Name: flow cytometry-based quantification and analysis of myocardial b-cells
Uploaded: 2022-08-17T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells at JoVE.com

Este estudio fue financiado por las subvenciones del NHLBI 5K08HLO145108-03 y 1R01HL160716-01 otorgadas a Luigi Adamo.
El citómetro de flujo Aurora utilizado para desarrollar este estudio fue financiado por la subvención S10OD026859 de los NIH. Reconocemos el apoyo del JHU Ross Flow Cytometry Core.

Todos los experimentos descritos en este manuscrito se realizaron con la aprobación del IACUC en la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins.
1. Preparativos
<ol><li>Prepare el búfer del sistema de control de los bienes sobre el terreno, como se describe en el cuadro 1.</li>
	<li>Asegúrese de que haya suficienteCO2 para sacrificar a los animales.</li>
	<li>Prepare el espacio de disección (coloque la almohadilla de banco y coloque l...

<ol>
	<li>Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+B+lymphocytes+in+cardiovascular+disease.">The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease.</a> Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).</li><li>Gowans, J. L., Knight, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+route+of+re-circulation+of+lymphocytes+in+the+rat.">The route of re-circulation of lymphocytes in the rat.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).</li><li>Kunkel, E. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+the+tissue-specific+migration+of+lymphocytes.">Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes.</a> Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+controlling+homeostatic+recirculation+and+tissue-specific+trafficking+of+lymphocytes.">Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).</li><li>Rocha-Resende, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+myocardial+B+cells+mirror+changes+in+B+cells+associated+with+different+organs.">Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs.</a> JCI Insight. 5 (16), (2020).</li><li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+B+cells+are+a+subset+of+circulating+lymphocytes+with+delayed+transit+through+the+heart.">Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart.</a> JCI Insight. 5 (3), 139377 (2020).</li><li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+subsets+of+cardiac+B+lymphocytes+improves+cardiac+function+after+acute+injury.">Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury.</a> JCI Insight. 3 (11), (2018).</li><li>Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+modulate+the+expression+of+MHC-II+on+cardiac+CCR2(-)+macrophages.">B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).</li><li>Zouggari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+trigger+monocyte+mobilization+and+impair+heart+function+after+acute+myocardial+infarction.">B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).</li><li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-10-producing+B+cells+are+enriched+in+murine+pericardial+adipose+tissues+and+ameliorate+the+outcome+of+acute+myocardial+infarction.">IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).</li><li>Heinrichs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+mobilizes+a+distinct+B-cell+subset+through+a+CXCL13-CXCR5-dependent+mechanism.">The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism.</a> Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splenic+marginal+zone+B+lymphocytes+regulate+cardiac+remodeling+after+acute+myocardial+infarction+in+mice.">Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice.</a> Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).</li><li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+dynamics+of+cardiac+immune+cell+accumulation+following+acute+myocardial+infarction.">Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).</li><li>Iwata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+against+the+second+extracellular+loop+of+beta(1)-adrenergic+receptors+induces+beta-adrenergic+receptor+desensitization+and+myocardial+hypertrophy+in+vivo.">Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo.</a> Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).</li><li>Jahns, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+a+beta+1-adrenergic+receptor-directed+autoimmune+attack+as+a+cause+of+idiopathic+dilated+cardiomyopathy.">Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).</li><li>Christ, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+against+the+beta1+adrenoceptor+from+patients+with+dilated+cardiomyopathy+prolong+action+potential+duration+and+enhance+contractility+in+isolated+cardiomyocytes.">Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).</li><li>Jane-wit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenergic+receptor+autoantibodies+mediate+dilated+cardiomyopathy+by+agonistically+inducing+cardiomyocyte+apoptosis.">Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis.</a> Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).</li><li>Ludwig, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+autoantibody-induced+pathology.">Mechanisms of autoantibody-induced pathology.</a> Frontiers in Immunology. 8, 603 (2017).</li><li>Haudek, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor+engagement+mediates+differentiation+of+cardiac+fibroblast+precursor+cells.">Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).</li><li>Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc(gamma)+receptors+IIa+on+cardiomyocytes+and+their+potential+functional+relevance+in+dilated+cardiomyopathy.">Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy.</a> Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+natural+IgM+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury.">The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+specific+self-reactive+IgM+antibody+that+initiates+intestinal+ischemia/reperfusion+injury.">Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).</li><li>Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+ADP-ATP+carrier--an+autoantigen+in+myocarditis+and+dilated+cardiomyopathy--impair+cardiac+function.">Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function.</a> Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).</li><li>Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+epitope+spreading+is+a+critical+step+for+the+switch+from+C-protein-induced+myocarditis+to+dilated+cardiomyopathy.">B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy.</a> The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).</li><li>Caforio, A. L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+state+of+knowledge+on+aetiology,+diagnosis,+management,+and+therapy+of+myocarditis:+a+position+statement+of+the+European+Society+of+Cardiology+Working+Group+on+Myocardial+and+Pericardial+Diseases.">Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases.</a> European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues.">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Horckmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericardial+adipose+tissue+regulates+granulopoiesis,+fibrosis+and+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction.</a> Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Bajpai, G., Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+macrophage+subsets+and+stromal+cells+from+human+and+mouse+myocardial+specimens.">Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60015 (2019).</li><li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes.">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li><li>Coffman, R. L., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B220:+a+B+cell-specific+member+of+th+T200+glycoprotein+family.">B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family.</a> Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).</li><li>Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+B+cell+development+in+the+fetus+and+adult.">B-1 B cell development in the fetus and adult.</a> Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).</li><li>Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+B+cells+in+cardiomyopathy+and+heart+failure.">The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure.</a> Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).</li><li>Zhao, T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rituximab+in+patients+with+acute+ST-elevation+myocardial+infarction:+an+experimental+medicine+safety+study.">Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).</li><li>Kushnir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B2+but+not+B1+cells+can+contribute+to+CD4++T-cell-mediated+clearance+of+rotavirus+in+SCID+mice.">B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice.</a> Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).</li></ol>

