ネガティブFACSソーティングを使用してニューロンを除外する戦略は、成体海馬の神経新生の調節におけるそれらの役割を研究するために、神経幹細胞、星状細胞、希突起膠細胞などの低存在量の細胞集団の高品質のRNAシーケンシング率を生成します。この方法では、FACSゲーティングにおける抗体の選択を適応させることが可能であり、このプロトコルは歯状回に関連する様々な生物学的問題に対処する上で非常に汎用性が高い。この方法は、主に成人の海馬ニッチを調査するために設計されています。
ただし、他の幹細胞ニッチの研究に簡単に適応できます。手順を実演するのは、フランシスクリック研究所のポスドクトレーニングフェローであるサラアーメドデプラドです。まず、安楽死させたマウスから解剖した脳を、氷のように冷たいPBSで満たされた10センチメートルのペトリ皿に移します。
次に、ペトリ皿を氷の上に置き、矢状軸に沿って脳を半分に切ります。メスを使用して、小脳を取り除きます。脳の半分を、氷の上に置かれた氷の上に置かれた新しい10センチメートルのペトリ皿に移します。
双眼鏡を使用して歯状回(DG)を解剖し、この手順を繰り返して、脳の後半から2番目のDGを取得します。2つのDGを予冷したDounceホモジナイザーに移し、1ミリリットルのコールドホモジナイゼーションバッファー(HB)を加えます。緩いA乳棒を10ストローク、続いてタイトなB乳棒を15ストロークで組織を均質化します。ホモジネートをプレチルド15ミリリットルチューブに移します。
Dounceホモジナイザーを1ミリリットルの冷たいHBですすぎ、同じチューブと混ぜ合わせます。15ミリリットルのチューブに3ミリリットルのHBを加え、氷上で5分間インキュベートします。チューブを穏やかに反転させて、この核懸濁液を2回混合します。
0.5ミリリットルのHBを使用して、50ミリリットルの試験管の上に置かれた70マイクロメートルのストレーナーキャップを事前に湿らせ、次に0.5ミリリットルのHBでセルストレーナーを洗浄する前に核懸濁液を濾します。次に、セルストレーナーを取り外し、500 x gのスイングバケット遠心分離機で試験管を摂氏4度で5分間遠心分離します。上澄み液を捨てる。P1000ピペットを使用して、ペレットを4ミリリットルのHBに静かに再懸濁します。
氷上で5分間インキュベートした後、懸濁液を500 x gで摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を廃棄し、ペレットを3ミリリットルの洗浄媒体に再懸濁します。0.5ミリリットルの洗浄媒体を使用して、35マイクロメートルのストレーナーキャップを50ミリリットルの試験管で事前に濡らします。
次に、P1000ピペットを使用して、一度に0.5ミリリットルの懸濁液をピペッティングすることにより、核懸濁液を濾します。ストレーナーキャップを0.5ミリリットルの洗浄媒体で洗浄した後、チューブを氷の上に置きます。ろ液を新しい15ミリリットルのチューブに移し、500 x gで5分間、摂氏4度で遠心分離します。
上清を捨て、ペレットを3ミリリットルの洗浄媒体に再懸濁する。遠心分離を繰り返し、マウス抗NeuN、Alexa Fluor 488標識抗体、および1ミリリットルDAPIあたり1マイクログラムを含む1ミリリットルの洗浄培地にペレットを再懸濁します。暗所の氷上で45分間反応をインキュベートします。
蛍光活性化核選別(FANS)の場合は、免疫染色した核懸濁液を5ミリリットルの試験管に移し、フローサイトメトリー手順の開始まで氷上に置きます。チューブをFACS装置に入れる前に、サンプルを穏やかな強度で3秒間ボルテックスします。染色された核懸濁液からデータを取得するには、DAPI高さとDAPI領域にゲートを設定して、細胞破片と凝集核を除外します。
次に、ログ側散乱(SSC)領域と対数前方散乱(FSC)領域にゲートを設定して、残りのDAPI染色凝集体または細胞破片から単一の核を分離します。次に、抗NeuN-AF488およびFSC領域のゲートを設定して、NeuN-AF488陰性集団を分離します。分析後、ゲーティング戦略を使用して、50マイクロリットルの洗浄媒体で満たされた1.5ミリリットルの収集チューブで抗NeuN-AF488陰性集団を分類します。
選別が完了したら、1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含む1ミリリットルのPBSを収集チューブに加えて、チューブの壁から液滴を採取し、チューブを500 x gで5分間、摂氏4度で遠心分離します。上清を廃棄し、50マイクロリットルの溶質を残して遠心分離した核を再懸濁します。0.5ミリリットルのマイクロチューブに、5マイクロリットルの核懸濁液を5マイクロリットルのトリパンブルーに加えます。
核のライブラリ調製とシーケンシングを実行する前に、自動セルカウンターを使用して濃度を測定し、単一細胞懸濁液の生存率を評価します。バイオインフォマティクスクラスタリングにより、ファンの有無にかかわらず、DG内の既知の細胞型に対応する十分に分離された核群が明らかになりました。FACSで選別されていないサンプルでは、高品質の配列決定された核のほとんどは84.9%のニューロンでした。
これは3つのニューロン群から構成されており、歯状回で最も代表的な細胞集団が顆粒ニューロン、他の興奮性ニューロン、および抑制性ニューロンである可能性を示しています。FACSで選別されていないサンプルの中で、同定された非ニューロンクラスターは、主に星状細胞、希突起膠細胞、希突起膠細胞前駆細胞を含むグリア細胞タイプの11.1%、免疫細胞3.3%、および0,6%Cajal-Retzius細胞で構成されていました。NeuN陽性集団を除外するためにFANSを行っている間、グリア細胞のクラスターが顕著になり、全核の81.3%を占めました。
核当たり50, 000リードで配列決定されたサンプルでは、非FACSソーティングサンプルでは核当たり25, 010遺伝子、NeuN陰性FANSサンプルでは1, 665.5遺伝子が検出され、単一核の高品質なトランスクリプトミクスプロファイリングおよびFACSソーティングがその後のsnRNA-seqの核に損傷を与えないことを確認した。非FACS選別試料中のニューロンの高い割合は、核当たり1,090遺伝子および核当たり1,785転写産物の平均転写活性を有する非神経細胞型よりも、核当たり2,660遺伝子および核当たり6,170転写産物のより高い転写活性を有した。このプロトコルでデータが生成されたら、特別な症候学やin vivo研究などのこれらの新しい直交方法を検討して、調査結果を検証する価値があります。
