Fluorescensaktiverade kärnor negativ sortering av neuroner i kombination med enstaka kärnor RNA-sekvensering för att studera hippocampus neurogena nisch

Strategin att utesluta neuroner med negativ FACS-sortering genererar högkvalitativa RNA-sekvenseringshastigheter för cellpopulationer med låg överflöd, som neurala stamceller, astrocyter och oligodendrocyter, för att studera deras roll i moduleringen av vuxen hippocampusneurogenes. Med denna metod är det möjligt att anpassa valet av antikropp i FACS-gatingen, vilket gör detta protokoll mycket mångsidigt för att ta itu med olika biologiska frågor relaterade till dentate gyrus. Denna metod är främst utformad för att undersöka den vuxna hippocampala nischen.

Det kan dock lätt anpassas för att studera andra stamcellsnischer. Demonstrerar proceduren kommer att vara Sara Ahmed de Prado, postdoktor vid Francis Crick Institute. För att börja, överför hjärnan dissekerad från den avlivade musen till en 10 centimeter petriskål fylld med iskall PBS.

Lägg sedan petriskålen på is och skär hjärnan i två halvor längs sagittalaxeln. Använd en skalpell, ta bort cerebellum. Överför ena halvan av hjärnan till den nya petriskålen på 10 centimeter placerad på is, innehållande iskall PBS.

Dissekera dentate gyrus, eller DG, med kikare, och upprepa detta steg för att få den andra DG från andra halvan av hjärnan. Överför de två generaldirektoraten till den förkylda Dounce-homogenisatorn och tillsätt 1 ml kallhomogeniseringsbuffert, eller HB. Homogenisera vävnaden med 10 slag av den lösa A-stöten, följt av 15 slag av den täta B-stöten. Överför homogenatet till ett förkylt 15 ml rör.

Skölj Dounce-homogenisatorn med 1 ml kall HB och kombinera den med samma rör. Tillsätt 3 ml HB till 15 ml röret och inkubera i 5 minuter på is. Blanda denna kärnupphängning två gånger genom att vända röret försiktigt.

Använd 0,5 ml HB, förfukta 70 mikrometer sillocket placerat över ett 50 ml provrör och sila sedan kärnans suspension innan du tvättar cellsilen med 0,5 ml HB. Ta sedan bort cellsilen och centrifugera provröret i en svänghinkcentrifug vid 500 x g i 5 minuter vid 4 grader Celsius. Kassera supernatanten. Återsuspendera försiktigt pelleten i 4 ml HB med en P1000-pipett.

Efter 5 minuters inkubation på is, centrifugera suspensionen vid 500 x g i 10 minuter, vid 4 grader Celsius. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 3 ml tvättmedia. Använd 0,5 ml tvättmedia för att förväta ett sillock på 35 mikrometer över ett provrör på 50 ml.

Spänn sedan kärnsuspensionen genom att pipettera 0,5 ml suspension åt gången med användning av en P1000-pipett. Efter tvättning av sillocket med 0,5 ml tvättmedia, placera röret på is. Överför filtratet till ett nytt 15 ml rör och centrifugera det i 5 minuter och 4 grader Celsius, vid 500 x g.

Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 3 ml tvättmedia. Upprepa centrifugeringen och återsuspendera pelleten i 1 ml tvättmedia med musens anti-NeuN, Alexa Fluor 488-konjugerade antikropp och 1 mikrogram per milliliter DAPI. Inkubera reaktionen i 45 minuter på is i mörkret.

För fluorescensaktiverade kärnor, eller FANS, överför den immunfärgade kärnsuspensionen till ett 5 ml provrör och placera det på is tills flödescytometriproceduren börjar. Vörda proverna i 3 sekunder, med mild intensitet, innan rören placeras i FACS-instrumentet. För att få data från färgade kärnor, ställ in grindarna i DAPI-höjd och DAPI-området för att utesluta cellskräpet och de aggregerade kärnorna.

Ställ sedan in grindarna i loggsidans spridningsområde, eller SSC, och log forward-spridningsområdet, eller FSC-området, för att separera de enskilda kärnorna från det återstående DAPI-färgade aggregatet eller cellskräpet. Isolera sedan den NeuN-AF488-negativa befolkningen genom att ställa in grindarna för anti-NeuN-AF488- och FSC-området. Efter analysen, sortera den anti-NeuN-AF488 negativa befolkningen i ett 1,5 ml uppsamlingsrör fyllt med 50 mikroliter tvättmedia med hjälp av grindstrategin.

När sorteringen är klar, tillsätt 1 ml PBS innehållande 1% bovint serumalbumin, eller BSA, till uppsamlingsröret för att samla droppar från rörets vägg och centrifugera röret vid 500 x g, i 5 minuter, vid 4 grader Celsius. Kassera supernatanten och lämna 50 mikroliter löst för att återsuspendera centrifugerade kärnor. I ett 0,5 ml mikrorör tillsätt 5 mikroliter av kärnsuspensionen till 5 mikroliter Trypanblått.

Mät koncentrationen och bedöm livskraften hos encellssuspensionen med hjälp av en automatiserad cellräknare innan du utför biblioteksberedningen och sekvenseringen av kärnorna. Bioinformatisk klustring avslöjade väl separerade grupper av kärnor som motsvarar kända celltyper inom GD, med eller utan FANS. Inom det icke-FACS-sorterade provet var de flesta av de högkvalitativa sekvenserade kärnorna 84,9% av neuronerna.

Den bestod av tre grupper av neuroner, vilket indikerar möjligheten att de mest representativa cellpopulationerna i dentate gyrus är granulatneuroner, andra excitatoriska neuroner och hämmande neuroner. Inom det icke-FACS-sorterade provet var de identifierade icke-neuronala klusterna mestadels gjorda av 11,1% av gliacellstyperna, inklusive astrocyter, oligodendrocyter och oligodendrocytprekursorceller, 3,3% immunceller och 0, 6% Cajal-Retzius-celler. Medan man utförde FANS för att utesluta NeuN-positiva populationer blev klustren av gliaceller framträdande, med 81,3% av de totala kärnorna.

För proverna sekvenserade vid 50 000 läsningar per kärnor detekterades 25 010 gener per kärnor för det icke-FACS-sorterade provet och 1 665,5 gener för det NeuN-negativa FANS-provet, vilket bekräftar högkvalitativ transkriptomisk profilering av enstaka kärnor och FACS-sortering skadar inte kärnorna för efterföljande snRNA-seq. Den höga andelen neuroner i det icke-FACS-sorterade provet hade en högre transkriptionsaktivitet på 2 660 gener per kärnor och 6 170 transkript per kärna i det icke-FACS-sorterade provet än de icke-neuronala celltyperna med genomsnittlig transkriptionsaktivitet på 1 090 gener per kärna och 1 785 transkript per kärna. När data har genererats med detta protokoll är det värt att överväga dessa nya ortogonala metoder som speciella symptomika eller in vivo-studier för att validera eventuella fynd.