Un creciente cuerpo de evidencia indica que las células B juegan un papel importante en el contexto de la fisiología miocárdica y la remodelación/adaptación miocárdica a la lesión 7,8,9,10,11,12,13,36. La citometría de flujo es una excelente herrami...

Los linfocitos B son células inmunes altamente especializadas que desempeñan un papel importante en las respuestas inmunes adaptativas e innatas1. Hay dos poblaciones principales de células B: una población más pequeña de células B1 que se producen principalmente durante la vida embrionaria, y una población preponderante de células B2 que se producen en la vida adulta en la médula ósea1. Después de madurar en la médula ósea, las células B migran a los órganos linfoides primarios y secundarios. Desde allí recirculan continuamente entre los órganos linfoides viajando a través de los vasos sanguíneos y linfáticos2. Las células B expresan anticuerpos específicos en su superficie, que funcionan como receptores. Cuando las células B encuentran un antígeno que se une a su receptor, se puede activar una señal de activación. Las células B activadas migran al tejido donde se encontró el antígeno o regresan a la médula ósea, donde pueden madurar y convertirse en células plasmáticas productoras de anticuerpos 3,4.
Recientemente, se ha apreciado que el corazón alberga una población considerable de células B. Estudios en roedores han demostrado que las células B colonizan el corazón temprano durante el desarrollo embrionario5, y que las células B asociadas al miocardio son en su mayoría células B2 intravasculares, ingenuas, adheridas al endotelio6,7, con un pequeño porcentaje de células B17. Todavía hay muchas áreas de incertidumbre, pero los datos disponibles indican que las células B desempeñan un papel importante tanto en el corazón ingenuo como en el contexto de la adaptación miocárdica a la lesión.
Los estudios en el corazón murino naïve han demostrado que, al inicio del estudio, las células B miocárdicas se encuentran principalmente en el espacio intravascular, adheridas al endotelio (se encontró que el >95% de las células B cardíacas murinas se encontraban en el espacio intravascular). Se encontró que estas células B tienen patrones de expresión génica diferentes de los de las células B circulantes aisladas de la sangre periférica. El análisis de corazones ingenuos de animales deficientes en células B y controles singénicos encontró que los animales que carecían de células B tenían corazones más pequeños y una mayor fracción de eyección6. Toda esta evidencia sugiere que las células B podrían modular el crecimiento miocárdico y / o la función miocárdica, y que no solo las células B intersticiales sino también las intravasculares podrían ser responsables de tales observaciones. También se encontró que las células B modulan el fenotipo de los macrófagos residentes del miocardio8.
Varios estudios han demostrado que las células B juegan un papel importante en el contexto de la adaptación miocárdica a la lesión 8,9,10,11,12,13. Las células B se acumulan transitoriamente en el corazón lesionado, probablemente a través de un mecanismo dependiente de CXCL13-CXCR511,13. A partir de ahí, las células B promueven la remodelación cardíaca adversa a través de varios mecanismos que incluyen el reclutamiento de monocitos mediados por citoquinas 9,12. Además, las células B pueden producir anticuerpos contra proteínas cardíacas que pueden promover la extensión del daño cardíaco y la remodelación cardíaca adversa a través de varios mecanismos 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . Las células B también pueden ejercer efectos protectores sobre el corazón lesionado a través de la secreción de IL-1010.
A medida que crece el número de grupos que investigan el papel de las células B en el corazón ingenuo y lesionado, cada vez es más importante definir protocolos compartidos para cuantificar y evaluar adecuadamente las células B del miocardio y así evitar inconsistencias que ya han comenzado a aparecer en la literatura. Hasta ahora, se ha informado que las células B son una de las células inmunes más prevalentes en el corazón de roedores7 y están presentes en una prevalencia marcadamente menor que las células mieloides26,27, o que son bastante raras 28. Del mismo modo, varios grupos han descrito que el número de células B miocárdicas aumenta después de la lesión miocárdica isquémica aguda 7,9,13, pero un grupo no informó cambios en el número de células B del miocardio lesionado29. Los estudios sobre las células inmunes cardíacas rara vez dan detalles sobre las condiciones de perfusión y no hay consenso sobre las condiciones de digestión. Dado que en el corazón de roedor una gran proporción de células B son intravasculares y la extracción de células inmunes del miocardio depende en gran medida del método de digestión utilizado, las diferencias reportadas en la literatura podrían ser el resultado de diferencias en la perfusión de órganos y la digestión de tejidos.
