2.1K Views
•
08:16 min
•
October 20th, 2022
DOI :
October 20th, 2022
•0:04
Introduction
1:08
Dissection of the Dentate Gyrus (DG)
1:53
Tissue Dissociation, Single Nuclei Isolation, and Anti-NeuN Immunostaining
4:03
Fluorescence Activated Nuclei Sorting (FANS) to Exclude Neuronal Populations
5:12
Preparation of the Single Nuclei Suspension to Perform Single Nuclei RNA Sequencing
5:59
Results: Preparation of a Suspension of Non-Neuronal Single Nuclei Isolated from the Dentate Gyrus (DG)
7:51
Conclusion
Transcript
Strategien til at udelukke neuroner ved hjælp af negativ FACS-sortering genererer RNA-sekventeringshastigheder af høj kvalitet af cellepopulation med lav overflod, som neurale stamceller, astrocytter og oligodendrocytter, for at studere deres rolle i moduleringen af voksen hippocampal neurogenese. Med denne metode er det muligt at tilpasse valget af antistof i FACS-gating, hvilket gør denne protokol meget alsidig til at løse forskellige biologiske spørgsmål relateret til dentatgyrusen. Denne metode er primært designet til at undersøge den voksne hippocampus niche.
Det kunne dog let tilpasses til at studere andre stamcellenicher. Sara Ahmed de Prado, postdoktor ved Francis Crick Institute, demonstrerer proceduren. Til at begynde med overføres hjernen dissekeret fra den aflivede mus til en 10 centimeter petriskål fyldt med iskold PBS.
Placer derefter petriskålen på is og skær hjernen i to halvdele langs sagittalaksen. Brug en skalpel til at fjerne cerebellum. Overfør den ene halvdel af hjernen til den nye 10 centimeter petriskål placeret på is, der indeholder iskold PBS.
Dissekere dentate gyrus eller DG ved hjælp af kikkert, og gentag dette trin for at opnå det andet DG fra anden halvdel af hjernen. Overfør de to GD'er til den forkølede Dounce-homogenisator, og tilsæt 1 milliliter koldhomogeniseringsbuffer eller HB. Homogeniser vævet med 10 slag af den løse A-pistle efterfulgt af 15 slag af den stramme B-pistel. Overfør homogenatet til et forkølet 15 ml rør.
Skyl Dounce homogenisatoren med 1 milliliter kold HB og kombiner den med det samme rør. Tilsæt 3 ml HB til 15 ml røret, og inkuber i 5 minutter på is. Bland denne kernesuspension to gange ved at vende røret forsigtigt.
Ved hjælp af 0,5 ml HB forvædes den 70 mikrometer silhætte, der er placeret over et 50 milliliter reagensglas, og spænd derefter kernesuspensionen, inden cellesilen vaskes med 0,5 ml HB. Fjern derefter cellesilen og centrifuger reagensglasset i en svingspandcentrifuge ved 500 x g i 5 minutter ved 4 grader Celsius. Kassér supernatanten. Forsigtigt resuspender pelleten i 4 ml HB ved hjælp af en P1000-pipette.
Efter 5 minutters inkubation på is centrifugeres suspensionen ved 500 x g i 10 minutter ved 4 grader Celsius. Kassér supernatanten og suspender pelleten i 3 ml vaskemedier. Brug 0,5 ml vaskemedier til at forvæde en 35 mikrometer silhætte over et 50 milliliter reagensglas.
Sil derefter kernesuspensionen ved at pipettere 0,5 ml suspension ad gangen ved hjælp af en P1000-pipette. Efter vask af silhætten med 0,5 ml vaskemedier skal du placere røret på is. Overfør filtratet til et nyt 15 ml rør og centrifuger det i 5 minutter og 4 grader Celsius ved 500 x g.
Kassér supernatanten, og suspender pelleten i 3 ml vaskemedier. Centrifugeringen gentages, og pelleten gensuspenderes i 1 milliliter vaskemedier med musens anti-NeuN, Alexa Fluor 488-konjugerede antistof og 1 mikrogram pr. milliliter DAPI. Inkuber reaktionen i 45 minutter på is i mørket.
