हिप्पोकैम्पल न्यूरोजेनिक आला का अध्ययन करने के लिए एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण के साथ संयुक्त न्यूरॉन्स की प्रतिदीप्ति-सक्रिय नाभिक नकारात्मक छंटाई

नकारात्मक एफएसीएस सॉर्टिंग का उपयोग करके न्यूरॉन्स को बाहर करने की रणनीति वयस्क हिप्पोकैम्पल न्यूरोजेनेसिस के मॉड्यूलेशन में उनकी भूमिका का अध्ययन करने के लिए तंत्रिका स्टेम सेल, एस्ट्रोसाइट्स और ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स जैसे कम बहुतायत सेल आबादी की उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए अनुक्रमण दर उत्पन्न करती है। इस विधि के साथ, एफएसीएस गेटिंग में एंटीबॉडी की पसंद को अनुकूलित करना संभव है, जो इस प्रोटोकॉल को डेंटेट गाइरस से संबंधित विभिन्न जैविक प्रश्नों को संबोधित करने में बहुत बहुमुखी बनाता है। यह विधि मुख्य रूप से वयस्क हिप्पोकैम्पल आला की जांच करने के लिए डिज़ाइन की गई है।

हालांकि, इसे आसानी से अन्य स्टेम सेल niches का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। फ्रांसिस क्रिक इंस्टीट्यूट में पोस्ट-डॉक्टरेट ट्रेनिंग फेलो सारा अहमद डी प्राडो इस प्रक्रिया का प्रदर्शन करेंगी। शुरू करने के लिए, इच्छामृत्यु माउस से विच्छेदित मस्तिष्क को बर्फ-ठंडे पीबीएस से भरे 10 सेंटीमीटर पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।

फिर पेट्री डिश को बर्फ पर रखें और मस्तिष्क को दो हिस्सों में काट लें। स्केलपेल का उपयोग करके, सेरिबैलम को हटा दें। मस्तिष्क के आधे हिस्से को बर्फ पर रखे नए 10 सेंटीमीटर पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, जिसमें बर्फ-ठंडा पीबीएस होता है।

दूरबीन का उपयोग करके डेंटेट गाइरस, या डीजी को विच्छेदित करें, और मस्तिष्क के दूसरे आधे हिस्से से दूसरा डीजी प्राप्त करने के लिए इस चरण को दोहराएं। दो डीजी को प्री-कूल्ड डौंस होमोजेनाइज़र में स्थानांतरित करें और 1 मिलीलीटर ठंडा होमोजेनाइजेशन बफर, या एचबी जोड़ें। ढीले ए मूसल के 10 स्ट्रोक के साथ ऊतक को समरूप करें, इसके बाद तंग बी पेस्टल के 15 स्ट्रोक। होमोजेनेट को एक प्रीचाइल्ड 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें।

डौंस होमोजेनाइज़र को 1 मिलीलीटर ठंडे एचबी के साथ धोएं और इसे उसी ट्यूब के साथ मिलाएं। 15 मिलीलीटर ट्यूब में 3 मिलीलीटर एचबी जोड़ें, और बर्फ पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। ट्यूब को धीरे से मोड़कर इस नाभिक निलंबन को दो बार मिलाएं।

0.5 मिलीलीटर एचबी का उपयोग करके, 50 मिलीलीटर टेस्ट ट्यूब पर रखी गई 70 माइक्रोमीटर स्ट्रेनर कैप को प्री-वेट करें, फिर 0.5 मिलीलीटर एचबी के साथ सेल स्ट्रेनर को धोने से पहले नाभिक निलंबन को छान लें। इसके बाद, सेल छन्नी को हटा दें और टेस्ट ट्यूब को 500 x g पर 500 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें। धीरे से पी 1000 पिपेट का उपयोग करके एचबी के 4 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें।

बर्फ पर इनक्यूबेशन के 5 मिनट के बाद, निलंबन को 10 मिनट के लिए 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, 4 डिग्री सेल्सियस पर। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें और 3 मिलीलीटर वॉश मीडिया में गोली को फिर से निलंबित करें। 50 मिलीलीटर टेस्ट ट्यूब पर 35 माइक्रोमीटर स्ट्रेनर कैप को प्री-वेट करने के लिए 0.5 मिलीलीटर वॉश मीडिया का उपयोग करें।

फिर पी 1000 पिपेट का उपयोग करके एक बार में 0.5 मिलीलीटर निलंबन करके नाभिक निलंबन को छान लें। 0.5 मिलीलीटर वॉश मीडिया के साथ छन्नी टोपी को धोने के बाद, ट्यूब को बर्फ पर रखें। छानने को एक नए 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे 500 x g पर 5 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।

सुपरनैटेंट को छोड़ दें, और 3 मिलीलीटर वॉश मीडिया में गोली को फिर से निलंबित करें। सेंट्रीफ्यूजेशन को दोहराएं और माउस एंटी-न्यून, एलेक्सा फ्लूर 488-संयुग्मित एंटीबॉडी और 1 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर डीएपीआई के साथ 1 मिलीलीटर वॉश मीडिया में गोली को फिर से निलंबित करें। अंधेरे में बर्फ पर 45 मिनट के लिए प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें।

