Name: flow cytometry-based quantification and analysis of myocardial b-cells
Uploaded: 2022-08-17T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells at JoVE.com

Denne studien ble finansiert av NHLBI-tilskudd 5K08HLO145108-03 og 1R01HL160716-01 tildelt Luigi Adamo.
Aurora Flow Cytometer som ble brukt til å utvikle denne studien ble finansiert av NIH Grant S10OD026859. Vi anerkjenner støtten fra JHU Ross Flow Cytometry Core.

Alle eksperimenter beskrevet i dette manuskriptet ble utført med godkjenning av IACUC ved Johns Hopkins University School of Medicine.
1. Forberedelser
<ol><li>Klargjør FACS-bufferen, som beskrevet i tabell 1.</li>
	<li>Sørg for at det er nok CO2 til å avlive dyrene.</li>
	<li>Forbered disseksjonsplassen (plasser benkputen og plasser tape- og disseksjonsverktøyene i nærheten).</li>
	<li>Merk 15 ml rørene, sett 3 ml HBSS med kalsium og magne...

<ol>
	<li>Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+B+lymphocytes+in+cardiovascular+disease.">The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease.</a> Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).</li><li>Gowans, J. L., Knight, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+route+of+re-circulation+of+lymphocytes+in+the+rat.">The route of re-circulation of lymphocytes in the rat.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).</li><li>Kunkel, E. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+the+tissue-specific+migration+of+lymphocytes.">Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes.</a> Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+controlling+homeostatic+recirculation+and+tissue-specific+trafficking+of+lymphocytes.">Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).</li><li>Rocha-Resende, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+myocardial+B+cells+mirror+changes+in+B+cells+associated+with+different+organs.">Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs.</a> JCI Insight. 5 (16), (2020).</li><li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+B+cells+are+a+subset+of+circulating+lymphocytes+with+delayed+transit+through+the+heart.">Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart.</a> JCI Insight. 5 (3), 139377 (2020).</li><li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+subsets+of+cardiac+B+lymphocytes+improves+cardiac+function+after+acute+injury.">Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury.</a> JCI Insight. 3 (11), (2018).</li><li>Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+modulate+the+expression+of+MHC-II+on+cardiac+CCR2(-)+macrophages.">B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).</li><li>Zouggari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+trigger+monocyte+mobilization+and+impair+heart+function+after+acute+myocardial+infarction.">B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).</li><li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-10-producing+B+cells+are+enriched+in+murine+pericardial+adipose+tissues+and+ameliorate+the+outcome+of+acute+myocardial+infarction.">IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).</li><li>Heinrichs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+mobilizes+a+distinct+B-cell+subset+through+a+CXCL13-CXCR5-dependent+mechanism.">The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism.</a> Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splenic+marginal+zone+B+lymphocytes+regulate+cardiac+remodeling+after+acute+myocardial+infarction+in+mice.">Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice.</a> Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).</li><li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+dynamics+of+cardiac+immune+cell+accumulation+following+acute+myocardial+infarction.">Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).</li><li>Iwata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+against+the+second+extracellular+loop+of+beta(1)-adrenergic+receptors+induces+beta-adrenergic+receptor+desensitization+and+myocardial+hypertrophy+in+vivo.">Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo.</a> Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).</li><li>Jahns, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+a+beta+1-adrenergic+receptor-directed+autoimmune+attack+as+a+cause+of+idiopathic+dilated+cardiomyopathy.">Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).</li><li>Christ, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+against+the+beta1+adrenoceptor+from+patients+with+dilated+cardiomyopathy+prolong+action+potential+duration+and+enhance+contractility+in+isolated+cardiomyocytes.">Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).</li><li>Jane-wit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenergic+receptor+autoantibodies+mediate+dilated+cardiomyopathy+by+agonistically+inducing+cardiomyocyte+apoptosis.">Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis.</a> Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).</li><li>Ludwig, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+autoantibody-induced+pathology.">Mechanisms of autoantibody-induced pathology.</a> Frontiers in Immunology. 8, 603 (2017).</li><li>Haudek, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor+engagement+mediates+differentiation+of+cardiac+fibroblast+precursor+cells.">Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).</li><li>Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc(gamma)+receptors+IIa+on+cardiomyocytes+and+their+potential+functional+relevance+in+dilated+cardiomyopathy.">Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy.</a> Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+natural+IgM+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury.">The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+specific+self-reactive+IgM+antibody+that+initiates+intestinal+ischemia/reperfusion+injury.">Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).</li><li>Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+ADP-ATP+carrier--an+autoantigen+in+myocarditis+and+dilated+cardiomyopathy--impair+cardiac+function.">Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function.</a> Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).</li><li>Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+epitope+spreading+is+a+critical+step+for+the+switch+from+C-protein-induced+myocarditis+to+dilated+cardiomyopathy.">B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy.</a> The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).</li><li>Caforio, A. L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+state+of+knowledge+on+aetiology,+diagnosis,+management,+and+therapy+of+myocarditis:+a+position+statement+of+the+European+Society+of+Cardiology+Working+Group+on+Myocardial+and+Pericardial+Diseases.">Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases.</a> European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues.">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Horckmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericardial+adipose+tissue+regulates+granulopoiesis,+fibrosis+and+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction.</a> Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Bajpai, G., Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+macrophage+subsets+and+stromal+cells+from+human+and+mouse+myocardial+specimens.">Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60015 (2019).</li><li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes.">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li><li>Coffman, R. L., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B220:+a+B+cell-specific+member+of+th+T200+glycoprotein+family.">B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family.</a> Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).</li><li>Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+B+cell+development+in+the+fetus+and+adult.">B-1 B cell development in the fetus and adult.</a> Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).</li><li>Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+B+cells+in+cardiomyopathy+and+heart+failure.">The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure.</a> Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).</li><li>Zhao, T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rituximab+in+patients+with+acute+ST-elevation+myocardial+infarction:+an+experimental+medicine+safety+study.">Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).</li><li>Kushnir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B2+but+not+B1+cells+can+contribute+to+CD4++T-cell-mediated+clearance+of+rotavirus+in+SCID+mice.">B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice.</a> Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).</li></ol>

En økende mengde bevis indikerer at B-celler spiller en viktig rolle i sammenheng med myokardfysiologi og myokardremodellering / tilpasning til skade 7,8,9,10,11,12,13,36. Flowcytometri er et utmerket verktøy for å studere immuncellepopulasjoner i ethver...

B-lymfocytter er høyt spesialiserte immunceller som spiller en viktig rolle i både adaptive og medfødte immunresponser1. Det er to hovedpopulasjoner av B-celler: en mindre populasjon av B1-celler som hovedsakelig produseres under embryonalt liv, og en overveiende populasjon av B2-celler som produseres i voksenlivet i benmargen1. Etter modning i benmargen migrerer B-celler til primære og sekundære lymfoide organer. Derfra resirkulerer de kontinuerlig mellom lymfoide organer som beveger seg gjennom blodkar og lymfekar2. B-celler uttrykker spesifikke antistoffer på overflaten, som fungerer som reseptorer. Når B-celler møter et antigen som binder seg til reseptoren, kan et aktiveringssignal utløses. Aktiverte B-celler migrerer enten til vevet der antigenet ble funnet eller går tilbake til benmargen hvor de kan modnes til antistoffproduserende plasmaceller 3,4.
Nylig har det blitt verdsatt at hjertet har en betydelig populasjon av B-celler. Studier på gnagere har vist at B-celler koloniserer hjertet tidlig under embryonal utvikling5, og at myokardassosierte B-celler for det meste er intravaskulære, naive B2-celler som holder seg til endotelet6,7, med en liten prosentandel av B1-celler7. Det er fortsatt mange usikkerhetsområder, men tilgjengelige data indikerer at B-celler spiller en viktig rolle både i det naive hjertet og i sammenheng med myokardtilpasning til skade.
Studier i det naive murine hjertet har vist at ved baseline myokardiale B-celler hovedsakelig er lokalisert i det intravaskulære rommet, festet til endotelet (>95% av murine hjerte B-celler ble funnet å være lokalisert i det intravaskulære rommet). Disse B-cellene ble funnet å ha genuttrykksmønstre som er forskjellige fra sirkulerende B-celler isolert fra perifert blod. Analyse av naive hjerter fra B-cellefattige dyr og syngeneiske kontroller fant at dyr som manglet B-celler hadde mindre hjerter og høyere ejeksjonsfraksjon6. Alt dette beviset tyder på at B-celler kan modulere myokardvekst og / eller myokardfunksjon, og at ikke bare interstitielle, men også intravaskulære B-celler kan være ansvarlige for slike observasjoner. B-celler ble også funnet å modulere fenotypen av myokardiale bosatt makrofager8.
Flere studier har vist at B-celler spiller en viktig rolle i sammenheng med myokardtilpasning til skade 8,9,10,11,12,13. B-celler akkumuleres forbigående i det skadede hjertet, sannsynligvis gjennom en CXCL13-CXCR5-avhengig mekanisme11,13. Derfra fremmer B-celler ugunstig hjerteombygging gjennom flere mekanismer som inkluderer cytokinmediert monocytrekruttering 9,12. I tillegg kan B-celler produsere antistoffer mot hjerteproteiner som kan fremme forlengelse av hjerteskader og ugunstig hjerteombygging gjennom flere mekanismer 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B-celler kan også utøve beskyttende effekter på det skadede hjertet gjennom utskillelsen av IL-1010.
Etter hvert som antall grupper som undersøker B-cellenes rolle i det naive og skadede hjertet vokser, blir det mer og mer viktig å definere delte protokoller for å kvantifisere og vurdere myokardiale B-celler på riktig måte og dermed unngå inkonsekvenser som allerede har begynt å vises i litteraturen. Så langt har B-celler faktisk både blitt rapportert å være en av de mest utbredte immuncellene i gnagerhjertet7 og å være til stede ved en markant lavere prevalens enn myeloide celler26,27, eller å være ganske sjeldne 28. Tilsvarende har flere grupper beskrevet at antall myokard-B-celler øker etter akutt iskemisk myokardskade 7,9,13, men en gruppe rapporterte ingen endringer i antall B-celler i det skadde myokardiet29. Studier på hjerteimmunceller gir sjelden detaljer om perfusjonsforhold, og det er ingen konsensus om fordøyelsesforholdene. Siden en stor andel B-celler i gnagerhjertet er intravaskulære og ekstraksjon av immunceller fra myokardiet er svært avhengig av fordøyelsesmetoden som brukes, kan forskjellene rapportert i litteraturen være et resultat av forskjeller i organperfusjon og vevsfordøyelse.
