2.1K Views
•
08:16 min
•
October 20th, 2022
DOI :
October 20th, 2022
•0:04
Introduction
1:08
Dissection of the Dentate Gyrus (DG)
1:53
Tissue Dissociation, Single Nuclei Isolation, and Anti-NeuN Immunostaining
4:03
Fluorescence Activated Nuclei Sorting (FANS) to Exclude Neuronal Populations
5:12
Preparation of the Single Nuclei Suspension to Perform Single Nuclei RNA Sequencing
5:59
Results: Preparation of a Suspension of Non-Neuronal Single Nuclei Isolated from the Dentate Gyrus (DG)
7:51
Conclusion
Transcript
Strategien for å ekskludere nevroner ved hjelp av negativ FACS-sortering genererer RNA-sekvenseringshastigheter av lav overflod av cellepopulasjon, som nevrale stamceller, astrocytter og oligodendrocytter, for å studere deres rolle i moduleringen av voksen hippocampal neurogenese. Med denne metoden er det mulig å tilpasse valg av antistoff i FACS-gating, noe som gjør denne protokollen svært allsidig i å ta opp ulike biologiske spørsmål knyttet til dentate gyrus. Denne metoden er primært utviklet for å undersøke den voksne hippocampale nisje.
Det kan imidlertid lett tilpasses for å studere andre stamcellenisjer. Demonstrere prosedyren vil være Sara Ahmed de Prado, postdoktor ved Francis Crick Institute. For å begynne, overfør hjernen dissekert fra den avlivede musen til en 10 centimeter petriskål fylt med iskald PBS.
Legg deretter petriskålen på is og skjær hjernen i to halvdeler langs sagittalaksen. Bruk en skalpell, fjern lillehjernen. Overfør den ene halvdelen av hjernen til den nye 10 centimeter petriskålen plassert på is, som inneholder iskald PBS.
Disseker dentate gyrus, eller DG, ved hjelp av kikkert, og gjenta dette trinnet for å oppnå den andre DG fra andre halvdel av hjernen. Overfør de to DG-ene til den forkjølte Dunce-homogenisatoren og tilsett 1 milliliter kald homogeniseringsbuffer, eller HB. Homogeniser vevet med 10 slag av den løse A-pestlen, etterfulgt av 15 slag av den stramme B-pestelen. Overfør homogenatet til et forkjølt 15 milliliter rør.
Skyll Dounce homogenisatoren med 1 milliliter kald HB og kombiner den med samme rør. Tilsett 3 milliliter HB til 15 milliliter røret, og inkuber i 5 minutter på is. Bland denne kjernesuspensjonen to ganger ved å snu røret forsiktig.
Ved å bruke 0,5 milliliter HB, forvåt den 70 mikrometer silhetten plassert over et 50 milliliter reagensrør, og sil deretter kjernesuspensjonen før du vasker cellesilen med 0,5 milliliter HB. Fjern deretter cellesilen og sentrifuger reagensrøret i en svingbøtte sentrifuge ved 500 x g i 5 minutter ved 4 grader Celsius. Kast supernatanten. Forsiktig resuspend pelleten i 4 milliliter HB ved hjelp av en P1000 pipette.
Etter 5 minutters inkubasjon på is, sentrifuger suspensjonen ved 500 x g i 10 minutter, ved 4 grader Celsius. Kast supernatanten og resuspend pelleten i 3 ml vaskemedium. Bruk 0,5 milliliter vaskemedium til å forhåndsvåt en 35 mikrometer silhette over et 50 milliliter reagensrør.
Sil deretter kjernesuspensjonen ved å pipettere 0,5 ml suspensjon om gangen, ved hjelp av en P1000-pipette. Etter vask av silhetten med 0,5 ml vaskemiddel, legg røret på is. Overfør filtratet til et nytt 15 milliliter rør og sentrifuger det i 5 minutter og 4 grader Celsius, ved 500 x g.
Kast supernatanten, og resuspend pelleten i 3 milliliter vaskemedium. Gjenta sentrifugeringen og resuspend pelleten i 1 milliliter vaskemedium med musens anti-NeuN, Alexa Fluor 488-konjugerte antistoff og 1 mikrogram per milliliter DAPI. Inkuber reaksjonen i 45 minutter på is i mørket.
For fluorescens aktivert kjernesortering, eller FANS, overfør den immunfargede kjernesuspensjonen til et 5 milliliter reagensrør, og legg det på is til starten av flowcytometriprosedyren. Vortex prøvene i 3 sekunder, med mild intensitet, før du plasserer rørene i FACS-instrumentet. For å skaffe dataene fra farget kjernesuspensjon, sett portene i DAPI-høyde og DAPI-området for å utelukke celleavfall og de aggregerte kjernene.
Sett deretter portene i loggsiden scatter, eller SSC, området, og log forward scatter, eller FSC, området, for å skille enkeltkjernene fra det gjenværende DAPI-flekkete aggregatet eller celleavfallet. Isoler deretter den NeuN-AF488-negative populasjonen ved å sette portene for anti-NeuN-AF488 og FSC-området. Etter analysen, sorter anti-NeuN-AF488 negativ populasjon i et 1,5 milliliter oppsamlingsrør fylt med 50 mikroliter vaskemedier ved hjelp av gating-strategien.
Når sorteringen er ferdig, tilsett 1 milliliter PBS som inneholder 1% bovint serumalbumin, eller BSA, til oppsamlingsrøret for å samle dråper fra rørets vegg og sentrifugere røret ved 500 x g, i 5 minutter, ved 4 grader Celsius. Kast supernatanten, og la 50 mikroliter løsemiddel for å resuspendere sentrifugerte kjerner. I et 0, 5 milliliter mikrorør tilsett 5 mikroliter av kjernesuspensjonen til 5 mikroliter Trypanblå.
Mål konsentrasjonen og vurder levedyktigheten til enkeltcellesuspensjonen ved hjelp av en automatisert celleteller før du utfører bibliotekets forberedelse og sekvensering av kjernene. Bioinformatisk clustering avslørte godt separerte grupper av kjerner som tilsvarer kjente celletyper i DG, med eller uten FANS. Innenfor den ikke-FACS-sorterte prøven var de fleste av de sekvenserte kjernene av høy kvalitet 84, 9% av nevronene.
Den besto av tre grupper av nevroner, noe som indikerer muligheten for at de mest representative cellepopulasjonene i dentate gyrus er granulatneuroner, andre eksitatoriske nevroner og hemmende nevroner. Innenfor den ikke-FACS-sorterte prøven ble de identifiserte ikke-nevronklyngene hovedsakelig laget av 11,1% av gliacelletyper, inkludert astrocytter, oligodendrocytter og oligodendrocyttforløperceller, 3,3% immunceller og 0, 6% Cajal-Retzius-celler. Mens de utførte FANS for å ekskludere NeuN-positive populasjoner, ble klyngene av gliaceller fremtredende, med 81,3% av de totale kjernene.
For prøvene sekvensert ved 50.000 avlesninger per kjerner, ble 25.010 gener detektert per kjerner for den ikke-FACS-sorterte prøven, og 1.665,5 gener for den NeuN-negative FANS-prøven, som bekrefter høykvalitets transkriptomisk profilering av enkeltkjerner og FACS-sortering skader ikke kjernene for påfølgende snRNA-seq. Den høye andelen nevroner i den ikke-FACS-sorterte prøven hadde en høyere transkripsjonsaktivitet på 2.660 gener per kjerner og 6.170 transkripsjoner per kjerne i den ikke-FACS-sorterte prøven enn de ikke-nevronale celletypene med gjennomsnittlig transkripsjonsaktivitet på 1.090 gener per kjerne og 1.785 transkripsjoner per kjerne. Når dataene er generert med denne protokollen, er det verdt å vurdere disse nye ortogonale metodene som spesielle symptomer eller in vivo-studier for å validere eventuelle funn.
Presentert her er en metode for å sekvensere enkeltkjerner isolert fra musen dentate gyrus som utelukker de fleste nevroner gjennom fluorescensaktiverte kjerner (FAN) -sortering. Denne tilnærmingen genererer uttrykksprofiler av høy kvalitet og letter studiet av de fleste andre celletyper som er representert i nisjen, inkludert knappe populasjoner som nevrale stamceller.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved