Name: flow cytometry-based quantification and analysis of myocardial b-cells
Uploaded: 2022-08-17T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells at JoVE.com

Bu çalışma, Luigi Adamo'ya verilen NHLBI hibeleri 5K08HLO145108-03 ve 1R01HL160716-01 tarafından finanse edilmiştir.
Bu çalışmayı geliştirmek için kullanılan Aurora Akış Sitometresi, NIH Grant S10OD026859 tarafından finanse edildi. JHU Ross Flow Cytometry Core'un desteğini kabul ediyoruz.

Bu makalede açıklanan tüm deneyler, Johns Hopkins Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki IACUC'nin onayı ile gerçekleştirilmiştir.
1. Hazırlıklar
<ol><li>FACS Arabelleğini Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın.</li>
	<li>Hayvanları ötenazi yapmak için yeterli CO2 olduğundan emin olun.</li>
	<li>Diseksiyon alanını hazırlayın (tezgah pedini yerleştirin ve bant ve diseksiyon aletlerini yakına yerleştirin).</li>
	<li>15 mL t?...

<ol>
	<li>Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+B+lymphocytes+in+cardiovascular+disease.">The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease.</a> Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).</li><li>Gowans, J. L., Knight, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+route+of+re-circulation+of+lymphocytes+in+the+rat.">The route of re-circulation of lymphocytes in the rat.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).</li><li>Kunkel, E. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+the+tissue-specific+migration+of+lymphocytes.">Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes.</a> Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).</li><li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+controlling+homeostatic+recirculation+and+tissue-specific+trafficking+of+lymphocytes.">Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).</li><li>Rocha-Resende, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+myocardial+B+cells+mirror+changes+in+B+cells+associated+with+different+organs.">Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs.</a> JCI Insight. 5 (16), (2020).</li><li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+B+cells+are+a+subset+of+circulating+lymphocytes+with+delayed+transit+through+the+heart.">Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart.</a> JCI Insight. 5 (3), 139377 (2020).</li><li>Adamo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+subsets+of+cardiac+B+lymphocytes+improves+cardiac+function+after+acute+injury.">Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury.</a> JCI Insight. 3 (11), (2018).</li><li>Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+modulate+the+expression+of+MHC-II+on+cardiac+CCR2(-)+macrophages.">B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).</li><li>Zouggari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+trigger+monocyte+mobilization+and+impair+heart+function+after+acute+myocardial+infarction.">B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).</li><li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-10-producing+B+cells+are+enriched+in+murine+pericardial+adipose+tissues+and+ameliorate+the+outcome+of+acute+myocardial+infarction.">IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).</li><li>Heinrichs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+mobilizes+a+distinct+B-cell+subset+through+a+CXCL13-CXCR5-dependent+mechanism.">The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism.</a> Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splenic+marginal+zone+B+lymphocytes+regulate+cardiac+remodeling+after+acute+myocardial+infarction+in+mice.">Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice.</a> Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).</li><li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+dynamics+of+cardiac+immune+cell+accumulation+following+acute+myocardial+infarction.">Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).</li><li>Iwata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+against+the+second+extracellular+loop+of+beta(1)-adrenergic+receptors+induces+beta-adrenergic+receptor+desensitization+and+myocardial+hypertrophy+in+vivo.">Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo.</a> Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).</li><li>Jahns, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+a+beta+1-adrenergic+receptor-directed+autoimmune+attack+as+a+cause+of+idiopathic+dilated+cardiomyopathy.">Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).</li><li>Christ, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+against+the+beta1+adrenoceptor+from+patients+with+dilated+cardiomyopathy+prolong+action+potential+duration+and+enhance+contractility+in+isolated+cardiomyocytes.">Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).</li><li>Jane-wit, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenergic+receptor+autoantibodies+mediate+dilated+cardiomyopathy+by+agonistically+inducing+cardiomyocyte+apoptosis.">Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis.</a> Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).</li><li>Ludwig, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+autoantibody-induced+pathology.">Mechanisms of autoantibody-induced pathology.</a> Frontiers in Immunology. 8, 603 (2017).</li><li>Haudek, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc+receptor+engagement+mediates+differentiation+of+cardiac+fibroblast+precursor+cells.">Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).</li><li>Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc(gamma)+receptors+IIa+on+cardiomyocytes+and+their+potential+functional+relevance+in+dilated+cardiomyopathy.">Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy.</a> Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+natural+IgM+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury.">The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+specific+self-reactive+IgM+antibody+that+initiates+intestinal+ischemia/reperfusion+injury.">Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).</li><li>Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+ADP-ATP+carrier--an+autoantigen+in+myocarditis+and+dilated+cardiomyopathy--impair+cardiac+function.">Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function.</a> Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).</li><li>Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+epitope+spreading+is+a+critical+step+for+the+switch+from+C-protein-induced+myocarditis+to+dilated+cardiomyopathy.">B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy.</a> The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).</li><li>Caforio, A. L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+state+of+knowledge+on+aetiology,+diagnosis,+management,+and+therapy+of+myocarditis:+a+position+statement+of+the+European+Society+of+Cardiology+Working+Group+on+Myocardial+and+Pericardial+Diseases.">Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases.</a> European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+cardiac+cellular+composition.">Revisiting cardiac cellular composition.</a> Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li><li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues.">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Horckmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericardial+adipose+tissue+regulates+granulopoiesis,+fibrosis+and+cardiac+function+after+myocardial+infarction.">Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction.</a> Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Bajpai, G., Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+macrophage+subsets+and+stromal+cells+from+human+and+mouse+myocardial+specimens.">Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e60015 (2019).</li><li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+staining+for+discrimination+of+vascular+and+tissue+leukocytes.">Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes.</a> Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).</li><li>Coffman, R. L., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B220:+a+B+cell-specific+member+of+th+T200+glycoprotein+family.">B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family.</a> Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).</li><li>Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+B+cell+development+in+the+fetus+and+adult.">B-1 B cell development in the fetus and adult.</a> Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).</li><li>Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+B+cells+in+cardiomyopathy+and+heart+failure.">The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure.</a> Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).</li><li>Zhao, T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rituximab+in+patients+with+acute+ST-elevation+myocardial+infarction:+an+experimental+medicine+safety+study.">Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).</li><li>Kushnir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B2+but+not+B1+cells+can+contribute+to+CD4++T-cell-mediated+clearance+of+rotavirus+in+SCID+mice.">B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice.</a> Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).</li></ol>

Giderek artan sayıda kanıt, B hücrelerinin miyokard fizyolojisi ve miyokard yeniden şekillenmesi / yaralanmaya adaptasyonu bağlamında önemli bir rol oynadığını göstermektedir 7,8,9,10,11,12,13,36. Akış sitometrisi, herhangi bir dokudaki bağı...

B-lenfositler, hem adaptif hem de doğuştan gelen immün yanıtlarda önemli bir rol oynayan oldukça uzmanlaşmış bağışıklık hücreleridir1. İki ana B hücresi popülasyonu vardır: çoğunlukla embriyonik yaşam sırasında üretilen daha küçük bir B1 hücresi popülasyonu ve yetişkin yaşamında kemik iliğinde üretilen baskın bir B2 hücresi popülasyonu1. Kemik iliğinde olgunlaştıktan sonra, B hücreleri birincil ve ikincil lenfoid organlara göç eder. Oradan, kan damarlarından ve lenfatik damarlardan geçen lenfoid organlar arasında sürekli olarak dolaşırlar2. B hücreleri, yüzeylerinde reseptör olarak işlev gören spesifik antikorları eksprese eder. B hücreleri reseptörlerine bağlanan bir antijenle karşılaştıklarında, aktive edici bir sinyal tetiklenebilir. Aktif B hücreleri ya antijenin bulunduğu dokuya göç eder ya da antikor üreten plazma hücrelerine olgunlaşabilecekleri kemik iliğine geri dönerler 3,4.
Son zamanlarda, kalbin büyük bir B hücresi popülasyonunu barındırdığı takdir edilmektedir. Kemirgenlerde yapılan çalışmalar, B hücrelerinin embriyonik gelişim5 sırasında kalbi erken kolonize ettiğini ve miyokardiyal ilişkili B hücrelerinin çoğunlukla endotel 6,7'ye yapışmış intravasküler, naif B2 hücreleri olduğunu ve küçük bir B1 hücresi yüzdesi 7 olduğunu göstermiştir. Hala birçok belirsizlik alanı vardır, ancak mevcut veriler B hücrelerinin hem naif kalpte hem de yaralanmaya miyokard adaptasyonu bağlamında önemli bir rol oynadığını göstermektedir.
Naif murin kalbindeki çalışmalar, başlangıçta miyokard B hücrelerinin çoğunlukla endotele yapışmış intravasküler boşlukta bulunduğunu göstermiştir (murin kardiyak B hücrelerinin %>95'inin intravasküler boşlukta yer aldığı bulunmuştur). Bu B hücrelerinin, periferik kandan izole edilen dolaşımdaki B hücrelerinden farklı gen ekspresyon paternlerine sahip olduğu bulunmuştur. B hücresi eksikliği olan hayvanlardan gelen naif kalplerin analizi ve sinjenik kontroller, B hücresi olmayan hayvanların daha küçük kalplere ve daha yüksek ejeksiyon fraksiyonuna sahip olduğunu bulmuştur6. Tüm bu kanıtlar, B hücrelerinin miyokard büyümesini ve / veya miyokard fonksiyonunu modüle edebileceğini ve sadece interstisyel değil, aynı zamanda intravasküler B hücrelerinin de bu tür gözlemlerden sorumlu olabileceğini düşündürmektedir. B hücrelerinin ayrıca miyokard yerleşik makrofajlarının fenotipini modüle ettiği bulunmuştur8.
Birçok çalışma, B hücrelerininyaralanmaya miyokard adaptasyonu bağlamında önemli bir rol oynadığını göstermiştir 8,9,10,11,12,13. B hücreleri, muhtemelen CXCL13-CXCR5'e bağımlıbir mekanizma 11,13 yoluyla yaralı kalpte geçici olarak birikir. Oradan, B hücreleri, sitokin aracılı monosit alımını içeren çeşitli mekanizmalar yoluyla olumsuz kardiyak yeniden yapılanmayı teşvik eder 9,12. Ek olarak, B hücreleri, çeşitli mekanizmalarla kardiyak hasarın genişlemesini ve olumsuz kardiyak yeniden şekillenmeyi teşvik edebilen kardiyak proteinlere karşı antikorlar üretebilir 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B hücreleri ayrıca IL-10 10'un salgılanması yoluyla yaralı kalp üzerinde koruyucu etkilergösterebilir.
B hücrelerinin naif ve yaralı kalpteki rolünü araştıran grupların sayısı arttıkça, miyokard B hücrelerini uygun şekilde ölçmek ve değerlendirmek ve böylece literatürde ortaya çıkmaya başlamış tutarsızlıklardan kaçınmak için paylaşılan protokolleri tanımlamak giderek daha önemli hale gelmektedir. Şimdiye kadar B hücrelerinin her ikisinin de kemirgen kalbindeki en yaygın bağışıklık hücrelerinden biri olduğu7 ve miyeloid hücrelerden 26,27 veya oldukça nadir28'den belirgin şekilde daha düşük bir prevalansta bulundukları bildirilmiştir. Benzer şekilde, birkaç grup akut iskemik miyokard hasarı 7,9,13'ten sonra miyokard B hücrelerinin sayısının arttığını tanımlamıştır, ancak bir grup yaralı miyokard29'un B hücrelerinin sayısında herhangi bir değişiklik olmadığını bildirmiştir. Kardiyak immün hücreler üzerinde yapılan çalışmalar nadiren perfüzyon koşulları hakkında ayrıntılı bilgi verir ve sindirim koşulları hakkında fikir birliği yoktur. Kemirgen kalbinde, B hücrelerinin büyük bir kısmı intravasküler olduğundan ve bağışıklık hücrelerinin miyokarddan ekstraksiyonu kullanılan sindirim yöntemine büyük ölçüde bağlı olduğundan, literatürde bildirilen farklılıklar organ perfüzyonu ve doku sindirimindeki farklılıkların bir sonucu olabilir.
Burada, perfüzyon ve sindirim koşullarını optimize ederek B hücresi geri kazanımının verimini en üst düzeye çıkaran ve intravasküler ve ekstravasküler miyokard B hücrelerinin ayrımına izin veren murin miyokard B hücrelerinin akış sitometrisine dayalı nicelleştirilmesi için ayrıntılı bir yöntem sunulmaktadır6. Bu protokol, intravasküler ve interstisyel immün hücreleri birbirinden ayıran diğer benzer protokollerin uyarlanması ve optimizasyonudur 28,30,31.
Bu protokolde, mikrovasküler endotele yapışmış biyolojik olarak ilgili B hücrelerini çıkarmadan intravasküler boşlukta yüzen B hücrelerini ortadan kaldırmak için miyokard perfüzyonunu standartlaştırıyoruz. Ayrıca, intravasküler ile interstisyel immün hücreleri32'yi ayırt etmek için intravenöz antikor enjeksiyonunun kullanımını tanımlayan önceki protokollere dayanarak ve B hücrelerinin yüzey belirteci B22033'ü eksprese etmesinden yararlanarak, hayvan kurban edilmeden ve kardiyak perfüzyondan hemen önce B220'ye özgü bir antikorun intravasküler enjeksiyonu yoluyla intravasküler ve ekstravasküler miyokard B hücrelerinin nasıl ayırt edileceğini gösteriyoruz. Bu protokol, naif ve yaralı kalpteki miyokard B hücrelerinin analizini de dahil etmek isteyen herhangi bir bilim adamının araştırmasıyla ilgilidir. Bu protokolün yaygın olarak uygulanması, araştırma grupları arasındaki tutarsızlıkları azaltacak, intravasküler ve ekstravasküler miyokard B hücre havuzlarındaki değişikliklerin analizine izin verecek ve böylece kardiyak immünoloji alanındaki keşiflerin ilerlemesini destekleyecektir.
Özetle, protokol, akış sitometrisi yoluyla miyokard B hücrelerini ölçmek ve analiz etmek için optimize edilmiş bir iş akışını temsil eder ve aynı zamanda ekstravasküler boşlukta ve intravasküler boşlukta bulunan hücreleri ayırt eder.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody</td>
			<td>101222</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100 &#181;g 200 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 &#181;m, Blue</td>
			<td>QBIAP303</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube</td>
			<td>1605-0000</td>
			<td>SealRite, USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Injection, USP</td>
			<td>114-055-101</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>0.90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td>SealRite, USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11213810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11267810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free</td>
			<td>430052</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Way Stop Valve, Polycarbonate</td>
			<td>SVPT951</td>
			<td>ECT Manufacturing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol</td>
			<td>T48402</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L Graduated TipOne Filter Tips</td>
			<td>11208810</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Way Stop Valve, Polycarbonate</td>
			<td>SVPT953</td>
			<td>ECT Manufacturing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style</td>
			<td>352054</td>
			<td>Falcon, a Corning Brand</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free</td>
			<td>430290</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63</td>
			<td>5810759005</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62</td>
			<td>22638289</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 &#8211; 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62</td>
			<td>22638246</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil 12 in x 75&#39; Roll .0007</td>
			<td>UPC 109153</td>
			<td>Reynolds Wrap</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Induction Chamber - Mouse</td>
			<td>RWD-AICMV-100</td>
			<td>Conduct Science</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL</td>
			<td>309626</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2&#34; 100-Pack</td>
			<td>CMD 2613</td>
			<td>Brandzig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody</td>
			<td>115537</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 &#181;m, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile</td>
			<td>T9009</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Dioxide USP E CGA 940&#160;</td>
			<td>CD USPE</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL</td>
			<td>UX-34502-46</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 2</td>
			<td>LS004176</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Connector brass chrome plated 1/4&#34; female NPT x 1/4&#34; barb</td>
			<td>Y992611-AG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytek Aurora Flow Cytometer</td>
			<td></td>
			<td>Cytek Biosciences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP</td>
			<td>M-08-12</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I - 40,000 U</td>
			<td>D4527</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easypet&#160;3 - Electronic Pipette Controller</td>
			<td>4430000018</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Balance, AX223/E</td>
			<td>30100606</td>
			<td>Ohaus Corp.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td>5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes</td>
			<td></td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.1</td>
			<td></td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100)</td>
			<td>Z740287</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]</td>
			<td>14025076</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>H3506</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kelly Hemostats, Straight</td>
			<td>13018-14</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL</td>
			<td>302831</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940</td>
			<td>M1-940-PG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McKesson Underpads, Moderate</td>
			<td>4033-CS150</td>
			<td>McKesson</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Navigator Multi-Purpose Portable Balance</td>
			<td>NV2201</td>
			<td>Ohaus Corp.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]</td>
			<td>10010023</td>
			<td>gibco</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody</td>
			<td>103208</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>200 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody</td>
			<td>103132</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100 &#181;g 500 uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene</td>
			<td>FB0875711YZ</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02</td>
			<td>M08-1</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator</td>
			<td>LED-6W</td>
			<td>AmScope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm)</td>
			<td>305122</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO)</td>
			<td>553141</td>
			<td>BD Becton, Dickinson and Company Biosciences</td>
			<td>0.5 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 4.1.1</td>
			<td></td>
			<td>The R Foundation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blades</td>
			<td>9501250000</td>
			<td>Accutec Blades Inc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet</td>
			<td>Y12244A320-AG</td>
			<td>AirGas USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets</td>
			<td>Rotor A-4-62</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma label tape</td>
			<td>L8394</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroFlo 3.0.0</td>
			<td></td>
			<td>Cytek Biosciences</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8&#34; Hose Barb; 1/EA</td>
			<td>MTLL230-6005</td>
			<td>Spex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8&#34; ID x 3/16&#34; OD x 1/32&#34; Wall x 50&#39; Long</td>
			<td>CG-730-003</td>
			<td>Excelon Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe PP/PE without needle, 3 mL</td>
			<td>Z683566</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>55-1199 (95-240)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500</td>
			<td>9371W13</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rack, 12&#160;positions, 6 for 5.0&#160;mL and 15&#160;mL tubes and 6 for 25&#160;mL and 50&#160;mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable</td>
			<td>30119835</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rack, 12&#160;positions, for 5.0&#160;mL and 15&#160;mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable</td>
			<td>30119827</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. &#215; O.D. 1/4 in. &#215; 3/8 in.</td>
			<td>T8913 (Millipore Sigma)</td>
			<td>Tygon, Saint-Gobain</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Scientific Industries, Inc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips</td>
			<td>89259-946</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4&#189;&#34;</td>
			<td>82027-578</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I</td>
			<td>12620-946</td>
			<td>Avantor, by VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>423102</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry-based quantification and analysis of myocardial b-cells

Giderek artan sayıda kanıt, B-lenfositlerin miyokard fizyolojisi ve yaralanmaya miyokard adaptasyonu bağlamında önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Bununla birlikte, literatür miyokard B hücrelerinin prevalansı hakkında zıt veriler bildirmektedir. B hücrelerinin hem kemirgen kalbindeki en yaygın bağışıklık hücreleri arasında olduğu hem de mevcut olduğu, ancak miyeloid hücrelerden belirgin şekilde daha düşük bir prevalansta olduğu veya oldukça nadir olduğu bildirilmiştir. Benzer şekilde, birkaç grup akut iskemik miyokard hasarından sonra miyokard B hücrelerinin sayısının arttığını tanımlamıştır, ancak bir grup yaralı miyokardın B hücrelerinin sayısında herhangi bir değişiklik bildirmemiştir. Miyokard B hücrelerinin prevalansını değerlendirmek için paylaşılan, tekrarlanabilir bir yöntemin uygulanması, farklı araştırma gruplarından gelen gözlemleri uyumlu hale getirmek ve böylece B hücresi miyokard etkileşimleri çalışmasının ilerlemesini teşvik etmek için kritik öneme sahiptir. Deneyimlerimize dayanarak, literatürde bildirilen görünüşte zıt gözlemler muhtemelen murin miyokard B hücrelerinin çoğunlukla intravasküler olması ve mikrovasküler endotele bağlı olması gerçeğinden kaynaklanmaktadır. Bu nedenle, bir murin kalbinden kurtarılan B hücrelerinin sayısı, organı temizlemek için kullanılan perfüzyon koşullarına ve kullanılan sindirim yöntemine karşı son derece hassastır. Burada, bu iki kritik değişkeni belirli bir şekilde açıklayan optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, murin miyokard B hücrelerinin sayısının tekrarlanabilir, akış sitometrisine dayalı analizini güçlendirir ve araştırmacıların ekstravasküler ve intravasküler miyokard B hücrelerini ayırt etmelerini sağlar.

Edinme tamamlandıktan ve tüm olaylar toplandıktan sonra, veriler standart akış sitometrisi uygulamasına göre analiz edilmelidir. Analizin odağı, her deneyin bireysel amacına bağlı olarak değişecektir. Bu durumda, intravasküler ve ekstravasküler B hücrelerinin nicelleştirilmesi takip edildi ve mg doku başına düşen hücre sayısı olarak ifade edildi.
Bir spektral sitometre kullanırken, analize, bağışıklık hücrelerine karşılık gelen bir aralıkta olmayan boyutlard...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells at JoVE.com

Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells

Burada, miyokard B-lenfositlerinin intravasküler veya endotel boşluğundaki konumlarına göre akım sitometrisi kullanılarak nicelleştirilmesi ve farklılaştırılması için bir protokol sunulmuştur.

Akış Sitometrisine Dayalı Miyokard B Hücrelerinin Nicelleştirilmesi ve Analizi

A growing body of evidence shows that B-lymphocytes play an important role in the context of myocardial physiology and myocardial adaptation to injury. ...

Literatür, miyokard B hücrelerinin prevalansı hakkında zıt veriler bildirmektedir. Bu muhtemelen perfüzyon ve sindirim tekniklerindeki değişkenlikten kaynaklanmaktadır. Protokolümüz, miyokard B hücreleri üzerinde tekrarlanabilir akış sitometrisine dayalı analizi güçlendirir.Bu teknik, B hücrelerinin iyileşme verimini en üst düzeye çıkarır ve B hücreleri ve kalp örneklerinden elde edilen diğer popülasyonlar arasındaki akış sitometri sayımlarındaki değişkenliği azaltır. Bu optimize edilmiş sindirim ve izolasyon yöntemi, kalpteki farklı bağışıklık hücresi tiplerini incelemek için genişletilmiş bir antikor paneli uygulamak için kolayca değiştirilebilir. Protokol, bu organlarla ilişkili B hücrelerini incelemek için akciğer veya karaciğer gibi diğer organlara da uygulanabilir.Başlamak için, 12 haftalık bir erkek fareyi tartın. 100 mikrolitre B220 antikor çözeltisi içeren 310 cc'lik bir insülin şırıngası yükleyin. Seyreltilmiş B220 antikorunu retro-orbital enjeksiyonla enjekte edin ve derhal organ toplama ve perfüzyona geçin.Ötanaziden sonra, farenin derisini epigastrik bölgede forseps ile tutun. Makas kullanarak ciltte iki milimetrelik bir açıklık açın ve fasya tabakasını ortaya çıkarmak için cildi soymak için forsepsleri kullanın. Epigastriyumda fasya ve periton boyunca kesin.Hemostatik forseps kullanarak ksifoid işlemi kelepçeleyin. Her iki taraftaki orta klaviküler çizgi seviyesinde göğüs duvarından dikey bir kesim yapın ve mediasten içeriğini ortaya çıkarmak için ön göğüs duvarını kaldırın. Forseps kullanarak aortu arkadan güvenli bir şekilde tutun.Şırınga iğnesini kalbin tepesine sokun. Dakikada üç mililitre hızında üç mililitre HBSS ile perfüze edilir. Aortu kesin ve kalbi çıkarın.Petri kabındaki kalbi HBSS ile yıkayın. İzole edilmiş kalbi tartın ve ağırlığı miligram cinsinden not edin. Kalbi oda sıcaklığında bir bıçakla küçük parçalara ayırın.Kalp parçaları yaklaşık 1,5 milimetre büyüklüğünde olmalıdır. Bir denge kullanarak kalp dokusunun kütlesini ölçün ve üç mililitre HBSS içeren buz üzerine 15 mililitrelik bir tüpte sindirilecek kıyılmış kalbin 60 miligramını yerleştirin. B220 antikor enjeksiyonunu almayan bir fare için bu işlemi tekrarlayın ve üç mililitre HBSS etiketli referans kontrol dokusu içeren tüpe yerleştirin.Kıyılmış dokular içeren her tüpe enzimler ekleyin. Miligram DNaz I başına 0.5 mikrolitre, miligram kollajenaz II başına bir 0.5 mikrolitre ve miligram hyaluronidaz başına 0.2 mikrolitre ekleyin. Sindirim reaksiyonunu çalkalayıcıya dakikada 300 dönüşte 30 dakika boyunca yerleştirin.Tüpler çalkalayıcıya küçük bir açıyla, yaklaşık 25 derecelik eğimle yerleştirilir. 15 mililitrelik reaksiyon tüplerinin her birine yedi mililitre HBSS ekleyin ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 250 G'de santrifüj yapın. Süper natantı boşalttıktan sonra, her peleti beş mililitre ACK lizis tamponunda yeniden askıya alın.Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Her tüpe 10 mililitre PBS ekledikten sonra, 40 mikrometrelik bir süzgeçle 50 mililitrelik bir tüpe karıştırın ve süzün. Tüm malzemenin filtreden geçmesini sağlamak için filtredeki kalıntıları bir şırınga pistonu ile parçalayın.Hacim kalp başına 25 mililitreye ulaşana kadar filtreden PBS ekledikten sonra, referans kontrol doku tüpüne ilave 25 mililitre PBS ekleyin ve hacmi iki farklı tüpe bölün. Tüplerden birini lekesiz, diğerini canlı/ölü olarak etiketleyin. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 250 G'de santrifüj yaptıktan sonra, süpernatantı boşaltın ve lekesiz tüpü 100 mikrolitre PBS'de ve diğer peletlerin her birini canlı / ölü leke çözeltisinin 100 mikrolitresinde yeniden askıya alın.Karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın. Her numuneye 500 mikrolitre FACS tamponu ekledikten sonra, 40 mikrometrelik bir filtreden bir FACS tüpüne aktarın. FACS tüplerini dört santigrat derecede beş dakika boyunca 250 G'de reddettikten ve süpernatanı attıktan sonra, peleti 500 mikrolitre FACS tamponunda yeniden askıya alın.Lekesiz ve canlı/ölü tüpler hariç her tüpe 50 mikrolitre FC blokaj çözeltisi ekleyin. Karıştırın ve beş dakika boyunca inkübe edin. Lekesiz ve canlı/ölü tüpler hariç, her tüpe 50 mikrolitre antikor karışımı çözeltisi ekledikten sonra, buz kovasını alüminyum folyo ile kaplayarak karanlıkta 30 dakika kuluçkaya yatırın.Canlı / ölü lekede olduğu gibi, 500 mikrolitre FACS tamponu ile tekrar yıkayın ve 300 ila 500 mikrolitre FACS tamponunda tekrar askıya alın. Cihaz kontrol yazılımını açın. Pencerenin üst kısmında, Edinme sekmesini seçin ve Yeni'ye tıklayın.Kütüphane bölümünde, Filtre uygulamak için tür alanına PE, PerCP-Cy5.5, parlak menekşe 421, Alexa Fluor 700 ve Zombie Aqua yazın, floro-4'ü seçin ve her birini yazdıktan sonra Ekle'ye tıklayın. Ardından, Gruplar sekmesine gitmek için İleri'yi tıklatın. Şimdi analiz için kalbi eklemek için tüplü sembole tıklayın.Referans grubuna tıklayın ve bir pencere açılacaktır. Floresan etiketler sütununda, floresan etiketi olarak Zombie Aqua'yı seçin ve her birinin yanındaki kırmızı çöp kutusu simgesine tıklayarak diğerlerini silin. Ardından, Denetim Türü simgesinde Hücreler'i seçin.Ardından, Kaydet'i tıklatın. İleri'ye tıklayın. Ardından, İşaretçiler sekmesini tıklatın.Bir tablo görüntülenir. Her floro-4 sütununun ilk satırına karşılık gelen hücre işaretçisini yazın ve Enter tuşuna basın.Deneysel örneklerin Kaydedilecek Olayları'nda 10 milyon yazın ve referans grubu satırı için aynı alana 200.000 yazın. Kaydet ve Aç'ı tıklayın. Sol altta, Enstrüman Kontrolü'ne tıklayın.Voltajı FSC 50, SSC 175, SSC-B 175 olarak ayarlayın. Edinme Denetimi'ni seçin. Akış hızı seçeneği için açılır menüden Yüksek'i seçin.Lekesiz kalp tüpünü vorteksleyin ve numune enjeksiyon portuna güvenli bir şekilde yerleştirin. Yeşil gösterge okunun doğru örneğe işaret ettiğinden emin olun. Ardından, Kaydet'i tıklatın ve olaylar kaydedilene kadar bekleyin.Aynı şeyi canlı/ölü lekeli kalp dokusu için de yapın. Mix Çöz menüsünü seçin ve kontrolleri ayarlayın. Floresan Etiketi Olarak Otomatik Floresan onay kutusunu seçin.Ardından, Pozitif/Negatif Popülasyonları Tanımla sekmesine ilerlemek için İleri'yi tıklatın. Bu sekmede, ileri dağılım alanı ile yan dağılım alanının grafiği görüntülenir. İleri dağılım alanı ekseninde 1 ile 4 milyon arasında ve yan dağılım alanı ekseninde 0,2 ila 3 milyon arasında bir alan seçmek için çokgenin noktalarını tıklatıp sürükleyin.Sağdaki bir sonraki grafikte, V5-A X ekseninde görüntülenecektir. En sağdaki zirvenin yarısını pozitif olarak ve grafiğin sol tarafındaki bir bölgeyi negatif olarak seçmek için kapıları hareket ettirin. Reference Group-Unstained başlıklı çizimde, benzer aralıkta bir popülasyon seçin.Lekesiz olanlar için pozitif/negatif seçilmemelidir. Canlı Karıştırmayı Kaldırma düğmesine tıklayın. Şimdi deneysel örnekleri alın, tüpü vorteksleyin ve güvenli bir şekilde SIP'e yerleştirin.Yeşil gösterge okunun doğru örneğe işaret ettiğinden emin olun. Ardından, sitometre yazılımının Edinme Kontrol panelinde Kaydet'i tıklatın ve olaylar kaydedilene kadar bekleyin. Varsayılan Karıştırılmamış Çalışma Sayfası sekmesini seçin.Üstteki nokta çizim aracını kullanarak FCS-A ve SSC-A grafiği oluşturun. Çokgen seçim aracını kullanarak FSC-A ekseninde 0,4 milyondan yüksek ve SSC-A ekseninde 0,8 milyondan yüksek olayları seçin. Seçimi çift tıklatarak yeni bir grafik oluşturun ve bu yeni grafikte Y ekseni etiketine sağ tıklayın ve canlı/ölü lekeyi seçin.X ekseni etiketine sağ tıklayın ve Otomatik Floresan A'yı seçin.Canlı/ölü eksende 10 ila beşincinin altındaki tüm olayları seçin. Bunlar canlı hücrelerdir. Bu seçime çift tıklayın.Yeni grafikte, X ekseni için PerCP-Cy5.5A'yı ve Y ekseni için SSC-A'yı seçin. PerCP-Cy5.5A'nın sağ tarafındaki popülasyonları seçin. Bunlar bağışıklık hücreleridir.Seçime çift tıklayın. Yeni grafikte, X ekseni için FSC-A'yı ve Y ekseni için ileri dağılım yüksekliğini seçin. FSC-A değeri ile SSC-A değerinin aynı olduğu bir eğilimi izleyen olayları seçin.Bu, tek hücreleri seçer ve çiftleri ortadan kaldırır. CD45 pozitif tek hücreli popülasyonda yeni bir grafik görüntülemek için bu seçime çift tıklayın. CD45 pozitif tek hücreli popülasyon grafiğinden, X ekseninde parlak mor 421'i ve Y ekseninde SSC-A'yı seçin.Parlak menekşe 421 ekseninde sağdaki popülasyonu seçin. Bu B hücresi popülasyonudur. B hücresi popülasyonuyla iki yeni çizim oluşturmak için bu popülasyonda iki kez çift tıklatın.X ekseninde PEA ve Y ekseninde parlak mor 421A ile ilk B hücresi grafiğini kurun. Sağdaki popülasyon intervasküler B hücrelerine karşılık gelir ve soldaki popülasyon interstisyel B hücrelerini temsil eder. Her ikisini de seçin.X ekseninde Alexa Fluor 700A ve Y ekseninde SSC-A ile ikinci B hücresi grafiğini ayarlayın. Soldaki popülasyon CD11b-negatif hücrelere karşılık gelir ve sağdaki olaylar CD11b-pozitif hücrelere karşılık gelir. Her bölüme sağ tıklayın ve ardından Kapı özellikleri'ne tıklayın.Olayların sayısını ve üst popülasyonların yüzdelerini görüntülemek için Count ve Parent'a tıklayın. Daha fazla veri analizi için olay sayısını ve yüzdeleri kaydedin. Naif yaralanmamış bir kalpteki çiftlerin çıkarılmasından sonra, CD45 pozitif hücrelerin yaklaşık% 20'sinin CD19 pozitif B hücreleri olması beklenir.Bu hücrelerin ortalama %5.5'i interstisyel boşlukta bulunur. %94.5'i intravasküler boşluktadır. Kalpte bulunan tüm B hücresi popülasyonundan, sadece% 1.6'sı, CD11b yüzey belirtecine dayanan B1 hücrelerine ve diğer% 98.4'ü B2 hücrelerine karşılık gelir.Miyokard B hücrelerini akış sitometrisi ile analiz ederken, protokolü uygun şekilde izleyerek kalbi perfüzyon yapmak ve kıymak çok önemlidir. Sindirilmiş kalbin uygun şekilde filtrelenmesi, bağışıklık hücrelerinin iyileşmesini en üst düzeye çıkarmak için de gereklidir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of CD40-activation of B cells

Murin Model B hücreleri CD40 aktivasyonu

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

İzolasyon, Farklılaşma ve Niceleme İnsan Kanı B Hücreleri Antikor salgılayan: ELISPOT Hümoral Bağışıklık bir Fonksiyonel Göstergesi&#39;nin olarak

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Akış NK Hücre Fonksiyonları İzleme Testi Sitometri tabanlı

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Fenotip ve Fonksiyon Analizi için algılama ve Nadir zenginleştirilmesi antijene özgü B hücreleri

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Akış Sitometresi tabanlı sitotoksisite tahlil insan NK hücre etkinliği değerlendirilmesi için

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Basit Akış Sitometresi Vitro antikor bağımlı Enhancement-in dang virüs Zika virüs nekahat Serum kullanarak belirlemek için tahlil dayalı

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Yamultma akış kaynaklı geçiş antikorundan marjinal bölge B hücrelerinin in Vitro analizine

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...