포 중 평균 5.5 %틈새 공간에 있습니다. 94.5%혈관 내 공간에 있습니다. 심장에서 발견되는 전체 B 세포 집단에서 약 1.6 %표면 마커 CD11b를 기반으로 한 B1 세포에 해당하고 나머지 98.4 %는 B2 세포에 해당합니다.유세포 분석을 통해 심근 B 세포를 분석 할 때 프로토콜에 따라 심장을 적절하게 관류하고 다지는 것이 중요합니다. 소화 된 심장의 적절한 여과는 면역 세포의 회복을 극대화하는 데 필수적입니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

B 세포의 CD40 - 정품 인증 Murine 모델

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

연구

면역학 및 감염병학

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

분리는 차별화 및 정량화 인간의 혈액에서 B 세포를 항체가 분비 : ELISPOT을 체액 면역의 기능 판독으로

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

흐름 NK 세포의 기능을 모니터링 분석을 기반 세포 계측법

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가<em&gt; 생체</em&gt;은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

표현형 및 기능 분석에 대한 검색 및 희귀의 농축 항원 특이 적 B 세포

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

인간 NK 세포 활동의 평가 대 한 흐름 Cytometry 기반 세포 독성 분석 실험

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

간단한 Cytometry 결정 체 외에서 항 체 의존의 향상 뎅기열 바이러스 Zika 바이러스 미리 혈 청을 사용 하 여 분석 결과 기반으로

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

분석 Murine 가장자리 지역 B 세포 생체 외에서의 전단 흐름 유도 마이그레이션

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

호중구 계보 세포의 질량 세포 분석 분석을위한 전체 골수의 준비

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...