Name: flow cytometry-based quantification and analysis of myocardial b-cells
Uploaded: 2022-08-17T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells at JoVE.com

Denna studie finansierades av NHLBI-bidragen 5K08HLO145108-03 och 1R01HL160716-01 som tilldelades Luigi Adamo.
Aurora Flow Cytometer som användes för att utveckla denna studie finansierades av NIH Grant S10OD026859. Vi erkänner stödet från JHU Ross Flow Cytometry Core.

Alla experiment som beskrivs i detta manuskript utfördes med godkännande av IACUC vid Johns Hopkins University School of Medicine.
1. Förberedelser
<ol><li>Förbered FACS-bufferten enligt beskrivningen i tabell 1.</li>
	<li>Se till att det finns tillräckligt med CO2 för att avliva djuren.</li>
	<li>Förbered dissektionsutrymmet (placera bänkdynan och placera tejpen och dissektionsverktygen i närheten).</li>
	<li>Märk 15 ml rören, lägg 3 ...

<ol>
	<li>Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+B+lymphocytes+in+cardiovascular+disease.">The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease.</a> Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).</li><li>Gowans, J. L., Knight, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+route+of+re-circulation+of+lymphocytes+in+the+rat.">The route of re-circulation of lymphocytes in the rat.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).</li><li>Kunkel, E. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+the+tissue-specific+migration+of+lymphocytes.">Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes.</a> Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+controlling+homeostatic+recirculation+and+tissue-specific+trafficking+of+lymphocytes.">Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).</li><li>Rocha-Resende, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+myocardial+B+cells+mirror+changes+in+B+cells+associated+with+different+organs.">Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs.</a> JCI Insight. 5 (16), (2020).</li><li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+B+cells+are+a+subset+of+circulating+lymphocytes+with+delayed+transit+through+the+heart.">Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart.</a> JCI Insight. 5 (3), 139377 (2020).</li><li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+subsets+of+cardiac+B+lymphocytes+improves+cardiac+function+after+acute+injury.">Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury.</a> JCI Insight. 3 (11), (2018).</li><li>Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+modulate+the+expression+of+MHC-II+on+cardiac+CCR2(-)+macrophages.">B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).</li><li>Zouggari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+trigger+monocyte+mobilization+and+impair+heart+function+after+acute+myocardial+infarction.">B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).</li><li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-10-producing+B+cells+are+enriched+in+murine+pericardial+adipose+tissues+and+ameliorate+the+outcome+of+acute+myocardial+infarction.">IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).</li><li>Heinrichs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+mobilizes+a+distinct+B-cell+subset+through+a+CXCL13-CXCR5-dependent+mechanism.">The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism.</a> Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splenic+marginal+zone+B+lymphocytes+regulate+cardiac+remodeling+after+acute+myocardial+infarction+in+mice.">Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice.</a> Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).</li><li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+dynamics+of+cardiac+immune+cell+accumulation+following+acute+myocardial+infarction.">Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).</li><li>Iwata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+against+the+second+extracellular+loop+of+beta(1)-adrenergic+receptors+induces+beta-adrenergic+receptor+desensitization+and+myocardial+hypertrophy+in+vivo.">Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo.</a> Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).</li><li>Jahns, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+a+beta+1-adrenergic+receptor-directed+autoimmune+attack+as+a+cause+of+idiopathic+dilated+cardiomyopathy.">Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).</li><li>Christ, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+against+the+beta1+adrenoceptor+from+patients+with+dilated+cardiomyopathy+prolong+action+potential+duration+and+enhance+contractility+in+isolated+cardiomyocytes.">Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).</li><li>Jane-wit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenergic+receptor+autoantibodies+mediate+dilated+cardiomyopathy+by+agonistically+inducing+cardiomyocyte+apoptosis.">Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis.</a> Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).</li><li>Ludwig, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+autoantibody-induced+pathology.">Mechanisms of autoantibody-induced pathology.</a> Frontiers in Immunology. 8, 603 (2017).</li><li>Haudek, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor+engagement+mediates+differentiation+of+cardiac+fibroblast+precursor+cells.">Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).</li><li>Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc(gamma)+receptors+IIa+on+cardiomyocytes+and+their+potential+functional+relevance+in+dilated+cardiomyopathy.">Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy.</a> Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+natural+IgM+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury.">The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+specific+self-reactive+IgM+antibody+that+initiates+intestinal+ischemia/reperfusion+injury.">Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).</li><li>Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+ADP-ATP+carrier--an+autoantigen+in+myocarditis+and+dilated+cardiomyopathy--impair+cardiac+function.">Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function.</a> Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).</li><li>Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+epitope+spreading+is+a+critical+step+for+the+switch+from+C-protein-induced+myocarditis+to+dilated+cardiomyopathy.">B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy.</a> The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).</li><li>Caforio, A. L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+state+of+knowledge+on+aetiology,+diagnosis,+management,+and+therapy+of+myocarditis:+a+position+statement+of+the+European+Society+of+Cardiology+Working+Group+on+Myocardial+and+Pericardial+Diseases.">Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases.</a> European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues.">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Horckmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericardial+adipose+tissue+regulates+granulopoiesis,+fibrosis+and+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction.</a> Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Bajpai, G., Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+macrophage+subsets+and+stromal+cells+from+human+and+mouse+myocardial+specimens.">Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60015 (2019).</li><li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes.">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li><li>Coffman, R. L., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B220:+a+B+cell-specific+member+of+th+T200+glycoprotein+family.">B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family.</a> Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).</li><li>Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+B+cell+development+in+the+fetus+and+adult.">B-1 B cell development in the fetus and adult.</a> Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).</li><li>Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+B+cells+in+cardiomyopathy+and+heart+failure.">The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure.</a> Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).</li><li>Zhao, T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rituximab+in+patients+with+acute+ST-elevation+myocardial+infarction:+an+experimental+medicine+safety+study.">Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).</li><li>Kushnir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B2+but+not+B1+cells+can+contribute+to+CD4++T-cell-mediated+clearance+of+rotavirus+in+SCID+mice.">B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice.</a> Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).</li></ol>

En växande mängd bevis tyder på att B-celler spelar en viktig roll i samband med myokardiell fysiologi och myokardiell ombyggnad / anpassning till skada 7,8,9,10,11,12,13,36. Flödescytometri är ett utmärkt verktyg för att studera immuncellpopulatione...

B-lymfocyter är högspecialiserade immunceller som spelar en viktig roll i både adaptiva och medfödda immunsvar1. Det finns två huvudpopulationer av B-celler: en mindre population av B1-celler som mestadels produceras under embryonalt liv och en övervägande population av B2-celler som produceras i vuxenlivet i benmärgen1. Efter mognad i benmärgen migrerar B-celler till primära och sekundära lymfoida organ. Därifrån återcirkulerar de kontinuerligt mellan lymfoida organ som färdas genom blodkärl och lymfkärl2. B-celler uttrycker specifika antikroppar på deras yta, som fungerar som receptorer. När B-celler stöter på ett antigen som binder till deras receptor kan en aktiverande signal utlösas. Aktiverade B-celler migrerar antingen till vävnaden där antigenet hittades eller går tillbaka till benmärgen där de kan mogna till antikroppsproducerande plasmaceller 3,4.
Nyligen har det uppskattats att hjärtat har en stor population av B-celler. Studier på gnagare har visat att B-celler koloniserar hjärtat tidigt under embryonal utveckling5, och att myokardassocierade B-celler mestadels är intravaskulära, naiva B2-celler vidhäftade till endotelet6,7, med en liten andel B1-celler 7. Det finns fortfarande många osäkerhetsområden, men tillgängliga data indikerar att B-celler spelar en viktig roll både i det naiva hjärtat och i samband med myokardiell anpassning till skada.
Studier i det naiva murina hjärtat har visat att vid baslinjen är myokardiella B-celler mestadels belägna i det intravaskulära utrymmet, vidhäftade till endotelet (>95% av murina hjärt-B-celler befanns vara belägna i det intravaskulära utrymmet). Dessa B-celler visade sig ha genuttrycksmönster som skiljer sig från de hos cirkulerande B-celler isolerade från det perifera blodet. Analys av naiva hjärtan från B-cellsbristdjur och syngena kontroller visade att djur som saknade B-celler hade mindre hjärtan och högre utkastningsfraktion6. Alla dessa bevis tyder på att B-celler kan modulera myokardiell tillväxt och / eller myokardiell funktion, och att inte bara interstitiella utan också intravaskulära B-celler kan vara ansvariga för sådana observationer. B-celler visade sig också modulera fenotypen för myokardiella makrofager8.
Flera studier har visat att B-celler spelar en viktig roll i samband med myokardiell anpassning till skada 8,9,10,11,12,13. B-celler ackumuleras övergående i det skadade hjärtat, sannolikt genom en CXCL13-CXCR5-beroende mekanism11,13. Därifrån främjar B-celler negativ hjärtombyggnad genom flera mekanismer som inkluderar cytokinmedierad monocytrekrytering 9,12. Dessutom kan B-celler producera antikroppar mot hjärtproteiner som kan främja förlängningen av hjärtskador och negativ hjärtombyggnad genom flera mekanismer 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B-celler kan också utöva skyddande effekter på det skadade hjärtat genom utsöndring av IL-1010.
I takt med att antalet grupper som undersöker B-cellernas roll i det naiva och skadade hjärtat växer blir det allt viktigare att definiera gemensamma protokoll för att korrekt kvantifiera och bedöma myokardiella B-celler och därmed undvika inkonsekvenser som redan har börjat dyka upp i litteraturen. Hittills har B-celler faktiskt både rapporterats vara en av de vanligaste immuncellerna i gnagarhjärtat7 och vara närvarande vid en markant lägre prevalens än myeloida celler26,27, eller vara ganska sällsynta 28. På samma sätt har flera grupper beskrivit att antalet myokardiella B-celler ökar efter akut ischemisk hjärtskada 7,9,13, men en grupp rapporterade inga förändringar i antalet B-celler i det skadade myokardiet29. Studier på hjärtimmunceller ger sällan detaljer om perfusionsförhållanden och det finns ingen överenskommelse om matsmältningsförhållandena. Eftersom en stor andel av B-cellerna i gnagarhjärtat är intravaskulära och extraktionen av immunceller från hjärtmuskeln är starkt beroende av den matsmältningsmetod som används, kan skillnaderna som rapporteras i litteraturen vara resultatet av skillnader i organperfusion och vävnadssmältning.