Presentert her er en detaljert metode for flowcytometribasert kvantifisering av murine myokardiale B-celler som maksimerer utbyttet av B-celleutvinning ved å optimalisere perfusjons- og fordøyelsesforhold og tillater diskriminering av intravaskulære vs. ekstravaskulære myokard-B-celler6. Denne protokollen er en tilpasning og optimalisering av andre lignende protokoller som skiller mellom intravaskulære og interstitielle immunceller 28,30,31.
I denne protokollen standardiserer vi myokardperfusjon for å eliminere B-celler som flyter i det intravaskulære rommet uten å fjerne biologisk relevante B-celler festet til det mikrovaskulære endotelet. Videre, ved å bygge på tidligere protokoller som har beskrevet bruken av intravenøs injeksjon av antistoffer for å skille intravaskulære fra interstitielle immunceller32, og dra nytte av det faktum at B-celler uttrykker overflatemarkøren B22033, demonstrerer vi hvordan man skiller intravaskulære vs. ekstravaskulære myokardiale B-celler gjennom intravaskulær injeksjon av et B220-spesifikt antistoff umiddelbart før dyreofring og hjerteperfusjon. Denne protokollen er relevant for forskningen til enhver forsker som er interessert i å inkludere analysen av myokardiale B-celler i det naive og skadede hjertet. Den utbredte implementeringen av denne protokollen vil redusere uoverensstemmelser mellom forskningsgrupper, vil tillate analyse av endringer i intravaskulære og ekstravaskulære myokardiale B-cellebassenger, og vil dermed styrke utviklingen av funn innen hjerteimmunologi.
Oppsummert representerer protokollen en optimalisert arbeidsflyt for å kvantifisere og analysere myokardiale B-celler via flowcytometri, og samtidig skille mellom celler lokalisert i det ekstravaskulære rommet og det intravaskulære rommet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody</td>
			<td>101222</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100 &#181;g 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 &#181;m, Blue</td>
			<td>QBIAP303</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube</td>
			<td>1605-0000</td>
			<td>SealRite, USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Injection, USP</td>
			<td>114-055-101</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>0.90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>SealRite, USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11213810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11267810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free</td>
			<td>430052</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Way Stop Valve, Polycarbonate</td>
			<td>SVPT951</td>
			<td>ECT Manufacturing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td>T48402</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11208810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Way Stop Valve, Polycarbonate</td>
			<td>SVPT953</td>
			<td>ECT Manufacturing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style</td>
			<td>352054</td>
			<td>Falcon, a Corning Brand</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free</td>
			<td>430290</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63</td>
			<td>5810759005</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62</td>
			<td>22638289</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 &#8211; 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62</td>
			<td>22638246</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil 12 in x 75&#39; Roll .0007</td>
			<td>UPC 109153</td>
			<td>Reynolds Wrap</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Induction Chamber - Mouse</td>
			<td>RWD-AICMV-100</td>
			<td>Conduct Science</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL</td>
			<td>309626</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2&#34; 100-Pack</td>
			<td>CMD 2613</td>
			<td>Brandzig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody</td>
			<td>115537</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 &#181;m, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile</td>
			<td>T9009</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Dioxide USP E CGA 940&#160;</td>
			<td>CD USPE</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL</td>
			<td>UX-34502-46</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 2</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector brass chrome plated 1/4&#34; female NPT x 1/4&#34; barb</td>
			<td>Y992611-AG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytek Aurora Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td>Cytek Biosciences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP</td>
			<td>M-08-12</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I - 40,000 U</td>
			<td>D4527</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypet&#160;3 - Electronic Pipette Controller</td>
			<td>4430000018</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Balance, AX223/E</td>
			<td>30100606</td>
			<td>Ohaus Corp.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes</td>
			<td></td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.1</td>
			<td></td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100)</td>
			<td>Z740287</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]</td>
			<td>14025076</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>H3506</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostats, Straight</td>
			<td>13018-14</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL</td>
			<td>302831</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940</td>
			<td>M1-940-PG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McKesson Underpads, Moderate</td>
			<td>4033-CS150</td>
			<td>McKesson</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navigator Multi-Purpose Portable Balance</td>
			<td>NV2201</td>
			<td>Ohaus Corp.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]</td>
			<td>10010023</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody</td>
			<td>103208</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>200 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>103132</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100 &#181;g 500 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene</td>
			<td>FB0875711YZ</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02</td>
			<td>M08-1</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator</td>
			<td>LED-6W</td>
			<td>AmScope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm)</td>
			<td>305122</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO)</td>
			<td>553141</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company Biosciences</td>
			<td>0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 4.1.1</td>
			<td></td>
			<td>The R Foundation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>9501250000</td>
			<td>Accutec Blades Inc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet</td>
			<td>Y12244A320-AG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets</td>
			<td>Rotor A-4-62</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma label tape</td>
			<td>L8394</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroFlo 3.0.0</td>
			<td></td>
			<td>Cytek Biosciences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8&#34; Hose Barb; 1/EA</td>
			<td>MTLL230-6005</td>
			<td>Spex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8&#34; ID x 3/16&#34; OD x 1/32&#34; Wall x 50&#39; Long</td>
			<td>CG-730-003</td>
			<td>Excelon Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe PP/PE without needle, 3 mL</td>
			<td>Z683566</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>55-1199 (95-240)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500</td>
			<td>9371W13</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rack, 12&#160;positions, 6 for 5.0&#160;mL and 15&#160;mL tubes and 6 for 25&#160;mL and 50&#160;mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable</td>
			<td>30119835</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rack, 12&#160;positions, for 5.0&#160;mL and 15&#160;mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable</td>
			<td>30119827</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. &#215; O.D. 1/4 in. &#215; 3/8 in.</td>
			<td>T8913 (Millipore Sigma)</td>
			<td>Tygon, Saint-Gobain</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Scientific Industries, Inc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips</td>
			<td>89259-946</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4&#189;&#34;</td>
			<td>82027-578</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I</td>
			<td>12620-946</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>423102</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry-based quantification and analysis of myocardial b-cells

