음성 FACS 정렬을 사용하여 뉴런을 배제하는 전략은 신경 줄기 세포, 성상 세포 및 희소돌기아교세포와 같은 낮은 존재비 세포 집단의 고품질 RNA 시퀀싱 속도를 생성하여 성인 해마 신경 발생의 조절에서 이들의 역할을 연구합니다. 이 방법을 사용하면 FACS 게이팅에서 항체 선택을 조정할 수 있으므로 이 프로토콜은 치아 이랑과 관련된 다양한 생물학적 질문을 해결하는 데 매우 다재다능합니다. 이 방법은 주로 성인 해마 틈새를 조사하기 위해 고안되었습니다.
그러나 다른 줄기 세포 틈새를 연구하는 데 쉽게 적용 할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 Francis Crick Institute의 박사후 과정 교육 연구원 인 Sara Ahmed de Prado가 될 것입니다. 시작하려면 안락사 된 마우스에서 해부 된 뇌를 얼음처럼 차가운 PBS로 채워진 10cm 페트리 접시에 옮깁니다.
그런 다음 페트리 접시를 얼음 위에 놓고 시상 축을 따라 뇌를 두 부분으로 자릅니다. 메스를 사용하여 소뇌를 제거하십시오. 뇌의 절반을 얼음 위에 놓인 새로운 10cm 페트리 접시에 옮기고 얼음처럼 차가운 PBS를 담습니다.
쌍안경을 사용하여 치아 이랑 또는 DG를 해부하고이 단계를 반복하여 뇌의 후반부에서 두 번째 DG를 얻습니다. 두 DG를 사전 냉각된 Dounce 균질화기로 옮기고 1밀리리터의 저온 균질화 완충액 또는 HB를 추가합니다. 느슨한 A 유봉을 10 회 스트로크 한 다음 단단한 B 유봉을 15 스트로크하여 조직을 균질화합니다. 균질 액을 사전 냉각 된 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다.
Dounce 균질 기를 1 밀리리터의 차가운 HB로 헹구고 동일한 튜브와 결합하십시오. 3 밀리리터 튜브에 15 밀리리터의 HB를 넣고 얼음 위에서 5 분 동안 배양하십시오. 이 핵 현탁액을 튜브를 부드럽게 뒤집어 두 번 혼합합니다.
0.5 밀리리터의 HB를 사용하여 50 밀리리터 시험관 위에 놓인 70 마이크로 미터 스트레이너 캡을 미리 적신 다음 0.5 밀리리터의 HB로 세포 스트레이너를 세척하기 전에 핵 현탁액을 변형시킵니다. 다음으로, 셀 스트레이너를 제거하고 스윙 버킷에서 시험관을 섭씨 4도에서 5분 동안 500 x g에서 원심분리합니다. 상청액을 폐기하십시오. P1000 피펫을 사용하여 4 밀리리터의 HB에 펠릿을 부드럽게 재현탁하십시오.
얼음 위에서 5분간 배양한 후, 현탁액을 섭씨 4도에서 500 x g에서 10분 동안 원심분리한다. 상청액을 버리고 3 밀리리터의 세척 매체에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 0.5 밀리리터의 세척 매체를 사용하여 35 밀리리터 테스트 튜브 위에 50 마이크로 미터 스트레이너 캡을 미리 적시십시오.
그런 다음 P1000 피펫을 사용하여 한 번에 0.5 밀리리터의 현탁액을 피펫팅하여 핵 현탁액을 변형시킵니다. 0.5 밀리리터의 세척제로 스트레이너 캡을 세척 한 후 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 여과액을 새 15 밀리리터 튜브로 옮기고 500 x g에서 5 분 및 섭씨 4도 동안 원심 분리합니다.
상청액을 버리고 펠릿을 3 밀리리터의 세척 매체에 재현탁하십시오. 원심분리를 반복하고, 펠렛을 마우스 항-NeuN, Alexa Fluor 488-접합 항체 및 1 마이크로그램 밀리리터 DAPI와 함께 세척 배지 1 밀리리터에 재현탁시킨다. 어두운 곳에서 얼음 위에서 45 분 동안 반응물을 배양하십시오.
형광 활성화 핵 분류 또는 FANS의 경우 면역 염색 핵 현탁액을 5 밀리리터 시험관으로 옮기고 유세포 분석 절차가 시작될 때까지 얼음 위에 놓습니다. 튜브를 FACS 기기에 넣기 전에 약한 강도로 샘플을 3초 동안 와류합니다. 염색된 핵 현탁액에서 데이터를 수집하려면 DAPI 높이와 DAPI 영역에 게이트를 설정하여 세포 파편과 응집된 핵을 제외합니다.
그런 다음 로그 측 산란 또는 SSC 영역 및 로그 전방 산란 또는 FSC 영역에 게이트를 설정하여 나머지 DAPI 염색 된 응집체 또는 세포 파편에서 단일 핵을 분리합니다. 그런 다음 anti-NeuN-AF488 및 FSC 영역에 대한 게이트를 설정하여 NeuN-AF488 음성 집단을 분리합니다. 분석 후, 게이팅 전략을 사용하여 50마이크로리터의 세척 매체로 채워진 1.5밀리리터 수집 튜브에서 anti-NeuN-AF488 음성 집단을 분류합니다.
분류가 완료되면 1% 소 혈청 알부민 또는 BSA가 포함된 PBS 1밀리리터를 수집 튜브에 추가하여 튜브 벽에서 물방울을 수집하고 튜브를 섭씨 4도에서 500 x g, 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 원심분리된 핵을 재현탁하기 위해 50마이크로리터의 용질을 남깁니다. 0.5 밀리리터 마이크로 튜브에서 5 마이크로 리터의 핵 현탁액을 5 마이크로 리터의 트리판 블루에 첨가하십시오.
농도를 측정하고 핵산의 라이브러리 준비 및 시퀀싱을 수행하기 전에 자동화된 세포 카운터를 사용하여 단일 세포 현탁액의 생존력을 평가합니다. 생물 정보학 클러스터링은 FANS가 있거나없는 DG 내의 알려진 세포 유형에 해당하는 잘 분리 된 핵 그룹을 나타 냈습니다. FACS로 분류되지 않은 샘플 내에서 대부분의 고품질 서열 핵은 뉴런의 84.9%였습니다.
그것은 세 그룹의 뉴런으로 구성되어 치아 이랑에서 가장 대표적인 세포 집단이 과립 뉴런, 다른 흥분성 뉴런 및 억제 뉴런일 가능성을 나타냅니다. FACS로 분류되지 않은 샘플 내에서 확인된 비뉴런 클러스터는 대부분 성상교세포, 희소돌기아교세포 및 희소돌기아교세포 전구체 세포, 3.3% 면역 세포 및 0, 6% Cajal-Retzius 세포를 포함한 11.1%의 신경교 세포 유형으로 구성되었습니다. NeuN 양성 집단을 배제하기 위해 FANS를 수행하는 동안 신경교 세포 클러스터가 전체 핵의 81.3%로 두드러졌습니다.
핵 당 50, 000 회 판독 된 샘플의 경우, 비 FACS 정렬 샘플의 경우 핵 당 25, 010 개의 유전자가 검출되었고, NeuN 음성 FANS 샘플에 대해 1, 665.5 개의 유전자가 검출되어 단일 핵의 고품질 전사체 프로파일 링 및 FACS 분류가 후속 snRNA-seq에 대한 핵을 손상시키지 않음을 확인했다. 비 FACS 분류 샘플에서 뉴런의 높은 비율은 핵 당 1, 090 개의 유전자 및 핵 당 1, 785 개의 전사 활성을 갖는 비 뉴런 세포 유형보다 비 FACS 정렬 샘플에서 핵 당 2, 660 개의 유전자 및 핵 당 6, 170 개의 전사체의 더 높은 전사 활성을 가졌다. 이 프로토콜로 데이터가 생성되면 결과를 검증하기 위해 특수 증상 또는 생체 내 연구와 같은 이러한 새로운 직교 방법을 고려해 볼 가치가 있습니다.