Här presenteras en detaljerad metod för flödescytometribaserad kvantifiering av murina myokardiella B-celler som maximerar utbytet av B-cellåtervinning genom att optimera perfusions- och matsmältningsförhållandena och möjliggör diskriminering av intravaskulära kontra extravaskulära myokardiella B-celler6. Detta protokoll är en anpassning och optimering av andra liknande protokoll som skiljer mellan intravaskulära och interstitiella immunceller 28,30,31.
I detta protokoll standardiserar vi myokardiell perfusion för att eliminera B-celler som flyter i det intravaskulära utrymmet utan att ta bort biologiskt relevanta B-celler som följs till det mikrovaskulära endotelet. Dessutom, med utgångspunkt i tidigare protokoll som har beskrivit användningen av intravenös injektion av antikroppar för att skilja intravaskulära från interstitiella immunceller32, och dra nytta av det faktum att B-celler uttrycker ytmarkören B22033, visar vi hur man skiljer intravaskulära kontra extravaskulära myokardiella B-celler genom intravaskulär injektion av en B220-specifik antikropp omedelbart före djuroffret och hjärtperfusionen. Detta protokoll är relevant för forskningen från alla forskare som är intresserade av att inkludera analysen av myokardiella B-celler i det naiva och skadade hjärtat. Den utbredda implementeringen av detta protokoll kommer att minska inkonsekvenser mellan forskargrupper, möjliggöra analys av förändringar i de intravaskulära och extravaskulära myokardiella B-cellpoolerna och därmed stärka utvecklingen av upptäckter inom hjärtimmunologi.
Sammanfattningsvis representerar protokollet ett optimerat arbetsflöde för att kvantifiera och analysera myokardiella B-celler via flödescytometri och samtidigt skilja mellan celler som ligger i det extravaskulära utrymmet och det intravaskulära utrymmet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody</td>
			<td>101222</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100 &#181;g 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 &#181;m, Blue</td>
			<td>QBIAP303</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube</td>
			<td>1605-0000</td>
			<td>SealRite, USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Injection, USP</td>
			<td>114-055-101</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>0.90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>SealRite, USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11213810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11267810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free</td>
			<td>430052</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Way Stop Valve, Polycarbonate</td>
			<td>SVPT951</td>
			<td>ECT Manufacturing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td>T48402</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11208810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Way Stop Valve, Polycarbonate</td>
			<td>SVPT953</td>
			<td>ECT Manufacturing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style</td>
			<td>352054</td>
			<td>Falcon, a Corning Brand</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free</td>
			<td>430290</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63</td>
			<td>5810759005</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62</td>
			<td>22638289</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 &#8211; 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62</td>
			<td>22638246</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil 12 in x 75&#39; Roll .0007</td>
			<td>UPC 109153</td>
			<td>Reynolds Wrap</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Induction Chamber - Mouse</td>
			<td>RWD-AICMV-100</td>
			<td>Conduct Science</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL</td>
			<td>309626</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2&#34; 100-Pack</td>
			<td>CMD 2613</td>
			<td>Brandzig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody</td>
			<td>115537</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 &#181;m, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile</td>
			<td>T9009</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Dioxide USP E CGA 940&#160;</td>
			<td>CD USPE</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL</td>
			<td>UX-34502-46</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 2</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector brass chrome plated 1/4&#34; female NPT x 1/4&#34; barb</td>
			<td>Y992611-AG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytek Aurora Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td>Cytek Biosciences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP</td>
			<td>M-08-12</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I - 40,000 U</td>
			<td>D4527</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypet&#160;3 - Electronic Pipette Controller</td>
			<td>4430000018</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Balance, AX223/E</td>
			<td>30100606</td>
			<td>Ohaus Corp.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes</td>
			<td></td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.1</td>
			<td></td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100)</td>
			<td>Z740287</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]</td>
			<td>14025076</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>H3506</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostats, Straight</td>
			<td>13018-14</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL</td>
			<td>302831</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940</td>
			<td>M1-940-PG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McKesson Underpads, Moderate</td>
			<td>4033-CS150</td>
			<td>McKesson</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navigator Multi-Purpose Portable Balance</td>
			<td>NV2201</td>
			<td>Ohaus Corp.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]</td>
			<td>10010023</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody</td>
			<td>103208</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>200 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>103132</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100 &#181;g 500 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene</td>
			<td>FB0875711YZ</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02</td>
			<td>M08-1</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator</td>
			<td>LED-6W</td>
			<td>AmScope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm)</td>
			<td>305122</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO)</td>
			<td>553141</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company Biosciences</td>
			<td>0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 4.1.1</td>
			<td></td>
			<td>The R Foundation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>9501250000</td>
			<td>Accutec Blades Inc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet</td>
			<td>Y12244A320-AG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets</td>
			<td>Rotor A-4-62</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma label tape</td>
			<td>L8394</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroFlo 3.0.0</td>
			<td></td>
			<td>Cytek Biosciences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8&#34; Hose Barb; 1/EA</td>
			<td>MTLL230-6005</td>
			<td>Spex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8&#34; ID x 3/16&#34; OD x 1/32&#34; Wall x 50&#39; Long</td>
			<td>CG-730-003</td>
			<td>Excelon Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe PP/PE without needle, 3 mL</td>
			<td>Z683566</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>55-1199 (95-240)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500</td>
			<td>9371W13</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rack, 12&#160;positions, 6 for 5.0&#160;mL and 15&#160;mL tubes and 6 for 25&#160;mL and 50&#160;mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable</td>
			<td>30119835</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rack, 12&#160;positions, for 5.0&#160;mL and 15&#160;mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable</td>
			<td>30119827</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. &#215; O.D. 1/4 in. &#215; 3/8 in.</td>
			<td>T8913 (Millipore Sigma)</td>
			<td>Tygon, Saint-Gobain</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Scientific Industries, Inc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips</td>
			<td>89259-946</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4&#189;&#34;</td>
			<td>82027-578</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I</td>
			<td>12620-946</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>423102</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry-based quantification and analysis of myocardial b-cells

En växande mängd bevis visar att B-lymfocyter spelar en viktig roll i samband med myokardiell fysiologi och myokardiell anpassning till skada. Litteraturen rapporterar dock kontrasterande data om förekomsten av myokardiella B-celler. B-celler har rapporterats vara både bland de vanligaste immuncellerna i gnagarhjärtat eller vara närvarande, men med en markant lägre prevalens än myeloida celler, eller för att vara ganska sällsynta. På samma sätt har flera grupper beskrivit att antalet myokardiella B-celler ökar efter akut ischemisk hjärtskada, men en grupp rapporterade inga förändringar i antalet B-celler i det skadade myokardiet. Implementering av en delad, reproducerbar metod för att bedöma förekomsten av myokardiella B-celler är avgörande för att harmonisera observationer från olika forskargrupper och därmed främja utvecklingen av studien av B-cells myokardiella interaktioner. Baserat på vår erfarenhet härrör de till synes kontrasterande observationerna som rapporterats i litteraturen sannolikt från det faktum att murina myokardiella B-celler mestadels är intravaskulära och kopplade till det mikrovaskulära endotelet. Därför är antalet B-celler som återvinns från ett murint hjärta utsökt känsligt för de perfusionsförhållanden som används för att rengöra organet och för den metod för matsmältning som används. Här rapporterar vi ett optimerat protokoll som redovisar dessa två kritiska variabler på ett specifikt sätt. Detta protokoll möjliggör reproducerbar, flödescytometribaserad analys av antalet murina myokardiella B-celler och gör det möjligt för forskare att skilja extravaskulära kontra intravaskulära myokardiella B-celler.

När förvärvet är klart och alla händelser har samlats in bör data analyseras enligt standardflödescytometripraxis. Analysens fokus varierar beroende på det individuella målet för varje experiment. I detta fall eftersträvades kvantifiering av intravaskulära och extravaskulära B-celler, och det uttrycktes som antalet celler per mg vävnad.
Vid användning av en spektral cytometer rekommenderas att analysen startas med en initial grind för att avlägsna skräp med storlekar som inte...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells at JoVE.com

Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells

Här rapporterar vi ett protokoll för kvantifiering och differentiering av myokardiella B-lymfocyter baserat på deras placering i det intravaskulära eller endoteliala utrymmet med hjälp av flödescytometri.

Flödescytometribaserad kvantifiering och analys av myokardiella B-celler

A growing body of evidence shows that B-lymphocytes play an important role in the context of myocardial physiology and myocardial adaptation to injury. ...

Litteraturen rapporterar kontrasterande data om förekomsten av myokardiella B-celler. Detta härrör sannolikt från variationer i perfusions- och matsmältningstekniker. Vårt protokoll möjliggör reproducerbar flödescytometribaserad analys på myokardiella B-celler.Denna teknik maximerar återhämtningsutbytet av B-celler och minskar variationen i flödescytometriantal bland B-celler och andra populationer från hjärtprover. Denna optimerade matsmältnings- och isoleringsmetod kan enkelt modifieras för att implementera en utökad antikroppspanel för att studera olika immuncelltyper i hjärtat. Protokollet kan också tillämpas på andra organ, såsom lunga eller lever, för att studera B-celler associerade med dessa organ.Börja med att väga en 12 veckor gammal manlig mus. Ladda en 310-cc insulinspruta med 100 mikroliter av B220-antikroppslösningen. Injicera den utspädda B220-antikroppen genom retroorbital injektion och fortsätt omedelbart till organskörd och perfusion.Efter eutanasi, håll musens hud med pincett vid det epigastriska området. Gör en två millimeters öppning i huden med sax och använd tången för att skala bort huden för att avslöja fasciaskiktet. Skär vid epigastrium genom fascia och bukhinna.Kläm fast xiphoidprocessen med hemostatiska pincett. Gör ett vertikalt snitt genom bröstväggen i nivå med den midklavikulära linjen på varje sida och lyft den främre bröstväggen för att avslöja mediastinuminnehållet. Håll aortan ordentligt bakifrån med pincett.Inför sprutnålen i hjärtats topp. Perfuserad med tre milliliter HBSS med en hastighet av tre milliliter per minut. Skär aortan och ta bort hjärtat.Tvätta hjärtat i petriskålen med HBSS. Väg det isolerade hjärtat och notera vikten i milligram. Hacka hjärtat vid rumstemperatur i små bitar med ett blad.Hjärtstyckena ska vara cirka 1,5 millimeter stora. Mät massan av hjärtvävnad med en balans och placera 60 milligram av det malet hjärtat som ska smältas i ett 15-milliliter rör på is med tre milliliter HBSS. Upprepa denna process för en mus som inte fick B220-antikroppsinjektionen och placera den i röret med tre milliliter HBSS-märkt referenskontrollvävnad.Tillsätt enzymer till varje rör som innehåller malet vävnad. Tillsätt 0,5 mikroliter per milligram DNas I, en 0,5 mikroliter per milligram kollagenas II och 0,2 mikroliter per milligram hyaluronidas. Placera matsmältningsreaktionen i skakaren i 30 minuter vid 300 varv per minut.Rören placeras i skakaren i en liten vinkel, cirka 25 graders lutning. Tillsätt sju milliliter HBSS till vart och ett av 15-milliliters reaktionsrören och centrifugera vid 250 G i fem minuter vid fyra grader Celsius. Efter dekantering av supernatanten, återsuspendera varje pellet i fem milliliter ACK-lysbuffert.Inkubera i fem minuter vid rumstemperatur. Efter tillsats av 10 ml PBS till varje rör, blanda och filtrera i ett 50-milliliter rör med en 40-mikrometer sil. Krossa eventuellt skräp på filtret med en sprutkolv för att säkerställa att allt material passerar genom filtret.Efter att ha tillsatt PBS genom filtret tills volymen når 25 ml per hjärta, tillsätt ytterligare 