En økende mengde bevis viser at B-lymfocytter spiller en viktig rolle i sammenheng med myokardfysiologi og myokardtilpasning til skade. Litteraturen rapporterer imidlertid kontrasterende data om forekomsten av myokard-B-celler. B-celler har blitt rapportert å være både blant de mest utbredte immuncellene i gnagerhjertet eller å være til stede, men med en markant lavere prevalens enn myeloide celler, eller å være ganske sjeldne. Tilsvarende har flere grupper beskrevet at antall myokard-B-celler øker etter akutt iskemisk myokardskade, men én gruppe rapporterte ingen endringer i antall B-celler i det skadde myokard. Implementering av en felles, reproduserbar metode for å vurdere forekomsten av myokardiale B-celler er avgjørende for å harmonisere observasjoner fra ulike forskningsgrupper og dermed fremme utviklingen av studiet av B-celle myokardinteraksjoner. Basert på vår erfaring stammer de tilsynelatende kontrasterende observasjonene som er rapportert i litteraturen sannsynligvis fra det faktum at murine myokard-B-celler for det meste er intravaskulære og koblet til det mikrovaskulære endotelet. Derfor er antall B-celler gjenvunnet fra et murine hjerte utsøkt følsomt for perfusjonsbetingelsene som brukes til å rense orgelet og til fordøyelsesmetoden som brukes. Her rapporterer vi en optimalisert protokoll som tar hensyn til disse to kritiske variablene på en bestemt måte. Denne protokollen muliggjør reproduserbar, flowcytometribasert analyse av antall murine myokardiale B-celler og lar forskere skille ekstravaskulære vs. intravaskulære myokardiale B-celler.

