Name: super-resolution imaging of bacterial secreted proteins using genetic code expansion
Uploaded: 2023-02-10T13:23:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال أموال بدء التشغيل من الفرع الطبي بجامعة تكساس ، جالفستون ، تكساس ، وجائزة Texas STAR إلى LJ K. نشكر البروفيسور إدوارد ليمكي (مختبر البيولوجيا الجزيئية الأوروبي ، هايدلبرغ ، ألمانيا) على البلازميد pEVOL-PylRS-AF. تم إنشاء الصور في الشكل 1 باستخدام BioRender.

1. بناء البلازميد
<ol><li>استنساخ الجين الذي يعبر عن POI إلى تعبير بلازميد (على سبيل المثال ، pET28a-sseJ 10TAG) الذي يعبر عن POI في E. coli BL21 (DE3). تسهل هذه الخطوة تحديد أن المسوخ وظيفية.</li>
	<li>لتصور المستجيبات المفرزة السالمونيلا في الخلايا المضيفة ، قم ببناء تعبير بلازميد (pWSK29-sseJ-HA) ي...

<ol>
	<li>Marlovits, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+assembly+of+the+type+III+secretion+needle+complex.">Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex.</a> Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).</li><li>Kubori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+structure+of+the+Salmonella+typhimurium+type+III+protein+secretion+system.">Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system.</a> Science. 280 (5363), 602-605 (1998).</li><li>LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonellae+interactions+with+host+processes.">Salmonellae interactions with host processes.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).</li><li>Galan, J. E., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-injection+machines+in+bacteria.">Protein-injection machines in bacteria.</a> Cell. 172 (6), 1306-1318 (2018).</li><li>Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+by+phospho-OmpR+of+ssrA/B+gene+expression+in+Salmonella+pathogenicity+island+2.">Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2.</a> Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).</li><li>Walthers, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+response+regulator+SsrB+relieves+H-NS+silencing+by+displacing+H-NS+bound+in+polymerization+mode+and+directly+activates+transcription.">Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).</li><li>Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+DNA+biosensor+tracks+OmpR-dependent+acidification+of+Salmonella+during+macrophage+infection.">A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection.</a> PLoS Biology. 13 (4), e1002116 (2015).</li><li>Liew, A. T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell,+super-resolution+imaging+reveals+an+acid+pH-dependent+conformational+switch+in+SsrB+regulates+SPI-2.">Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2.</a> eLife. 8, e45311 (2019).</li><li>Knuff, K., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+the+SIF+is+happening-the+role+of+intracellular+Salmonella-induced+filaments.">What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335 (2017).</li><li>Drecktrah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+behavior+of+Salmonella-induced+membrane+tubules+in+epithelial+cells.">Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells.</a> Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).</li><li>Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+induces+the+formation+of+filamentous+structures+containing+lysosomal+membrane+glycoproteins+in+epithelial+cells.">Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).</li><li>Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+code+expansion+enables+visualization+of+Salmonella+type+three+secretion+system+components+and+secreted+effectors.">Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors.</a> elife. 10, e67789 (2021).</li><li>Singh, M. K., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+bacterial+pathogens+and+visualization+of+their+secreted+effectors.">Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors.</a> FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050 (2020).</li><li>Akeda, Y., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+release+and+unfolding+of+substrates+in+type+III+secretion.">Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion.</a> Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).</li><li>Su, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+as+tools+to+aid+protein+production.">Fluorescent proteins as tools to aid protein production.</a> Microbial Cell Factories. 4 (1), 12 (2005).</li><li>Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+development+of+photoactivatable+fluorescent+proteins+for+single-molecule-based+superresolution+imaging.">Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).</li><li>Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+specific+mislocalization+of+red+fluorescent+proteins+in+live+Escherichia+coli.">Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).</li><li>Gahlmann, A., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+bacterial+cell+biology+with+single-molecule+tracking+and+super-resolution+imaging.">Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging.</a> Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).</li><li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).</li><li>Gautier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+protein+tag+for+multiprotein+labeling+in+living+cells.">An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells.</a> Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).</li><li>Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+fluorescence+complementation+platform+for+visualizing+Salmonella+effector+proteins+reveals+distinctly+different+intracellular+niches+in+different+cell+types.">Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types.</a> ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).</li><li>Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell-based+optimization+of+the+biarsenical-binding+tetracysteine+motif+for+improved+fluorescence+and+affinity.">Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity.</a> Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li><li>Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pearling+transition+provides+evidence+of+force-driven+endosomal+tubulation+during+Salmonella+infection.">The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection.</a> mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).</li><li>Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SifA,+a+type+III+secreted+effector+of+Salmonella+typhimurium,+directs+Salmonella-induced+filament+(Sif)+formation+along+microtubules.">SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules.</a> Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).</li><li>Lang, K., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+incorporation+of+unnatural+amino+acids+and+bioorthogonal+labeling+of+proteins.">Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins.</a> Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).</li><li>Davis, L., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+proteins:+applications+of+genetic+code+expansion+in+cell+biology.">Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).</li><li>Chin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+p-azido-L-phenylalanine+to+the+genetic+code+of+Escherichia+coli.">Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).</li><li>Kipper, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+noncanonical+amino+acids+for+protein+labeling+in+a+genomically+recoded+Escherichia+coli.">Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).</li><li>Uttamapinant, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+code+expansion+enables+live-cell+and+super-resolution+imaging+of+site-specifically+labeled+cellular+proteins.">Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins.</a> Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).</li><li>Plass, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+for+Diels-Alder+reactions+in+living+cells.">Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).</li><li>Lang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+encoding+of+bicyclononynes+and+trans-cyclooctenes+for+site-specific+protein+labeling+in+vitro+and+in+live+mammalian+cells+via+rapid+fluorogenic+Diels-Alder+reactions.">Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-exploration+of+the+codon+context+effect+on+amber+codon-guided+incorporation+of+noncanonical+amino+acids+in+Escherichia+coli+by+the+blue-white+screening+assay.">Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay.</a> ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).</li><li>Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+tabulated+from+the+international+DNA+sequence+databases:+status+for+the+year+2000.">Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 292 (2000).</li><li>Spahn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+super-resolution+imaging+of+bacterial+regulatory+proteins:+the+nucleoid+and+the+cell+membrane+in+single,+fixed+E.+coli+cells.">Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).</li><li>Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy.">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li><li>Xu, J., Ma, H., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy+(STORM).">Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM).</a> Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).</li><li>Meineke, B., Heimg&#228;rtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Els&#228;sser, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+incorporation+of+two+ncAAs+for+two-color+bioorthogonal+labeling+and+crosslinking+of+proteins+on+live+mammalian+cells.">Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells.</a> Cell Reports. 31 (12), 107811 (2020).</li><li>Bessa-Neto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+labeling+of+transmembrane+proteins+with+non-canonical+amino+acids+unveils+masked+epitopes+in+live+neurons.">Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons.</a> Nature Communications. 12 (1), 6715 (2021).</li><li>Beliu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+labeling+with+tetrazine-dyes+for+super-resolution+microscopy.">Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy.</a> Communication Biology. 2, 261 (2019).</li><li>Arsi&#263;, A., Hagemann, C., Stajkovi&#263;, N., Schubert, T., Niki&#263;-Spiegel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+genetically+encoded+tags+for+fluorescent+protein+labeling+in+living+neurons.">Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons.</a> Nature Communications. 13 (1), 314 (2022).</li></ol>

تم استخدام النهج الموصوف هنا لتتبع الموقع الدقيق للبروتينات المستجيبة التي يتم حقنها في الخلية المضيفة بواسطة T3SS البكتيرية بعد الإصابة. يتم استخدام T3SSs بواسطة مسببات الأمراض داخل الخلايا مثل السالمونيلا والشيغيلة واليرسينيا لنقل مكونات الفوعة إلى المضيف. أتاح تطوير تقنيا...

منذ فترة طويلة تعتبر الالتهابات البكتيرية خطرا خطيرا على صحة الإنسان. تستخدم مسببات الأمراض أنظمة دفاعية متطورة للغاية وقوية للغاية ومعقدة ، بالإضافة إلى مجموعة متنوعة من عوامل الفوعة البكتيرية (يشار إليها باسم البروتينات المستجيبة) للتهرب من الاستجابات المناعية للمضيف وإنشاء العدوى 1,2. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه الأنظمة ودور البروتينات المستجيبة الفردية لا تزال غير معروفة إلى حد كبير بسبب ندرة الأساليب المناسبة للمتابعة المباشرة لمكونات البروتين الحاسمة والمستجيبات في الخلايا المضيفة أثناء التسبب في المرض.
أحد الأمثلة النموذجية هو السالمونيلا المعوية المصلية التيفية ، والتي تسبب التهاب المعدة والأمعاء الحاد. السالمونيلا يستخدم التيفيموريوم أنظمة إفراز من النوع الثالث (T3SS) لحقن مجموعة متنوعة من البروتينات المستجيبة مباشرة في الخلايا المضيفة. بمجرد دخول السالمونيلا إلى الخلية المضيفة ، فإنها تتواجد في حجرة حمضية مرتبطة بالغشاء ، تسمى الفجوة المحتوية على السالمونيلا (SCV) 3,4. ينشط الرقم الهيدروجيني الحمضي ل SCV جزيرة السالمونيلا المسببة للأمراض 2 (SPI-2) المشفرة T3SS وينقل وابل من 20 أو أكثر من البروتينات المستجيبة عبر الغشاء الفراغي إلى السيتوسول المضيف5،6،7،8. داخل المضيف ، تتلاعب هذه الكوكتيلات المعقدة من البروتينات المستجيبة بشكل منسق بمسارات إشارات الخلية المضيفة ، مما يؤدي إلى تكوين هياكل غشاء أنبوبي ديناميكية ومعقدة للغاية تمتد من SCV على طول الأنابيب الدقيقة ، والتي تسمى خيوط السالمونيلا التي يسببها (SIFs) ، والتي تمكن السالمونيلا من البقاء على قيد الحياة والتكاثر داخل الخلايا المضيفة9،10،11.
توفر طرق تصور وتتبع ومراقبة توطين المستجيبات البكتيرية ، وفحص الاتجار بها وتفاعلاتها داخل الخلايا المضيفة ، نظرة ثاقبة مهمة للآليات التي تقوم عليها الإمراضات البكتيرية. ثبت أن وضع العلامات وتوطين بروتينات المستجيب T3SS المفرزة في السالمونيلا داخل الخلايا المضيفة يمثل تحديا تقنيا12,13 ؛ ومع ذلك ، فإن تطوير البروتينات الفلورية المشفرة وراثيا قد حول قدرتنا على دراسة وتصور البروتينات داخل الأنظمة الحية. ومع ذلك ، فإن حجم البروتينات الفلورية (~ 25-30 كيلو دالتون)15 غالبا ما يكون مشابها أو أكبر من حجم البروتين محل الاهتمام (POI ؛ على سبيل المثال ، 13.65 كيلو دالتون ل SsaP ، 37.4 كيلو دالتون ل SifA). في الواقع ، غالبا ما يمنع وضع العلامات على البروتين الفلوري للمستجيبات إفراز المستجيب المسمى ويحشر T3SS14.
علاوة على ذلك ، فإن البروتينات الفلورية أقل استقرارا وتنبعث منها عدد قليل من الفوتونات قبل التبييض الضوئي ، مما يحد من استخدامها في التقنيات المجهرية فائقة الدقة16،17،18 ، لا سيما في الفحص المجهري لتوطين التنشيط الضوئي (PALM) ، STORM ، والمجهر المستنفد للانبعاثات المحفزة (STED). في حين أن الخصائص الفيزيائية الضوئية للأصباغ الفلورية العضوية تتفوق على تلك الخاصة بالبروتينات الفلورية ، فإن الطرق / التقنيات مثل CLIP / SNAP19,20 و Split-GFP 21 و ReAsH / FlAsH 22,23 و HA-Tags 24,25 تتطلب بروتينا إضافيا أو ملحقا ببتيديا قد يضعف وظيفة بنية البروتين المستجيب محل الاهتمام من خلال التدخل في التعديل أو الاتجار بعد الترجمة. تتضمن الطريقة البديلة التي تقلل من تعديل البروتين الضروري دمج NCAAs في POI أثناء الترجمة من خلال GCE. NCAAs إما فلورية أو يمكن صنعها فلورية عن طريق النقر على الكيمياء12،13،26،27،28.
باستخدام GCE ، يمكن إدخال NCAAs مع مجموعات صغيرة ووظيفية ومتعامدة حيويا (مثل مجموعة أزيد أو سيكلوبيروبين أو سيكلوكتين) في أي مكان تقريبا في البروتين المستهدف. في هذه الاستراتيجية، يتم تبديل كودون أصلي بكودون نادر مثل كودون توقف الكهرمان (TAG) في موضع محدد في جين POI. يتم التعبير عن البروتين المعدل لاحقا في الخلايا جنبا إلى جنب مع زوج متعامد من الأمينواسيل-الحمض النووي الريبي / الحمض النووي الريبي المتعامد. تم تصميم الموقع النشط لتخليق tRNA لاستقبال ncAA واحد معين فقط ، والذي يتم ربطه تساهميا بعد ذلك بنهاية 3'-end من tRNA الذي يتعرف على كودون العنبر. يتم إدخال ncAA ببساطة في وسط النمو ، ولكن يجب أن تمتصه الخلية وتصل إلى السيتوسول حيث يمكن ل aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) ربطه بالحمض النووي الريبي المتعامد. ثم يتم دمجها في نقطة الاهتمام في الموقع المحدد (انظر الشكل 1)12. وبالتالي ، تتيح GCE دمج عدد كبير من المجموعات التفاعلية المتعامدة الحيوية مثل الكيتون ، والأزيد ، والألكاين ، والسيكلوكتين ، والترانسسيكلوكتين ، والتترازين ، والنوربونين ، و α ، والأميد غير المشبع β ، و bicyclo [6.1.0] -nonyne في نقطة الاهتمام ، مما قد يتغلب على قيود طرق وضع العلامات على البروتين التقليدية12،26،27،28.
فتحت الاتجاهات الناشئة الحديثة في تقنيات التصوير فائقة الدقة آفاقا جديدة للتحقيق في الهياكل البيولوجية على المستوى الجزيئي. على وجه الخصوص ، أصبحت STORM ، وهي تقنية أحادية الجزيء ، قائمة على التوطين ، فائقة الدقة ، أداة لا تقدر بثمن لتصور الهياكل الخلوية حتى ~ 20-30 نانومتر وهي قادرة على التحقيق في العمليات البيولوجية جزيء واحد في كل مرة ، وبالتالي اكتشاف أدوار الجزيئات داخل الخلايا التي لم تكن معروفة بعد في الدراسات التقليدية ذات المتوسطالجماعي 13 . تتطلب تقنيات الجزيء الواحد والدقة الفائقة علامة صغيرة مع فلوروفورات عضوية ساطعة وقابلة للضوء للحصول على أفضل دقة. لقد أثبتنا مؤخرا أنه يمكن استخدام GCE لدمج مجسات مناسبة للتصوير فائق الدقة12.
اثنان من أفضل الخيارات لوضع العلامات على البروتين في الخلايا هما bicyclo [6.1.0] nonynelysine (BCN) و trans-cyclooctene-lysine (TCO ؛ كما هو موضح في الشكل 1) ، والتي يمكن ترميزها وراثيا باستخدام متغير من زوج tRNA / synthetase (يسمى هنا tRNA Pyl / PylRSAF) ، حيث يمثلPyl pyrrolysine ، ويمثل AF متحولا مزدوجا مصمما بشكل عقلاني (Y306A ، Y384F) مشتقا من Methanosarcina mazei الذي يشفر بشكل طبيعي pyrrolysine12 ، 29,30,31. من خلال تفاعل Diels-Alder cycloaddition (SPIEDAC) العكسي المعزز بالإجهاد ، تتفاعل هذه الأحماض الأمينية بشكل انتقائي كيميائيا مع اتحادات التترازين (الشكل 1)12،30،31. تفاعلات الإضافة الحلقية هذه سريعة بشكل استثنائي ومتوافقة مع الخلايا الحية. قد تكون أيضا فلورية ، إذا تم تشغيل الفلوروفور المناسب مع مجموعة Tetrazine12،26،32. تقدم هذه الورقة بروتوكولا محسنا لمراقبة ديناميكيات المستجيبات البكتيرية التي يتم توصيلها إلى الخلايا المضيفة باستخدام GCE ، يليها توطين تحت الخلية للبروتينات المفرزة في خلايا HeLa باستخدام dSTORM. تشير النتائج إلى أن دمج NCAA عبر GCE ، متبوعا بتفاعل نقر مع الأصباغ الحاملة للتترازين الفلورية ، يمثل طريقة متعددة الاستخدامات لوضع العلامات الانتقائية ، وتصور البروتينات المفرزة ، والتوطين دون الخلوي اللاحق في المضيف. ومع ذلك ، يمكن تعديل جميع المكونات والإجراءات المفصلة هنا أو استبدالها بحيث يمكن تكييف نظام الحملة العالمية للتعليم للتحقيق في الأسئلة البيولوجية الأخرى.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine SDS running buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A661-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulphate</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP212R-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>ThermiFischer Scientific</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Agar</td>
			<td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDP-FL-tetrazine</td>
			<td>Lumiprobe (USA)</td>
			<td>2.14E+02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>444203</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en &#8211; L - Lysine (TCO*A)</td>
			<td>SiChem GmbH</td>
			<td>SC-8008</td>
			<td>Size: 500 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (Hoechst33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeNovix DS-11+ Spectrophotometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM*</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>* Used for maintaining HeLa Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM**</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>**Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain BL21 (DE3)</td>
			<td>Novagen (Madison, WI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 897-BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>30123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>97203</td>
			<td>Pack of 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7141-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BF229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-C1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocloric acid</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image processing and analysis:&#160; http://rsbweb.nih.gov/ij</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>Coomassie-based stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janelia Fluoro 646-tetrazine</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;Manager (v. 1.4.2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pulser cuvette</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2086</td>
			<td>0.2 cm electrode gap, pkg. of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon N-STORM</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks</td>
			<td>ThermiFischer Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnipur Casamino Acid</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>2240</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehhyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (100x)</td>
			<td>GenDEPOT&#160;</td>
			<td>CA005-010</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL-PylRS-AF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For plasmid construction and map see following references 
			1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 
			2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Mini-prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: elife. 2021, 10, e67789.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pWSK29-sseJ-HA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: elife. 2021, 10, e67789.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>540025</td>
			<td>Protein grade, 10% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sulphate</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>424220250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>539131</td>
			<td>100x Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-HA primary antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. enterica. serovar Typhimurium 14028s</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036-50G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM), 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-C1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator Model 100</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>24932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system)</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThunderSTORM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://zitmen.github.io/thunderstorm/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (1x), 0.25%&#160;&#160;</td>
			<td>GenDEPOT&#160;</td>
			<td>CA014-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-well tissue culture chamber slides</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>94.6190.802</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of bacterial secreted proteins using genetic code expansion

تمكن أنظمة الإفراز من النوع الثالث (T3SSs) البكتيريا سالبة الجرام من حقن بطارية من البروتينات المستجيبة مباشرة في السيتوسول للخلايا المضيفة حقيقية النواة. عند الدخول ، تقوم البروتينات المستجيبة المحقونة بتعديل مسارات الإشارات حقيقية النواة بشكل تعاوني وإعادة برمجة الوظائف الخلوية ، مما يتيح دخول البكتيريا وبقائها. توفر مراقبة وتوطين هذه البروتينات المستجيبة المفرزة في سياق العدوى بصمة لتحديد الواجهة الديناميكية للتفاعلات بين المضيف والممرض. ومع ذلك ، فإن وضع العلامات وتصوير البروتينات البكتيرية في الخلايا المضيفة دون تعطيل هيكلها / وظيفتها يمثل تحديا تقنيا. 
إن بناء بروتينات الاندماج الفلورية لا يحل هذه المشكلة ، لأن بروتينات الاندماج تحشر الجهاز الإفرازي وبالتالي لا يتم إفرازها. للتغلب على هذه العقبات ، استخدمنا مؤخرا طريقة لوضع العلامات الفلورية الخاصة بالموقع على المستجيبات المفرزة البكتيرية ، بالإضافة إلى البروتينات الأخرى التي يصعب تصنيفها ، باستخدام توسيع الشفرة الوراثية (GCE). يوفر هذا البحث بروتوكولا كاملا خطوة بخطوة لتسمية المستجيبات المفرزة للسالمونيلا باستخدام موقع GCE على وجه التحديد ، متبوعا بتوجيهات لتصوير التوطين تحت الخلوي للبروتينات المفرزة في خلايا HeLa باستخدام مجهر إعادة البناء البصري العشوائي المباشر (dSTORM) 
تشير النتائج الحديثة إلى أن دمج الأحماض الأمينية غير المتعارف عليها (ncAAs) عبر GCE ، متبوعا بوضع العلامات المتعامدة الحيوية مع الأصباغ المحتوية على التترازين ، هو تقنية قابلة للتطبيق لوضع العلامات الانتقائية وتصور البروتينات المفرزة البكتيرية وتحليل الصور اللاحقة في المضيف. الهدف من هذه المقالة هو توفير بروتوكول مباشر وواضح يمكن استخدامه من قبل الباحثين المهتمين بإجراء تصوير فائق الدقة باستخدام GCE لدراسة العمليات البيولوجية المختلفة في البكتيريا والفيروسات ، وكذلك التفاعلات بين المضيف والممرض.

تصف ورقة البروتوكول هذه طريقة قائمة على GCE لوضع العلامات الفلورية الخاصة بالموقع وتصور مستجيبات السالمونيلا المفرزة ، كما هو موضح في الشكل 1. يظهر التركيب الكيميائي للمجموعة المتعامدة الحيوية عبر السيكلوكتين (TCO) الحاملة ncAA وصبغة الفلورسنت في <strong clas...

Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion at JoVE.com

Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion

توفر هذه المقالة بروتوكولا مباشرا وواضحا لتسمية المستجيبات المفرزة للسالمونيلا باستخدام موقع توسيع الشفرة الوراثية (GCE) على وجه التحديد وتصوير التوطين تحت الخلوي للبروتينات المفرزة في خلايا هيلا باستخدام مجهر إعادة البناء البصري العشوائي المباشر (dSTORM)

تصوير فائق الدقة للبروتينات المفرزة البكتيرية باستخدام توسيع الشفرة الوراثية

Type three secretion systems (T3SSs) enable gram-negative bacteria to inject a battery of effector proteins directly into the cytosol of eukaryotic host ...

يتغلب توسيع الشفرة الوراثية ، أو GCE ، على قيود استراتيجيات وضع العلامات الأخرى. إنها تمكننا من تحديد موقع البروتينات الموسومة على وجه التحديد ، ولدينا فلوروفورات عضوية ساطعة تمكن من تصورها ، حتى نتمكن من تجنب الاستراتيجيات التي تصنع ، على سبيل المثال ، اندماج البروتين الفلوري ، والذي يمكن أن يعطل وظيفة البروتين. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي نظام آخر.على سبيل المثال ، استخدمناه لتسمية بروتين زيكا أول أكسيد الكربون ، وهذا يمكننا من توفير وإنتاج فيروس زيكا المسمى الذي يمكننا بعد ذلك مراقبة إصابة الخلايا المضيفة. للبدء ، انقل 100 ميكرولتر من الثقافة الأولية إلى خمسة ملليلتر من وسط LB يحتوي على 35 ميكروغرام لكل مليلتر كلورامفينيكول و 100 ميكروغرام لكل ملليلتر أمبيسلين. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة حتى تصل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر إلى 0.6.استبدل الوسط LB بالوسط N-minimal المعدل المكمل ب TCO واحد مليمولار ، وهو حمض أميني غير قانوني. وتنمو البكتيريا عند 34 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أضف 0.2٪ أرابينوز ، و 25 ملليغرام لكل ملليلتر من الكلورامفينيكول ، و 100 ملليغرام لكل ملليلتر من الأمبيسلين ، وقم بتنمية الخلايا لمدة ست ساعات أخرى ، واهتز عند 250 دورة في الدقيقة.بعد ست ساعات ، اغسل البكتيريا أربع مرات على مدار 30 دقيقة باستخدام وسائط MgM الطازجة بدون أحماض أمينية غير قانونية أو ncAA. قم بطرد البكتيريا ، وأعد تعليقها في مخزن PBS المؤقت ، واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية في الظلام لإزالة NCAAs الزائدة. بعد ساعة واحدة ، قم بطرد البكتيريا عند 3،000 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، وقم بتخزينها لاستخدامها مرة أخرى.بالنسبة لتجربة التحكم ، كرر نفس التجربة عن طريق التعبير عن البروتينات الحاملة ل ncAA في حالة عدم وجود ncAA. إعادة تعليق خلايا السالمونيلا التي تعبر عن SseJ المدمجة مع TCO في غياب أو وجود TCO في PBS. اضبط الكثافة البصرية عند 600 نانومتر إلى أربعة في PBS ، واحتضن الخلايا ب 20 ميكرومولار Janelia Fluor 646 tetrazene أو 20 micromolar BDPFL tetrazine عند 37 درجة مئوية في الظلام ، واهتز لمدة ساعة إلى ساعتين عند 250 دورة في الدقيقة.حبيبات الخلايا وغسلها ثلاث إلى أربع مرات مع PBS التي تحتوي على 5٪ DMSO و 0.2٪ Pluronic F-127. أعد تعليق الحبيبات في برنامج تلفزيوني يحتوي على 5٪ DMSO. بعد الحضانة طوال الليل عند أربع درجات مئوية في الظلام ، اغسل مرتين مرة أخرى باستخدام برنامج تلفزيوني.تخيل الخلايا على الفور باستخدام مجهر متحد البؤر ، أو قم بتثبيتها باستخدام 1.5٪ بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني لمدة 30 إلى 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. استزراع خلايا هيلا والحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ رطوبة في نسبة الجلوكوز العالية DMEM مع 10٪ FBS بالإضافة إلى البنسلين الستربتومايسين. استزرع البكتيريا قبل يوم واحد من الإصابة وتلقيح مستعمرة واحدة من السالمونيلا من النوع البري التي تؤوي بلازميد pEVOL الذي يحتوي على زوج توليف tRNA المتعامد وبلازميد pWSK29 الذي يحتوي على جين SseJ في خمسة ملليمترات من المضادات الحيوية التي تحتوي على مرق LB القياسي بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة.إصلاح مخزون الخلايا المخففة عند 100،000 خلية لكل مليلتر والبذور 50،000 خلية HeLA لكل بئر في 500 ميكرولتر من DMEM تحتوي على 10٪ من وسط نمو FBS في شريحة من ثماني غرف جيدة. حافظ على شريحة الحجرة في حاضنة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ رطوبة. بالنسبة للعدوى البكتيرية ، فإن السالمونيلا من النوع البري التي تحتوي على بلازميد pEVOL وبلازميد pWSK29 المحتوي على جين SseJ عن طريق تخفيف 100 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية الليلية إلى ثلاثة ملليلتر من وسط LB يحتوي على 35 ميكروغرام لكل مليلتر كلورامفينيكول و 100 ميكروغرام لكل مليلتر أمبيسلين.احتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز عند 250 دورة في الدقيقة لمدة خمس إلى سبع ساعات. لبدء عدوى خلايا هيلا ، بعد إخراج خلايا هيلا من الحاضنة ، اغسل الخلايا باستخدام DPBS المسخن مسبقا ، وأضف 500 ميكرولتر من DMEM الطازج الذي يحتوي على 10٪ FBS إلى كل بئر. ضع شريحة الحجرة مرة أخرى في حاضنة ثاني أكسيد الكربون حتى تبدأ العدوى.بعد خمس إلى سبع ساعات من الحضانة ، قم بتخفيف ثقافة السالمونيلا بحيث تكون الكثافة البصرية عند 600 نانومتر 0.2 في ملليلتر واحد من وسط نمو DMEM ، وإضافة الكميات المطلوبة من لقاح السالمونيلا إلى كل بئر من شريحة الغرفة ، بحيث يكون تعدد العدوى 100. بعد احتضان الخلايا المصابة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام DPBS المسخن مسبقا لإزالة السالمونيلا خارج الخلية. اضبط هذه النقطة الزمنية على صفر ساعة بعد الإصابة ، وأضف 500 ميكرولتر من الوسط الكامل الذي يحتوي على 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الجنتاميسين لمدة ساعة واحدة.بعد الحضانة ، مرة أخرى ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام DPBS كما هو موضح سابقا وأضف 500 ميكرولتر من الوسط الكامل المكمل ب 0.2٪ أرابينوز ، 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من الجنتاميسين إلى كل بئر من شريحة الغرفة. في تجربة التحكم ، قم بإجراء عدوى مماثلة لخلايا هيلا بدون التكلفة الإجمالية للملكية. بعد احتضان شريحة الغرفة لمدة 10 ساعات في حاضنة ثاني أكسيد الكربون ، استبدل الوسط الكامل بوسط كامل جديد بدون TCO ، واغسل خلايا HeLa أربع مرات على مدار 30 دقيقة لكل منها DPBS مسخن مسبقا.ثم اغسل الخلايا بوسط كامل طازج بدون TCO. بعد 12 ساعة من الإصابة ، قم بشفط الوسط من الخلايا واغسل الخلية باستخدام DPBS المسخن مسبقا مرتين أو ثلاث مرات. في مجموعة واحدة من الآبار ، أضف 500 ميكرولتر من خليط محلول الصبغة واحد ، وفي مجموعة أخرى من آبار نفس شريحة الغرفة ، أضف 500 ميكرولتر من خليط محلول الصبغة اثنين.ضع الحجرة تنزلق مرة أخرى في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة ونصف إلى ساعتين. بعد 13.5 إلى 14 ساعة بعد الإصابة، اشطف خلايا هيلا مرتين باستخدام DPBS المسخن مسبقا، وأضف 500 ميكرولتر من DMEM الطازج المكمل ب FBS. بعد الحضانة لمدة 30 دقيقة ، اغسل الخلايا مرة أخرى باستخدام DPBS المسخن مسبقا كما هو موضح سابقا ، ثم اغسله باستخدام DMEM الطازج أربع مرات على مدار 30 دقيقة.في 16 ساعة بعد الإصابة ، قم بإصلاح خلايا HeLa باستخدام paraformaldehyde عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من 4٪ paraformaldehyde إلى كل بئر واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. نضح من بارافورمالدهيد. شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ، وتخزين الخلايا في برنامج تلفزيوني عند أربع درجات مئوية في الظلام.أحضر الخلايا إلى المجهر ، وضع غرفة التصوير على مرحلة المجهر في حامل العينة. ثم قم بتغيير الوسط في البئر باستخدام 0.4 ملليلتر من المخزن المؤقت للتصوير GLOX BME المصنوع حديثا. قلل طاقة الليزر إلى حوالي واحد ملي واط لتحديد خلية HeLa ذات الأهمية وضبط المستوى البؤري وزاوية شعاع الليزر أثناء إضاءة العينة بكثافة ليزر منخفضة تبلغ 647 نانومتر.اضبط زاوية إضاءة HILO. التقط مرجعا لصورة محدودة الكسر للهيكل المستهدف ، وقم بتبديل الفلوروفورات إلى الحالة المظلمة عن طريق تحويل الليزر إلى أقصى طاقته. اضبط كسب مكبر الصوت المسبق على ثلاثة وقم بتنشيط نقل الإطار.ثم اضبط كسب EM على 200 للحصول على حساسية أعلى في قياسات dSTORM. اضبط قوة الليزر على مستوى مناسب حيث يتم فصل الأحداث الوامضة في المكان والزمان. اضبط وقت التعرض على 30 مللي ثانية وابدأ عملية الاستحواذ.الحصول على 10،000 إلى 30،000 إطار. كرر عملية الاستحواذ المماثلة بعائد استثمار مختلف. لإعادة بناء صور dSTORM ، افتح الصورة J واستورد البيانات الأولية.افتح المكون الإضافي Thunderstorm ، وقم بتكوين إعداد الكاميرا المقابل للجهاز. انتقل إلى تشغيل التحليل وتعيين الإعدادات المناسبة ، مثل تصفية الصور وطرق الترجمة وتوطين البكسل الفرعي للجزيئات. انقر فوق موافق لبدء إعادة بناء الصورة وبدء تحليل النتيجة النهائية بعد المعالجة.يتم التعامل مع السالمونيلا التي تعبر عن SseJ المدمجة مع TCO مع Janelia Fluor 646 tetrazine ويتم تصويرها مع Janelia Fluor 646 fluorescence في غياب أو وجود TCO. يتم الكشف عن مضان SseJ فقط عند وجود TCO. تصاب خلايا هيلا بالسالمونيلا التي تؤوي psseJ-HA لمدة 16 ساعة ، وهي ثابتة ومناعية بالأجسام المضادة ل HA و LPS و DAPI.كما هو متوقع ، تتشكل خيوط السالمونيلا التي تسببها SseJ ، أو SIFs ، في الخلايا المصابة. في حالة عدم وجود TCO ، لا يتم قمع كودون الكهرمان ، و SIFs المعتمدة على SseJ غائبة في خلايا HeLa المصابة. لوحظت SIFs المعتمدة على SseJ في وجود TCO ، مما يشير بوضوح إلى أنه تم إنقاذ SseJ من خلال التعبير عن SseJF10TCOHA باستخدام توسيع الشفرة الجينية ، أو GCE.يتم عرض خصوصية وضع العلامات على SseJF10TCOHA المفرز في خلايا HeLa من خلال تفاعلات النقر SPIEDAC باستخدام اثنين من خليط الصبغة البديل الأول وخليط الصبغة الثاني موضحة هنا. انقر فوق صبغة تم استخدام Janelia Fluor 646 TZ أيضا لمراقبة ما إذا كان هناك أي علامات خلفية في خلايا HeLa المصابة بنوع Salmanella البري الذي يحمل SseJ HA في وجود TCO و P قبو البلازميد. تم إطلاق SseJ في السيتوبلازم للخلية المضيفة مع عدم وجود إشارات فلورية داخل الخلايا أو غير محددة توضح أن إشارة الفلورسنت كانت خاصة ب SseJ.يتم عرض تصوير فائق الدقة ل GCE المسمى SseJ في خلايا HeLa في هذا الشكل. تظهر هنا صورة برايت فيلد لخلية هيلا تحت الملاحظة. يتم عرض صورة المجال العريض المحدودة للحيود ل SseJ المفرز المسمى ب TCO و Janelia Fluor 646 وصورة dSTORM المقابلة ل SIFs المزينة ب SseJ هنا.يعرض الإدراج طريقة عرض مكبرة ل SseJ فائق الدقة في المنطقة المحاصرة. تم إعداد حلول مخزون NCAA في NaOH. لا تنس تحييده قبل أو بعد الإضافة إلى الوسائط.بعد وضع علامة على البروتين محل الاهتمام ، اغسل الخلية على نطاق واسع ، بحيث تكون إشارة الخلفية ضئيلة. باتباع إجراء الحملة العالمية للتعليم ، يمكننا الآن تسمية أي عامل ضراوة في البكتيريا ومتابعة نشاطه باستخدام تقنيات التصوير الخاصة بنا.

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

الدراسات الجينية البشرية البروتينات إصلاح الحمض النووي باستخدام خميرة كنظام النموذجي

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

رسم خرائط الشبكات الوظيفية البكتيرية والممرات في<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المصفوفات الوراثية الاصطناعية

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

فائقة التصوير القرار من ماكينات شعبة الجرثومي

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

عينات الاختبار لتحسين STORM فائقة الدقة المجهر

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

إعداد عينة للفحص المجهري للقوة الذرية Virion واحد والتصوير الفلوري فائقة الدقة

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

فائقة الدقة التصوير من Cytokinetic Z الدائري في البكتيريا تعيش طريق سريع منظم 3D الإضاءة المجهري (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

المتوازية الوراثية مع نيون البروتينات للتطبيقات المضاعفة

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Electroporation لل، عزل والتصوير من Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

المصدر المفتوح تحليل واحد الجسيمات لسوبر قرار المجهري مع VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

الدولة الأرض استنفاد القرار فائقة التصوير في خلايا الثدييات

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...