25 ml PBS till referenskontrollvävnadsröret och dela volymen i två olika rör. Märk ett av rören ofärgat och det andra levande/dött. Efter centrifugering vid 250 G i fem minuter vid fyra grader Celsius, dekantera supernatanten och återsuspendera det ostoppade röret i 100 mikroliter PBS och var och en av de andra pelletsen i 100 mikroliter av den levande / döda fläcklösningen.Inkubera på is i 30 minuter i mörkret. Efter att ha tillsatt 500 mikroliter FACS-buffert till varje prov, överför det till ett FACS-rör genom ett 40-mikrometerfilter. Efter att ha vägrat FACS-rören vid 250 G i fem minuter vid fyra grader Celsius och kasserat supernatanten, återsuspendera pelleten i 500 mikroliter FACS-buffert.Tillsätt 50 mikroliter FC-blockeringslösning till varje rör, förutom de ofärgade och levande / döda rören. Blanda och inkubera i fem minuter. Efter tillsats av 50 mikroliter antikroppsblandningslösning till varje rör, förutom de ofärgade och levande / döda rören, inkubera i 30 minuter i mörkret och täck ishinken med aluminiumfolie.Som med den levande / döda fläcken, tvätta igen med 500 mikroliter FACS-buffert och återsuspendera i 300 till 500 mikroliter FACS-buffert. Öppna instrumentkontrollprogramvaran. Högst upp i fönstret väljer du fliken Förvärv och klickar på Ny.I biblioteksavsnittet, i fältet Typ för att filtrera, skriv PE, PerCP-Cy5.5, lysande violett 421, Alexa Fluor 700 och Zombie Aqua, välj fluor-4 och klicka på Lägg till efter att ha skrivit varje. Klicka sedan på Nästa för att gå vidare till fliken Grupper. Klicka nu på symbolen med ett rör för att lägga till hjärtat för analysen.Klicka på referensgruppen så visas ett fönster. I kolumnen fluorescerande taggar väljer du Zombie Aqua som fluorescerande tagg och tar bort alla andra genom att klicka på den röda papperskorgen bredvid varje. Välj sedan Celler på ikonen Kontrolltyp.Klicka sedan på Spara. Klicka på Nästa. Klicka sedan på fliken Markörer.En tabell visas. Skriv motsvarande cellmarkör på den första raden i varje fluoro-4-kolumn och tryck på Retur. Klicka på Nästa två gånger för att gå till fliken Förvärv.I Händelser att registrera experimentella prover skriver du 10 miljoner och i samma fält för referensgruppslinjen skriver du 200 000. Klicka på Spara och öppna. Klicka på Instrumentkontroll längst ned till vänster.Ställ in spänning på FSC 50, SSC 175, SSC-B 175. Välj förvärvskontrollen. För alternativet flödeshastighet väljer du Hög i rullgardinsmenyn.Vörda det ostoppade hjärtröret och placera det ordentligt på provinjektionsporten. Se till att den gröna indikatorpilen pekar på rätt prov. Klicka sedan på Spela in och vänta tills händelserna har spelats in.Gör samma sak för den levande/döda färgade hjärtvävnaden. Välj menyn Unmix och ställ in kontrollerna. Markera kryssrutan för Autofluorescens som en fluorescerande tagg.Klicka sedan på Nästa för att gå vidare till fliken Identifiera positiva/negativa populationer. På den här fliken visas ett diagram över det framåtriktade spridningsområdet jämfört med sidospridningsområdet. Klicka och dra polygonens punkter för att välja ett område mellan 1 och 4 miljoner på den främre spridningsområdesaxeln och mellan 0,2 och 3 miljoner på sidospridningsområdets axel.I nästa diagram till höger visas V5-A på X-axeln. Flytta grindarna för att välja hälften av toppen längst till höger som positiv och en region på vänster sida av diagrammet som negativ. I diagrammet med titeln Referensgrupp-Ej inbäddad väljer du en population i ett liknande intervall.För de ofärgade måste ingen positiv/negativ väljas. Klicka på knappen Live Unmixing (Ta bort uppspelning). Skaffa nu experimentproverna, virvla röret och placera det ordentligt på SIP.Se till att den gröna indikatorpilen pekar på rätt prov. Klicka sedan på Spela in på kontrollpanelen för förvärv i cytometerprogramvaran och vänta tills händelserna har spelats in. Välj fliken Standardiserat oblandat kalkylblad.Skapa ett FCS-A jämfört med SSC-A-diagram med hjälp av punktdiagramverktyget ovanpå. Välj händelser som är högre än 0,4 miljoner på FSC-A-axeln och högre än 0,8 miljoner på SSC-A-axeln med hjälp av polygonmarkeringsverktyget. Skapa ett nytt diagram genom att dubbelklicka på markeringen, och i det här nya diagrammet högerklickar du på Y-axelns etikett och väljer levande / död fläck.Högerklicka på X-axeletiketten och välj Autofluorescens A.Välj alla händelser under 10 till den femte på den levande / döda axeln. Dessa är de levande cellerna. Dubbelklicka i det här valet.I det nya diagrammet väljer du PerCP-Cy5.5A för X-axeln och SSC-A för Y-axeln. Välj populationerna till höger om PerCP-Cy5.5A. Dessa är immuncellerna.Dubbelklicka på markeringen. På det nya diagrammet väljer du FSC-A för X-axeln och den främre punkthöjden för Y-axeln. Välj de händelser som följer en trend där FSC-A-värdet och SSC-A-värdet är desamma.Detta markerar enstaka celler och eliminerar dubbletter. Dubbelklicka på det här valet för att visa ett nytt diagram i den CD45-positiva encellspopulationen. Från det CD45-positiva encellspopulationsdiagrammet väljer du lysande violett 421 på X-axeln kontra SSC-A på Y-axeln.Välj populationen till höger på den lysande violetta 421-axeln. Detta är B-cellpopulationen. Dubbelklicka två gånger i den här populationen för att skapa två nya tomter med B-cellpopulationen.Ställ in det första B-celldiagrammet med PEA på X-axeln och lysande violett 421A på Y-axeln. Populationen till höger motsvarar de intervaskulära B-cellerna, och populationen till vänster representerar de interstitiella B-cellerna. Välj båda.Ställ in den andra B-cellplottet med Alexa Fluor 700A på X-axeln och SSC-A på Y-axeln. Populationen till vänster motsvarar de CD11b-negativa cellerna, och händelserna till höger motsvarar de CD11b-positiva cellerna. Högerklicka på varje avsnitt och klicka sedan på Gate-egenskaper.Klicka på Antal och förälder för att visa antalet händelser och procentandelar av de överordnade populationerna. Registrera antalet händelser och procentsatser för ytterligare dataanalys. Efter avlägsnandet av dubbletter i ett naivt oskadat hjärta förväntas det att cirka 20% av CD45-positiva celler kommer att vara CD19-positiva B-celler.Av dessa celler är i genomsnitt 5, 5% belägna i det interstitiella utrymmet. 94,5% är i det intravaskulära utrymmet. Från hela B-cellpopulationen som finns i hjärtat motsvarar endast cirka 1,6% B1-celler baserat på ytmarkören CD11b och de andra 98,4% motsvarar B2-celler.Vid analys av myokardiella B-celler via flödescytometri är det viktigt att perfusera och hacka hjärtat ordentligt enligt protokollet. Korrekt filtrering av det smälta hjärtat är också viktigt för att maximera återhämtningen av immunceller.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Murina Modell av CD40-aktivering av B-celler

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Isoleringen, differentiering och kvantifiering av human antikropp-utsöndrande B-celler från blod: ELISpot som en funktionell Avläsning av humoral immunitet

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Flödescytometri-baserad analys för övervakning av NK cellfunktioner

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Bedöma Retinal mikrogliaceller fagocytos<em&gt; In Vivo</em&gt; Med hjälp av en flödescytometri-baserad analys

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Detection och anrikning av sällsynta antigenspecifika B-celler för analys av Fenotyp och funktion

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Ett flöde flödescytometri-baserade cytotoxicitet analys för bedömning av människans NK cellsaktivitet

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

En enkel flödescytometri baserat test för att bestämma In Vitro antikropp beroende förbättring av denguefeber Virus använder Zika Virus konvalescent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Analys av skjuvning flöde-inducerad Migration av murin marginella zon B-celler In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Multicolor flöde flödescytometri-baserade kvantifiering av mitokondrier och lysosomer i T-celler

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Beredning av hela benmärgen för Masscytometri analys av neutrofila-Lineage celler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...