Aquí se presenta un método detallado para la cuantificación basada en citometría de flujo de células B miocárdicas murinas que maximiza el rendimiento de la recuperación de células B al optimizar las condiciones de perfusión y digestión y permite la discriminación de células B miocárdicas intravasculares vs. extravasculares6. Este protocolo es una adaptación y optimización de otros protocolos similares que distinguen entre células inmunes intravasculares e intersticiales 28,30,31.
En este protocolo, estandarizamos la perfusión miocárdica para eliminar las células B que flotan en el espacio intravascular sin eliminar las células B biológicamente relevantes adheridas al endotelio microvascular. Además, basándonos en protocolos previos que han descrito el uso de inyección intravenosa de anticuerpos para distinguir las células inmunes intravasculares de las intersticiales32, y aprovechando el hecho de que las células B expresan el marcador de superficie B22033, demostramos cómo distinguir las células B miocárdicas intravasculares frente a las extravasculares a través de la inyección intravascular de un anticuerpo específico B220 inmediatamente antes del sacrificio del animal y la perfusión cardíaca. Este protocolo es relevante para la investigación de cualquier científico interesado en incluir el análisis de células B miocárdicas en el corazón ingenuo y lesionado. La implementación generalizada de este protocolo reducirá las inconsistencias entre los grupos de investigación, permitirá el análisis de los cambios en los grupos de células B miocárdicas intravasculares y extravasculares y, por lo tanto, reforzará el avance de los descubrimientos en el campo de la inmunología cardíaca.
En resumen, el protocolo representa un flujo de trabajo optimizado para cuantificar y analizar las células B del miocardio a través de la citometría de flujo, y al mismo tiempo distinguir entre las células ubicadas en el espacio extravascular y el espacio intravascular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody</td>
			<td>101222</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100 &#181;g 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 &#181;m, Blue</td>
			<td>QBIAP303</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube</td>
			<td>1605-0000</td>
			<td>SealRite, USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Injection, USP</td>
			<td>114-055-101</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>0.90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>SealRite, USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11213810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11267810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free</td>
			<td>430052</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Way Stop Valve, Polycarbonate</td>
			<td>SVPT951</td>
			<td>ECT Manufacturing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td>T48402</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11208810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Way Stop Valve, Polycarbonate</td>
			<td>SVPT953</td>
			<td>ECT Manufacturing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style</td>
			<td>352054</td>
			<td>Falcon, a Corning Brand</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free</td>
			<td>430290</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63</td>
			<td>5810759005</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62</td>
			<td>22638289</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 &#8211; 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62</td>
			<td>22638246</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil 12 in x 75&#39; Roll .0007</td>
			<td>UPC 109153</td>
			<td>Reynolds Wrap</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Induction Chamber - Mouse</td>
			<td>RWD-AICMV-100</td>
			<td>Conduct Science</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL</td>
			<td>309626</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2&#34; 100-Pack</td>
			<td>CMD 2613</td>
			<td>Brandzig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody</td>
			<td>115537</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 &#181;m, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile</td>
			<td>T9009</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Dioxide USP E CGA 940&#160;</td>
			<td>CD USPE</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL</td>
			<td>UX-34502-46</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 2</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector brass chrome plated 1/4&#34; female NPT x 1/4&#34; barb</td>
			<td>Y992611-AG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytek Aurora Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td>Cytek Biosciences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP</td>
			<td>M-08-12</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I - 40,000 U</td>
			<td>D4527</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypet&#160;3 - Electronic Pipette Controller</td>
			<td>4430000018</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Balance, AX223/E</td>
			<td>30100606</td>
			<td>Ohaus Corp.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes</td>
			<td></td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.1</td>
			<td></td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100)</td>
			<td>Z740287</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]</td>
			<td>14025076</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>H3506</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostats, Straight</td>
			<td>13018-14</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL</td>
			<td>302831</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940</td>
			<td>M1-940-PG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McKesson Underpads, Moderate</td>
			<td>4033-CS150</td>
			<td>McKesson</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navigator Multi-Purpose Portable Balance</td>
			<td>NV2201</td>
			<td>Ohaus Corp.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]</td>
			<td>10010023</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody</td>
			<td>103208</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>200 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>103132</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100 &#181;g 500 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene</td>
			<td>FB0875711YZ</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02</td>
			<td>M08-1</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator</td>
			<td>LED-6W</td>
			<td>AmScope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm)</td>
			<td>305122</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO)</td>
			<td>553141</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company Biosciences</td>
			<td>0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 4.1.1</td>
			<td></td>
			<td>The R Foundation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>9501250000</td>
			<td>Accutec Blades Inc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet</td>
			<td>Y12244A320-AG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets</td>
			<td>Rotor A-4-62</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma label tape</td>
			<td>L8394</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroFlo 3.0.0</td>
			<td></td>
			<td>Cytek Biosciences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8&#34; Hose Barb; 1/EA</td>
			<td>MTLL230-6005</td>
			<td>Spex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8&#34; ID x 3/16&#34; OD x 1/32&#34; Wall x 50&#39; Long</td>
			<td>CG-730-003</td>
			<td>Excelon Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe PP/PE without needle, 3 mL</td>
			<td>Z683566</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>55-1199 (95-240)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500</td>
			<td>9371W13</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rack, 12&#160;positions, 6 for 5.0&#160;mL and 15&#160;mL tubes and 6 for 25&#160;mL and 50&#160;mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable</td>
			<td>30119835</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rack, 12&#160;positions, for 5.0&#160;mL and 15&#160;mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable</td>
			<td>30119827</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. &#215; O.D. 1/4 in. &#215; 3/8 in.</td>
			<td>T8913 (Millipore Sigma)</td>
			<td>Tygon, Saint-Gobain</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Scientific Industries, Inc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips</td>
			<td>89259-946</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4&#189;&#34;</td>
			<td>82027-578</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I</td>
			<td>12620-946</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>423102</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry-based quantification and analysis of myocardial b-cells

Un creciente cuerpo de evidencia muestra que los linfocitos B juegan un papel importante en el contexto de la fisiología miocárdica y la adaptación miocárdica a la lesión. Sin embargo, la literatura informa datos contrastantes sobre la prevalencia de las células B del miocardio. Se ha informado que las células B se encuentran entre las células inmunes más prevalentes en el corazón de roedores o que están presentes, pero con una prevalencia marcadamente menor que las células mieloides, o que son bastante raras. Del mismo modo, varios grupos han descrito que el número de células B miocárdicas aumenta después de la lesión miocárdica isquémica aguda, pero un grupo no informó cambios en el número de células B del miocardio lesionado. La implementación de un método compartido y reproducible para evaluar la prevalencia de las células B miocárdicas es fundamental para armonizar las observaciones de diferentes grupos de investigación y, por lo tanto, promover el avance del estudio de las interacciones miocárdicas de las células B. Según nuestra experiencia, las observaciones aparentemente contrastantes reportadas en la literatura probablemente se derivan del hecho de que las células B miocárdicas murinas son en su mayoría intravasculares y están conectadas al endotelio microvascular. Por lo tanto, el número de células B recuperadas de un corazón murino es exquisitamente sensible a las condiciones de perfusión utilizadas para limpiar el órgano y al método de digestión utilizado. Aquí informamos de un protocolo optimizado que da cuenta de estas dos variables críticas de una manera específica. Este protocolo permite el análisis reproducible basado en citometría de flujo del número de células B miocárdicas murinas y permite a los investigadores distinguir las células B miocárdicas extravasculares de las intravasculares.

Una vez que se completa la adquisición y se recopilan todos los eventos, los datos deben analizarse de acuerdo con la práctica estándar de citometría de flujo. El enfoque del análisis variará dependiendo del objetivo individual de cada experimento. En este caso, se buscó la cuantificación de células B intravasculares y extravasculares, y se expresó como el número de células por mg de tejido.
Cuando se utiliza un citómetro espectral, se recomienda comenzar el análisis con una acti...

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Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells

Aquí presentamos un protocolo para la cuantificación y diferenciación de linfocitos B miocárdicos en función de su ubicación en el espacio intravascular o endotelial mediante citometría de flujo.

Cuantificación basada en citometría de flujo y análisis de células B miocárdicas

A growing body of evidence shows that B-lymphocytes play an important role in the context of myocardial physiology and myocardial adaptation to injury. ...

La literatura reporta datos contrastantes sobre la prevalencia de células B miocárdicas. Esto probablemente se debe a la variabilidad en las técnicas de perfusión y digestión. Nuestro protocolo permite el análisis basado en citometría de flujo reproducible en células B miocárdicas.Esta técnica maximiza el rendimiento de recuperación de las células B y reduce la variabilidad en los recuentos de citometría de flujo entre las células B y otras poblaciones de muestras de corazón. Este método optimizado de digestión y aislamiento se puede modificar fácilmente para implementar un panel de anticuerpos extendido para estudiar diferentes tipos de células inmunes en el corazón. El protocolo también se puede aplicar a otros órganos, como el pulmón o el hígado, para estudiar las células B asociadas con esos órganos.Para empezar, pesa un ratón macho de 12 semanas de edad. Cargue una jeringa de insulina de 310 cc con 100 microlitros de la solución de anticuerpos B220. Inyecte el anticuerpo B220 diluido mediante inyección retroorbitaria y proceda rápidamente a la extracción de órganos y la perfusión.Después de la eutanasia, sostenga la piel del ratón con fórceps en el área epigástrica. Haga una abertura de dos milímetros en la piel con tijeras y use los fórceps para pelar la piel y revelar la capa de fascia. Corte en el epigastrio a través de la fascia y el peritoneo.Sujete el proceso xifoide con pinzas hemostáticas. Haga un corte vertical a través de la pared torácica al nivel de la línea medioclavicular en cada lado y levante la pared torácica anterior para revelar el contenido del mediastino. Sostenga la aorta de forma segura desde atrás con fórceps.Introduzca la aguja de la jeringa en el ápice del corazón. Perfundido con tres mililitros de HBSS a una velocidad de tres mililitros por minuto. Cortar la aorta y extraer el corazón.Lave el corazón en la placa de Petri con HBSS. Pese el corazón aislado y anote el peso en miligramos. Picar el corazón a temperatura ambiente en trozos pequeños con una cuchilla.Las piezas del corazón deben tener un tamaño aproximado de 1,5 milímetros. Mida la masa de tejido cardíaco usando una balanza y coloque 60 miligramos del corazón picado para ser digerido en un tubo de 15 mililitros en hielo con tres mililitros de HBSS. Repita este proceso para un ratón que no recibió la inyección de anticuerpos B220 y colóquelo en el tubo con tres mililitros de tejido de control de referencia marcado con HBSS.Agregue enzimas a cada tubo que contenga tejidos picados. Agregue 0.5 microlitros por miligramos de DNasa I, 0.5 microlitros por miligramo de colagenasa II y 0.2 microlitros por miligramo de hialuronidasa. Coloque la reacción de digestión en el agitador durante 30 minutos a 300 rotaciones por minuto.Los tubos se colocan en el agitador en un ángulo pequeño, unos 25 grados de inclinación. Agregue siete mililitros de HBSS a cada uno de los tubos de reacción de 15 mililitros y centrifugar a 250 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de decantar el sobrenadante, resuspender cada pellet en cinco mililitros de tampón de lisis ACK.Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de agregar 10 mililitros de PBS a cada tubo, mezcle y filtre en un tubo de 50 mililitros con un colador de 40 micrómetros. Aplaste cualquier residuo en el filtro con un émbolo de jeringa para asegurarse de que todo el material pase a través del filtro.Después de agregar PBS a través del filtro hasta que el volumen alcance los 25 mililitros por corazón, agregue 25 mililitros adicionales de PBS al tubo de tejido de control de referencia y divida el volumen en dos tubos diferentes. Etiquete uno de los tubos sin manchar y el otro vivo/muerto. Después de centrifugar a 250 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, decantar el sobrenadante y volver a suspender el tubo sin teñir en 100 microlitros de PBS y cada uno de los otros gránulos en 100 microlitros de la solución de tinción viva/muerta.Incubar en hielo durante 30 minutos en la oscuridad. Después de agregar 500 microlitros de tampón FACS a cada muestra, transfiérala a un tubo FACS a través de un filtro de 40 micrómetros. Después de rechazar los tubos FACS a 250 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón FACS.Agregue 50 microlitros de solución de bloqueo de FC a cada tubo, excepto los tubos sin teñir y vivos / muertos. Mezclar e incubar durante cinco minutos. Después de agregar 50 microlitros de solución de mezcla de anticuerpos a cada tubo, excepto los tubos sin teñir y vivos / muertos, incubar durante 30 minutos en la oscuridad, cubriendo el cubo de hielo con papel de aluminio.Al igual que con la mancha viva/muerta, lavar de nuevo con 500 microlitros de tampón FACS y resuspender en 300 a 500 microlitros de tampón FACS. Abra el software de control del instrumento. En la parte superior de la ventana, seleccione la pestaña Adquisición y haga clic en Nuevo.En la sección de biblioteca, en el campo Tipo para filtrar, escriba PE, PerCP-Cy5.5, violeta brillante 421, Alexa Fluor 700 y Zombie Aqua, seleccione el fluoro-4 y haga clic en Agregar después de escribir cada uno. A continuación, haga clic en Siguiente para pasar a la pestaña Grupos. Ahora haga clic en el símbolo con un tubo para agregar el corazón para el análisis.Haga clic en el grupo de referencia y aparecerá una ventana. En la columna de etiquetas fluorescentes, seleccione Zombie Aqua como etiqueta fluorescente, eliminando cualquier otra haciendo clic en el icono rojo de la papelera junto a cada una. A continuación, en el icono Tipo de control, seleccione Celdas.A continuación, haga clic en Guardar. Haga clic en Siguiente. A continuación, haga clic en la pestaña Marcadores.Se mostrará una tabla. Escriba el marcador de celda correspondiente en la primera fila de cada columna de fluoro-4 y presione Entrar. Haga clic en Siguiente dos veces para ir a la pestaña Adquisición.En Events To Record de las muestras experimentales, tipo 10 millones, y en el mismo campo para la línea del grupo de referencia, tipo 200, 000. Haga clic en Guardar y abrir. En la parte inferior izquierda, haga clic en Control de instrumentos.Ajuste el voltaje a FSC 50, SSC 175, SSC-B 175. Seleccione el control de adquisición. Para la opción de caudal, seleccione Alto en el menú desplegable.Vortex el tubo cardíaco sin teñir y colóquelo firmemente en el puerto de inyección de muestra. Asegúrese de que la flecha indicadora verde apunte a la muestra correcta. A continuación, haga clic en Grabar y espere hasta que se registren los eventos.Haga lo mismo para el tejido cardíaco manchado vivo/muerto. Seleccione el menú Desmezclar y establezca los controles. Seleccione la casilla de verificación Autofluorescencia como etiqueta fluorescente.Luego, haga clic en Siguiente para continuar con la pestaña Identificar poblaciones positivas / negativas. En esta pestaña, se mostrará un gráfico del área de dispersión hacia adelante frente al área de dispersión lateral. Haga clic y arrastre los puntos del polígono para seleccionar un área entre 1 y 4 millones en el eje del área de dispersión hacia adelante y entre 0,2 y 3 millones en el eje del área de dispersión lateral.En el siguiente gráfico a la derecha, V5-A se mostrará en el eje X. Mueva las puertas para seleccionar la mitad del pico en el extremo derecho como positivo y una región en el lado izquierdo de la gráfica como negativa. En la gráfica titulada Grupo de referencia-Sin teñir, seleccione una población en un rango similar.Para los no manchados, no se debe seleccionar ningún positivo/negativo. Haga clic en el botón Desmezclar en vivo. Ahora adquiera las muestras experimentales, haga un vórtice del tubo y colóquelo de forma segura en el SIP.Asegúrese de que la flecha indicadora verde apunte a la muestra correcta. A continuación, haga clic en Grabar en el panel Control de adquisición del software del citómetro y espere hasta que se registren los eventos. Seleccione la pestaña Hoja de cálculo predeterminada sin mezclar.Cree un gráfico FCS-A frente a SSC-A utilizando la herramienta de diagrama de puntos en la parte superior. Seleccione eventos superiores a 0,4 millones en el eje FSC-A y superiores a 0,8 millones en el eje SSC-A mediante la herramienta de selección de polígonos. Cree un nuevo trazado haciendo doble clic en la selección y, en este nuevo gráfico, haga clic con el botón derecho en la etiqueta del eje Y y seleccione mancha viva/muerta.Haga clic derecho en la etiqueta del eje X y seleccione Autofluorescencia A.Seleccione todos los eventos por debajo de 10 al quinto en el eje vivo/muerto. Estas son las células vivas. Haga doble clic en esta selección.En la nueva gráfica, seleccione PerCP-Cy5.5A para el eje X y SSC-A para el eje Y. Seleccione las poblaciones en el lado derecho del PerCP-Cy5.5A. Estas son las células inmunes.Haga doble clic en la selección. En la nueva gráfica, seleccione FSC-A para el eje X y la altura de dispersión hacia adelante para el eje Y. Seleccione los eventos que siguen una tendencia en la que el valor FSC-A y el valor SSC-A son los mismos.Esto selecciona celdas individuales y elimina dobletes. Haga doble clic en esta selección para ver una nueva gráfica en la población unicelular CD45 positiva. De la gráfica de población unicelular CD45 positiva, seleccione violeta brillante 421 en el eje X frente a SSC-A en el eje Y.Seleccione la población a la derecha en el eje 421 violeta brillante. Esta es la población de células B. Haga doble clic dos veces en esta población para crear dos nuevas gráficas con la población de células B.Configure la primera gráfica de células B con PEA en el eje X y violeta brillante 421A en el eje Y. La población de la derecha corresponde a las células B intervasculares, y la población de la izquierda representa las células B intersticiales. Seleccione ambos.Configure la segunda gráfica de células B con Alexa Fluor 700A en el eje X y SSC-A en el eje Y. La población de la izquierda corresponde a las células CD11b negativas, y los eventos a la derecha corresponden a las células CD11b positivas. Haga clic derecho en cada sección y, a continuación, haga clic en Propiedades de la puerta.Haga clic en Count and Parent (Count and Parent (Recuento y padre) para mostrar el número de eventos y porcentajes de las poblaciones principales. Registre el número de eventos y porcentajes para un análisis posterior de los datos. Después de la eliminación de dobletes en un corazón ingenuo no lesionado, se espera que alrededor del 20% de las células CD45 positivas sean células B CD19 positivas.De estas células, en promedio, el 5,5% se encuentran en el espacio intersticial. El 94,5% se encuentran en el espacio intravascular. De toda la población de células B encontradas en el corazón, solo alrededor del 1,6% corresponde a células B1 basadas en el marcador de superficie CD11b y el otro 98,4% corresponde a células B2.Al analizar las células B del miocardio a través de citometría de flujo, es crucial perfundir y picar el corazón correctamente siguiendo el protocolo. La filtración adecuada del corazón digerido también es esencial para maximizar la recuperación de las células inmunes.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Modelo murino de CD40-activación de las células B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Investigación

Inmunología e Infección

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Recombinante de producción retrovirales y la infección de células B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

El aislamiento, diferenciación y cuantificación de Human secretoras de anticuerpos células B de sangre: ELISpot como una lectura funcional de la inmunidad humoral

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Ensayo de citometría de flujo de base para la supervisión de funciones de las células NK

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

La evaluación de la función retiniana Microglial fagocítica<em&gt; En Vivo</em&gt; El uso de un ensayo basado en citometría de flujo

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Detección y enriquecimiento de Rare células B específicas de antígeno para el análisis del fenotipo y la función

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Un análisis de citotoxicidad basados en la citometría de flujo para la evaluación de la actividad de las células NK humanas

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Análisis de cortante inducida por el flujo de migración de las células B de zona Marginal de Murine In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Cuantificación de basados en citometría de flujo multicolor de las mitocondrias y los lisosomas en las células T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Medición de anticuerpos que inducen la fagocitosis adquirida naturalmente a los parásitos plasmodium falciparum mediante un ensayo basado en citometría de flujo

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...