Når innsamlingen er fullført og alle hendelsene er samlet inn, skal dataene analyseres i henhold til standard flowcytometripraksis. Fokuset på analysen vil variere avhengig av det individuelle målet for hvert eksperiment. I dette tilfellet ble kvantifisering av intravaskulære og ekstravaskulære B-celler forfulgt, og det ble uttrykt som antall celler per mg vev.
Når du bruker et spektralt cytometer, anbefales det å starte analysen med en innledende gating for å fjerne rusk med størrel...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells at JoVE.com

Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells

Her rapporterer vi en protokoll for kvantifisering og differensiering av myokardiale B-lymfocytter basert på deres plassering i det intravaskulære eller endotelialrommet ved hjelp av flowcytometri.

Flowcytometribasert kvantifisering og analyse av myokardceller

A growing body of evidence shows that B-lymphocytes play an important role in the context of myocardial physiology and myocardial adaptation to injury. ...

Litteraturen rapporterer kontrasterende data om forekomsten av myokard-B-celler. Dette stammer sannsynligvis fra variasjon i perfusjons- og fordøyelsesteknikker. Vår protokoll muliggjør reproduserbar flowcytometribasert analyse av myokard B-celler.Denne teknikken maksimerer utvinningsutbyttet av B-celler og reduserer variabiliteten i antall flowcytometri blant B-celler og andre populasjoner fra hjerteprøver. Denne optimaliserte fordøyelses- og isolasjonsmetoden kan enkelt modifiseres for å implementere et utvidet antistoffpanel for å studere forskjellige immuncelletyper i hjertet. Protokollen kan også brukes på andre organer, som lunge eller lever, for å studere B-celler assosiert med disse organene.For å begynne, vei en 12 uker gammel hannmus. Legg i en 310 cc insulin sprøyte med 100 mikroliter av B220 antistoff løsning. Injiser det fortynnede B220-antistoffet ved retro-orbital injeksjon og fortsett straks til organhøsting og perfusjon.Etter eutanasi, hold musens hud med tang på det epigastriske området. Lag en to millimeter åpning i huden ved hjelp av saks og bruk tangen til å skrelle huden bort for å avsløre fascialaget. Skjær ved epigastrium gjennom fascia og peritoneum.Klem xiphoidprosessen ved hjelp av hemostatiske tang. Lag et vertikalt kutt gjennom brystveggen på nivå med midtklavikulærlinjen på hver side og løft den fremre brystveggen for å avsløre mediastinuminnholdet. Hold aorta sikkert bakfra ved hjelp av tang.Stikk sprøytekanylen inn i toppen av hjertet. Perfused med tre milliliter HBSS med en hastighet på tre milliliter per minutt. Klipp aorta og fjern hjertet.Vask hjertet i petriskålen med HBSS. Vei det isolerte hjertet og noter vekten i milligram. Hakk hjertet ved romtemperatur i små biter med et blad.Hjertebitene skal være omtrent 1,5 millimeter store. Mål massen av hjertevev ved hjelp av en balanse og plasser 60 milligram av hakket hjerte som skal fordøyes i et 15 milliliter rør på is med tre milliliter HBSS. Gjenta denne prosessen for en mus som ikke mottok B220 antistoffinjeksjon og legg den i røret med tre milliliter HBSS merket referansekontrollvev.Tilsett enzymer til hvert rør som inneholder hakket vev. Tilsett 0,5 mikroliter per milligram DNase I, en 0,5 mikroliter per milligram kollagenase II og 0,2 mikroliter per milligram hyaluronidase. Plasser fordøyelsesreaksjonen i shakeren i 30 minutter ved 300 rotasjoner per minutt.Rør er plassert i shakeren i liten vinkel, ca 25 grader stigning. Tilsett syv milliliter HBSS til hver av 15 milliliter reaksjonsrør og sentrifuge ved 250 G i fem minutter ved fire grader Celsius. Etter dekantering av supernatanten, resuspend hver pellet i fem milliliter ACK lysis buffer.Inkuber i fem minutter ved romtemperatur. Etter å ha tilsatt 10 milliliter PBS til hvert rør, bland og filtrer inn i et 50 milliliter rør med en 40 mikrometer sil. Smash eventuelle rusk på filteret med et sprøytestempel for å sikre at alt materialet passerer gjennom filteret.Etter å ha tilsatt PBS gjennom filteret til volumet når 25 milliliter per hjerte, tilsett ytterligere 25 milliliter PBS til referansekontrollvevsrøret og del volumet i to forskjellige rør. Merk en av rørene unstained og den andre levende / død. Etter sentrifugering ved 250 G i fem minutter ved fire grader Celsius, dekanter supernatanten og resuspend det ufargede røret i 100 mikroliter PBS og hver av de andre pellets i 100 mikroliter av levende / død flekkløsning.Rug på is i 30 minutter i mørket. Etter å ha tilsatt 500 mikroliter FACS-buffer til hver prøve, overfør den til et FACS-rør gjennom et 40 mikrometerfilter. Etter å ha nektet FACS-rørene ved 250 G i fem minutter ved fire grader Celsius og kastet supernatanten, resuspend pelleten i 500 mikroliter FACS-buffer.Tilsett 50 mikroliter FC-blokkeringsløsning til hvert rør, bortsett fra de ufargede og levende / døde rørene. Bland og inkuber i fem minutter. Etter tilsetning av 50 mikroliter antistoffblandingsløsning til hvert rør, bortsett fra de ufargede og levende / døde rørene, inkuberer i 30 minutter i mørket, og dekker isbøtta med aluminiumsfolie.Som med levende / død flekk, vask igjen med 500 mikroliter FACS-buffer og resuspend i 300 til 500 mikroliter FACS-buffer. Åpne instrumentkontrollprogramvaren. Øverst i vinduet velger du kategorien Anskaffelse og klikker på Ny.I bibliotekdelen, i feltet Skriv inn for å filtrere, skriv PE, PerCP-Cy5.5, strålende fiolett 421, Alexa Fluor 700 og Zombie Aqua, velg fluor-4 og klikk Legg til etter å ha skrevet hver. Klikk deretter neste for å fortsette til grupper fanen. Klikk nå på symbolet med et rør for å legge til hjertet for analysen.Klikk på referansegruppen og et vindu vises. I kolonnen fluorescerende tagger velger du Zombie Aqua som fluorescerende tag, og sletter andre ved å klikke på det papirkurvrøde ikonet ved siden av hver. Velg deretter Celler i Kontrolltype-ikonet.Klikk deretter Lagre. Klikk på Neste. Klikk deretter kategorien Markører.En tabell vises. Skriv inn den tilsvarende cellemarkøren i den første raden i hver fluor-4-kolonne, og trykk Enter. Klikk Neste to ganger for å gå til kategorien Brukeranskaffelse.I Hendelser som skal registreres for de eksperimentelle prøvene, skriv inn 10 millioner, og i samme felt for referansegruppelinjen, skriv inn 200 000. Klikk Lagre og åpne. Nederst til venstre klikker du på Instrumentkontroll.Sett spenningen til FSC 50, SSC 175, SSC-B 175. Velg Anskaffelseskontroll. For alternativet Strømningshastighet velger du Høy fra rullegardinmenyen.Vortex det ufargede hjerterøret og plasser det sikkert på prøveinjeksjonsporten. Forsikre deg om at den grønne indikatorpilen peker mot riktig prøve. Klikk deretter på Record og vent til hendelsene er registrert.Gjør det samme for levende / dødt farget hjertevev. Velg Oppbryt-menyen, og angi kontrollene. Merk av for Autofluorescens som en fluorescerende tag.Klikk deretter Neste for å gå videre til fanen Identifiser positive/negative populasjoner. I denne kategorien vises et plott av fremskutt spredningsområde kontra sidespredningsområde. Klikk og dra punktene i polygonen for å velge et område mellom 1 og 4 millioner på den fremre spredningsaksen og mellom 0,2 og 3 millioner på sidespredningsaksen.I neste plott til høyre vises V5-A på X-aksen. Flytt portene for å velge halvparten av toppen helt til høyre som positiv, og en region på venstre side av tomten som negativ. I plottet med tittelen Referansegruppe-Unstained velger du en populasjon i et lignende område.For de ufargede må ingen positive/negative velges. Klikk på Live Unmixing-knappen. Nå skaffe eksperimentelle prøver, vortex røret, og plassere den sikkert på SIP.Forsikre deg om at den grønne indikatorpilen peker mot riktig prøve. Klikk deretter på Record i Acquisition Control-panelet i cytometerprogramvaren og vent til hendelsene er registrert. Velg kategorien Standard ublandet regneark.Opprett et FCS-A versus SSC-A-plott ved hjelp av punktdiagramverktøyet øverst. Velg hendelser som er høyere enn 0,4 millioner på FSC-A-aksen og høyere enn 0,8 millioner på SSC-A-aksen ved hjelp av mangekantmarkeringsverktøyet. Opprett et nytt plott ved å dobbeltklikke på utvalget, og i denne nye tegningen høyreklikker du på Y-akseetiketten og velger levende/død flekk.Høyreklikk på X-akseetiketten og velg Autofluorescens A.Velg alle hendelsene under 10 til den femte på den levende / døde aksen. Dette er de levende cellene. Dobbeltklikk i dette utvalget.I det nye plottet velger du PerCP-Cy5.5A for X-aksen og SSC-A for Y-aksen. Velg populasjonene på høyre side av PerCP-Cy5.5A. Dette er immuncellene.Dobbeltklikk på utvalget. På det nye plottet velger du FSC-A for X-aksen og fremre spredningshøyde for Y-aksen. Velg hendelsene som følger en trend der FSC-A-verdien og SSC-A-verdien er de samme.Dette velger enkeltceller og eliminerer dubletter. Dobbeltklikk på dette valget for å vise et nytt plott i den CD45-positive enkeltcellepopulasjonen. Fra det CD45-positive enkeltcellede populasjonsplottet velger du strålende fiolett 421 på X-aksen versus SSC-A på Y-aksen.Velg populasjonen til høyre på den strålende fiolette 421-aksen. Dette er B-cellepopulasjonen. Dobbeltklikk to ganger i denne populasjonen for å opprette to nye plott med B-cellepopulasjonen.Sett opp det første B-celleplottet med PEA på X-aksen og den briljante fiolette 421A på Y-aksen. Populasjonen til høyre tilsvarer de intervaskulære B-cellene, og populasjonen til venstre representerer de interstitielle B-cellene. Velg begge.Sett opp det andre B-celleplottet med Alexa Fluor 700A på X-aksen og SSC-A på Y-aksen. Populasjonen til venstre tilsvarer CD11b-negative celler, og hendelsene til høyre tilsvarer CD11b-positive celler. Høyreklikk på hver seksjon og klikk deretter Gate egenskaper.Klikk på Antall og foreldre for å vise antall hendelser og prosentandeler av foreldrepopulasjonene. Registrer antall hendelser og prosentandeler for videre dataanalyse. Etter fjerning av dubletter i et naivt ubesudlet hjerte, forventes det at omtrent 20% av CD45-positive celler kommer til å være CD19-positive B-celler.Av disse cellene er i gjennomsnitt 5, 5% lokalisert i interstitialrommet. 94, 5% er i det intravaskulære rommet. Fra hele B-cellepopulasjonen som finnes i hjertet, tilsvarer bare ca. 1,6% B1-celler basert på overflatemarkøren CD11b og de andre 98,4% tilsvarer B2-celler.Ved analyse av myokardiale B-celler via flowcytometri er det avgjørende å perfusere og hakke hjertet riktig etter protokollen. Riktig filtrering av fordøyd hjerte er også viktig for å maksimere utvinningen av immunceller.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Den Isolation, Differensiering, og Kvantifisering av humane antistoff-sekresjon B-celler fra blod: ELISPOT som en funksjonell Avlesning av humoral immunitet

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Flowcytometri basert analyse for overvåking av NK cellefunksjoner

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Vurdere Netthinne microglial fagocyttfunksjon<em&gt; I Vivo</em&gt; Ved hjelp av en flowcytometrisystemer basert analyse

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Oppdagelse og berikelse av Rare antigen-spesifikke B-celler for analyse av fenotype og funksjon

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

En flyt cytometri-baserte cytotoksisitet analysen for vurdering av menneskelig NK celle aktivitet

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Analyse av skjær flyt-indusert migrering av murint Marginal sone B celler In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Flerfarget flyt cytometri-baserte kvantifisering av mitokondrier og lysosomer i T-celler

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Måling naturlig ervervet phagocytosis-induserende antistoffer mot Plasmodium falciparum parasitter ved en Flow Cytometry-basert analyse

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...