फ्लोरेसेंस सक्रिय नाभिक सॉर्टिंग, या एफएएनएस के लिए, इम्यूनो-सना हुआ नाभिक निलंबन को 5 मिलीलीटर टेस्ट ट्यूब में स्थानांतरित करें, और इसे प्रवाह साइटोमेट्री प्रक्रिया की शुरुआत तक बर्फ पर रखें। एफएसीएस उपकरण में ट्यूबों को रखने से पहले, हल्की तीव्रता के साथ 3 सेकंड के लिए नमूने को भंवर करें। दाग वाले नाभिक निलंबन से डेटा प्राप्त करने के लिए, सेल मलबे और एकत्रित नाभिक को बाहर करने के लिए DAPI-ऊंचाई और DAPI-क्षेत्र में गेट सेट करें।

फिर लॉग साइड स्कैटर, या एसएससी, क्षेत्र, और लॉग फॉरवर्ड स्कैटर, या एफएससी, क्षेत्र में गेट सेट करें, ताकि एकल नाभिक को शेष डीएपीआई दाग वाले कुल या सेल मलबे से अलग किया जा सके। फिर एंटी-न्यून-एएफ 488 और एफएससी क्षेत्र के लिए द्वार स्थापित करके न्यून-एएफ 488-नकारात्मक आबादी को अलग करें। विश्लेषण के बाद, गेटिंग रणनीति का उपयोग करके वॉश मीडिया के 50 माइक्रोलीटर से भरे 1.5 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में एंटी-न्यून-एएफ 488 नकारात्मक आबादी को क्रमबद्ध करें।

एक बार छंटाई पूरी हो जाने के बाद, ट्यूब की दीवार से बूंदों को इकट्ठा करने के लिए संग्रह ट्यूब में 1% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन, या बीएसए युक्त 1 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें और ट्यूब को 500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, 5 मिनट के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें, 50 माइक्रोलीटर विलेय को सेंट्रीफ्यूजेटेड नाभिक को फिर से निलंबित करने के लिए छोड़ दें। 0.5 मिलीलीटर माइक्रोट्यूब में, ट्राइपैन ब्लू के 5 माइक्रोलीटर में नाभिक निलंबन के 5 माइक्रोलीटर जोड़ें।

एकाग्रता को मापें और नाभिक की लाइब्रेरी तैयारी और अनुक्रमण करने से पहले एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके एकल सेल निलंबन की व्यवहार्यता का आकलन करें। जैव सूचना त्मक क्लस्टरिंग ने एफएएनएस के साथ या बिना डीजी के भीतर ज्ञात सेल प्रकारों के अनुरूप नाभिक के अच्छी तरह से अलग समूहों का खुलासा किया। गैर-एफएसीएस-क्रमबद्ध नमूने के भीतर, अधिकांश उच्च गुणवत्ता वाले अनुक्रमित नाभिक 84.9% न्यूरॉन्स थे।

इसमें न्यूरॉन्स के तीन समूह शामिल थे, जो डेंटेट गाइरस में सबसे अधिक प्रतिनिधि सेल आबादी की संभावना को ग्रेन्युल न्यूरॉन्स, अन्य उत्तेजक न्यूरॉन्स और निरोधात्मक न्यूरॉन्स होने का संकेत देते हैं। गैर-एफएसीएस-क्रमबद्ध नमूने के भीतर, पहचाने गए गैर-न्यूरोनल क्लस्टर ज्यादातर ग्लियाल सेल प्रकारों के 11.1% से बने थे, जिनमें एस्ट्रोसाइट्स, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स और ऑलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूत कोशिकाएं, 3.3% प्रतिरक्षा कोशिकाएं और 0, 6% कैजल-रेट्ज़ियस कोशिकाएं शामिल थीं। न्यून पॉजिटिव आबादी को बाहर करने के लिए एफएएनएस का प्रदर्शन करते समय, ग्लियल कोशिकाओं के समूह प्रमुख हो गए, जिसमें कुल नाभिक का 81.3% था।

प्रति नाभिक 50,000 रीड पर अनुक्रमित नमूनों के लिए, गैर-एफएसीएस-सॉर्टेड नमूने के लिए प्रति नाभिक 25,010 जीन का पता लगाया गया था, और न्यून-नकारात्मक एफएएनएस नमूने के लिए 1, 665.5 जीन, एकल नाभिक की उच्च गुणवत्ता वाले ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग की पुष्टि करते हैं और एफएसीएस सॉर्टिंग बाद के एसएनआरएनए-सेक के लिए नाभिक को नुकसान नहीं पहुंचाती है। गैर-एफएसीएस-क्रमबद्ध नमूने में न्यूरॉन्स के उच्च अनुपात में गैर-एफएसीएस-क्रमबद्ध नमूने में 2,660 जीन प्रति नाभिक और 6,170 प्रतिलेख प्रति नाभिक की उच्च ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि थी, जिसमें 1,090 जीन प्रति नाभिक और 1,785 प्रतिलेख प्रति नाभिक की औसत ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि थी। एक बार जब इस प्रोटोकॉल के साथ डेटा उत्पन्न हो जाता है, तो किसी भी निष्कर्ष को मान्य करने के लिए इन नए ऑर्थोगोनल तरीकों जैसे कि विशेष लक्षण या विवो अध्ययनों पर विचार करना उचित है।