Til fluorescensaktiveret kernesortering eller FANS overføres den immunfarvede kernesuspension til et 5 milliliter reagensglas og placeres på is indtil starten af flowcytometriproceduren. Hvirvel prøverne i 3 sekunder med mild intensitet, før rørene placeres i FACS-instrumentet. For at erhverve data fra farvet kernesuspension skal du indstille portene i DAPI-højde og DAPI-området for at udelukke celleaffaldet og de aggregerede kerner.
Indstil derefter portene i log side scatter eller SSC, område, og log forward scatter, eller FSC, område, for at adskille de enkelte kerner fra de resterende DAPI farvede aggregat eller celleaffald. Isoler derefter den NeuN-AF488-negative befolkning ved at indstille portene til anti-NeuN-AF488- og FSC-området. Efter analysen sorteres den anti-NeuN-AF488 negative population i et 1,5 milliliter opsamlingsrør fyldt med 50 mikroliter vaskemedier ved hjælp af gating-strategien.
Når sorteringen er udført, tilsættes 1 milliliter PBS indeholdende 1% bovin serumalbumin eller BSA til opsamlingsrøret for at opsamle dråber fra rørets væg og centrifugere røret ved 500 x g i 5 minutter ved 4 grader Celsius. Kassér supernatanten, og efterlad 50 mikroliter opløst stof til resuspendering af centrifugerede kerner. I et 0,5 ml mikrorør tilsættes 5 mikroliter kernesuspension til 5 mikroliter Trypan blue.
Mål koncentrationen, og vurder levedygtigheden af enkeltcellesuspensionen ved hjælp af en automatiseret celletæller, inden du udfører biblioteksforberedelsen og sekventering af kernerne. Bioinformatisk klyngedannelse afslørede velseparerede grupper af kerner svarende til kendte celletyper inden for DG, med eller uden FANS. Inden for den ikke-FACS-sorterede prøve var de fleste af de sekventerede kerner af høj kvalitet 84,9% af neuronerne.
Den bestod af tre grupper af neuroner, hvilket indikerer muligheden for, at de mest repræsentative cellepopulationer i dentatgyrusen er granulneuroner, andre excitatoriske neuroner og hæmmende neuroner. Inden for den ikke-FACS-sorterede prøve blev de identificerede ikke-neuronale klynger for det meste lavet af 11,1% af gliacelletyper, herunder astrocytter, oligodendrocytter og oligodendrocytprecursorceller, 3,3% immunceller og 0, 6% Cajal-Retzius-celler. Mens de udførte FANS for at udelukke NeuN-positive populationer, blev klyngerne af gliaceller fremtrædende med 81,3% af de samlede kerner.
For de prøver, der blev sekventeret ved 50.000 læsninger pr. kerner, blev der påvist 25.010 gener pr. kerne for den ikke-FACS-sorterede prøve og 1.665,5 gener for den NeuN-negative FANS-prøve, hvilket bekræfter, at transkriptomisk profilering af enkeltkerner og FACS-sortering af høj kvalitet ikke beskadiger kernerne til efterfølgende snRNA-seq. Den høje andel af neuroner i den ikke-FACS-sorterede prøve havde en højere transkriptionel aktivitet på 2.660 gener pr. kerne og 6.170 transkripter pr. kerne i den ikke-FACS-sorterede prøve end de ikke-neuronale celletyper med gennemsnitlig transkriptionel aktivitet på 1.090 gener pr. kerne og 1.785 transkripter pr. kerne. Når dataene er genereret med denne protokol, er det værd at overveje disse nye ortogonale metoder såsom specielle symptomika eller in vivo-undersøgelser for at validere eventuelle fund.
Præsenteret her er en metode til at sekvensere enkeltkerner isoleret fra musens dentate gyrus, der udelukker de fleste neuroner gennem fluorescensaktiverede kerner (FAN) -sortering. Denne tilgang genererer ekspressionsprofiler af høj kvalitet og letter undersøgelsen af de fleste andre celletyper, der er repræsenteret i nichen, herunder knappe populationer såsom neurale stamceller.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved