Name: super-resolution imaging of bacterial secreted proteins using genetic code expansion
Uploaded: 2023-02-10T13:23:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af opstartsmidler fra University of Texas Medical filial, Galveston, TX, og en Texas STAR-pris til L.J.K. Vi takker professor Edward Lemke (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Tyskland) for plasmidet pEVOL-PylRS-AF. Billeder i figur 1 blev oprettet ved hjælp af BioRender.

1. Plasmid konstruktion
<ol><li>Klon genet, der udtrykker POI'et, til et ekspressionsplasmid (f.eks. pET28a-sseJ 10TAG), der udtrykker POI i E. coli BL21 (DE3). Dette trin gør det lettere at bestemme, at mutanterne er funktionelle.</li>
	<li>Til visualisering af salmonellaudskillede effektorer i værtsceller konstrueres et ekspressionsplasmid (pWSK29-sseJ-HA), der udtrykker mål-POI SseJ under kontrol af dets oprindelige promotor, som beskrevet i tidligere rapporter...

<ol>
	<li>Marlovits, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+assembly+of+the+type+III+secretion+needle+complex.">Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex.</a> Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).</li><li>Kubori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+structure+of+the+Salmonella+typhimurium+type+III+protein+secretion+system.">Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system.</a> Science. 280 (5363), 602-605 (1998).</li><li>LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonellae+interactions+with+host+processes.">Salmonellae interactions with host processes.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).</li><li>Galan, J. E., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-injection+machines+in+bacteria.">Protein-injection machines in bacteria.</a> Cell. 172 (6), 1306-1318 (2018).</li><li>Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+by+phospho-OmpR+of+ssrA/B+gene+expression+in+Salmonella+pathogenicity+island+2.">Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2.</a> Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).</li><li>Walthers, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+response+regulator+SsrB+relieves+H-NS+silencing+by+displacing+H-NS+bound+in+polymerization+mode+and+directly+activates+transcription.">Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).</li><li>Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+DNA+biosensor+tracks+OmpR-dependent+acidification+of+Salmonella+during+macrophage+infection.">A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection.</a> PLoS Biology. 13 (4), e1002116 (2015).</li><li>Liew, A. T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell,+super-resolution+imaging+reveals+an+acid+pH-dependent+conformational+switch+in+SsrB+regulates+SPI-2.">Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2.</a> eLife. 8, e45311 (2019).</li><li>Knuff, K., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+the+SIF+is+happening-the+role+of+intracellular+Salmonella-induced+filaments.">What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335 (2017).</li><li>Drecktrah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+behavior+of+Salmonella-induced+membrane+tubules+in+epithelial+cells.">Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells.</a> Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).</li><li>Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+induces+the+formation+of+filamentous+structures+containing+lysosomal+membrane+glycoproteins+in+epithelial+cells.">Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).</li><li>Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+code+expansion+enables+visualization+of+Salmonella+type+three+secretion+system+components+and+secreted+effectors.">Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors.</a> elife. 10, e67789 (2021).</li><li>Singh, M. K., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+bacterial+pathogens+and+visualization+of+their+secreted+effectors.">Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors.</a> FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050 (2020).</li><li>Akeda, Y., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+release+and+unfolding+of+substrates+in+type+III+secretion.">Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion.</a> Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).</li><li>Su, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+as+tools+to+aid+protein+production.">Fluorescent proteins as tools to aid protein production.</a> Microbial Cell Factories. 4 (1), 12 (2005).</li><li>Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+development+of+photoactivatable+fluorescent+proteins+for+single-molecule-based+superresolution+imaging.">Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).</li><li>Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+specific+mislocalization+of+red+fluorescent+proteins+in+live+Escherichia+coli.">Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).</li><li>Gahlmann, A., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+bacterial+cell+biology+with+single-molecule+tracking+and+super-resolution+imaging.">Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging.</a> Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).</li><li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).</li><li>Gautier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+protein+tag+for+multiprotein+labeling+in+living+cells.">An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells.</a> Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).</li><li>Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+fluorescence+complementation+platform+for+visualizing+Salmonella+effector+proteins+reveals+distinctly+different+intracellular+niches+in+different+cell+types.">Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types.</a> ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).</li><li>Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell-based+optimization+of+the+biarsenical-binding+tetracysteine+motif+for+improved+fluorescence+and+affinity.">Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity.</a> Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li><li>Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pearling+transition+provides+evidence+of+force-driven+endosomal+tubulation+during+Salmonella+infection.">The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection.</a> mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).</li><li>Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SifA,+a+type+III+secreted+effector+of+Salmonella+typhimurium,+directs+Salmonella-induced+filament+(Sif)+formation+along+microtubules.">SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules.</a> Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).</li><li>Lang, K., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+incorporation+of+unnatural+amino+acids+and+bioorthogonal+labeling+of+proteins.">Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins.</a> Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).</li><li>Davis, L., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+proteins:+applications+of+genetic+code+expansion+in+cell+biology.">Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).</li><li>Chin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+p-azido-L-phenylalanine+to+the+genetic+code+of+Escherichia+coli.">Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).</li><li>Kipper, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+noncanonical+amino+acids+for+protein+labeling+in+a+genomically+recoded+Escherichia+coli.">Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).</li><li>Uttamapinant, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+code+expansion+enables+live-cell+and+super-resolution+imaging+of+site-specifically+labeled+cellular+proteins.">Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins.</a> Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).</li><li>Plass, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+for+Diels-Alder+reactions+in+living+cells.">Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).</li><li>Lang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+encoding+of+bicyclononynes+and+trans-cyclooctenes+for+site-specific+protein+labeling+in+vitro+and+in+live+mammalian+cells+via+rapid+fluorogenic+Diels-Alder+reactions.">Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-exploration+of+the+codon+context+effect+on+amber+codon-guided+incorporation+of+noncanonical+amino+acids+in+Escherichia+coli+by+the+blue-white+screening+assay.">Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay.</a> ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).</li><li>Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+tabulated+from+the+international+DNA+sequence+databases:+status+for+the+year+2000.">Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 292 (2000).</li><li>Spahn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+super-resolution+imaging+of+bacterial+regulatory+proteins:+the+nucleoid+and+the+cell+membrane+in+single,+fixed+E.+coli+cells.">Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).</li><li>Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy.">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li><li>Xu, J., Ma, H., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy+(STORM).">Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM).</a> Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).</li><li>Meineke, B., Heimg&#228;rtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Els&#228;sser, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+incorporation+of+two+ncAAs+for+two-color+bioorthogonal+labeling+and+crosslinking+of+proteins+on+live+mammalian+cells.">Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells.</a> Cell Reports. 31 (12), 107811 (2020).</li><li>Bessa-Neto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+labeling+of+transmembrane+proteins+with+non-canonical+amino+acids+unveils+masked+epitopes+in+live+neurons.">Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons.</a> Nature Communications. 12 (1), 6715 (2021).</li><li>Beliu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+labeling+with+tetrazine-dyes+for+super-resolution+microscopy.">Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy.</a> Communication Biology. 2, 261 (2019).</li><li>Arsi&#263;, A., Hagemann, C., Stajkovi&#263;, N., Schubert, T., Niki&#263;-Spiegel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+genetically+encoded+tags+for+fluorescent+protein+labeling+in+living+neurons.">Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons.</a> Nature Communications. 13 (1), 314 (2022).</li></ol>

Den fremgangsmåde, der er beskrevet heri, blev brugt til at spore den nøjagtige placering af effektorproteiner, der injiceres i værtscellen af bakterien T3SS efter infektion. T3SS'er anvendes af intracellulære patogener såsom Salmonella, Shigella og Yersinia til at transportere virulenskomponenter ind i værten. Udviklingen af billeddannelsesteknologier med superopløsning har gjort det muligt at visualisere virulensfaktorer ved en tidligere ufattelig opløsning12,13,24</...

Bakterielle infektioner har længe været betragtet som en alvorlig fare for menneskers sundhed. Patogener bruger højt udviklede, ekstremt kraftfulde og indviklede forsvarssystemer samt en række bakterielle virulensfaktorer (kaldet effektorproteiner) for at undgå værtsimmunresponser og etablere infektioner 1,2. Imidlertid er de molekylære mekanismer, der ligger til grund for disse systemer, og rollen som individuelle effektorproteiner stadig stort set ukendte på grund af manglen på egnede tilgange til direkte at følge de afgørende proteinkomponenter og effektorer i værtsceller under patogenese.
Et typisk eksempel er Salmonella enterica serovar Typhimurium, som forårsager akut gastroenteritis. Salmonella Typhimurium bruger type tre sekretionssystemer (T3SS) til at injicere en række effektorproteiner direkte i værtsceller. Så snart salmonella kommer ind i værtscellen, befinder den sig i et surt membranbundet rum, kaldet den salmonellaholdige vakuol (SCV)3,4. SCV's sure pH aktiverer Salmonella patogenicitetsø 2 (SPI-2)-kodet T3SS og translokerer en volley af 20 eller flere effektorproteiner over den vakuolære membran ind i værtscytosolen 5,6,7,8. Inde i værten manipulerer disse komplekse cocktails af effektorproteiner værtscellesignalveje koordineret, hvilket resulterer i dannelsen af meget dynamiske, komplekse rørformede membranstrukturer udvidet fra SCV langs mikrotubuli, kaldet Salmonella-inducerede filamenter (SIF'er), der gør det muligt for Salmonella at overleve og replikere i værtscellerne9,10,11.
Metoder til at visualisere, spore og overvåge bakterielle effektorlokaliseringer og undersøge deres handel og interaktioner inde i værtsceller giver kritisk indsigt i de mekanismer, der understøtter bakteriel patogenese. Mærkning og lokalisering af salmonellaudskillede T3SS-effektorproteiner inde i værtsceller har vist sig at være en teknologisk udfordring12,13; Ikke desto mindre har udviklingen af genetisk kodede fluorescerende proteiner ændret vores evne til at studere og visualisere proteiner i levende systemer. Imidlertid er størrelsen af fluorescerende proteiner (~ 25-30 kDa)15 ofte sammenlignelig med eller endda større end størrelsen af det pågældende protein (POI; f.eks. 13,65 kDa for SsaP, 37,4 kDa for SifA). Faktisk blokerer fluorescerende proteinmærkning af effektorer ofte udskillelsen af den mærkede effektor og syltetøj T3SS14.
Desuden er fluorescerende proteiner mindre stabile og udsender et lavt antal fotoner før fotoblegning, hvilket begrænser deres anvendelse i superopløsningsmikroskopiske teknikker16,17,18, især i fotoaktiveringslokaliseringsmikroskopi (PALM), STORM og stimuleret emissionsudtømning (STED) mikroskopi. Mens de fotofysiske egenskaber ved organiske fluorescerende farvestoffer er bedre end fluorescerende proteiner, kræver metoder / teknikker som CLIP / SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH / FlAsH 22,23 og HA-Tags 24,25 et yderligere protein- eller peptidvedhæng, der kan forringe strukturfunktionen af effektorproteinet af interesse ved at forstyrre posttranslationel modifikation eller handel. En alternativ metode, der minimerer nødvendig proteinmodifikation, involverer inkorporering af ncAA'er i et POI under oversættelse gennem GCE. NCA'erne er enten fluorescerende eller kan gøres fluorescerende via klikkemi 12,13,26,27,28.
Ved hjælp af GCE kan ncAA'er med små, funktionelle, bioortogonale grupper (såsom et azid-, cyclopropen- eller cyclooctyne-gruppe) introduceres næsten ethvert sted i et målprotein. I denne strategi byttes et naturligt codon ud med et sjældent kodon, såsom et gult (TAG) stopcodon på en bestemt position i POI'ets gen. Det modificerede protein udtrykkes efterfølgende i celler sammen med et ortogonalt aminoacyl-tRNA-syntetase/tRNA-par. Det tRNA-syntetaseaktive sted er designet til kun at modtage en bestemt ncAA, som derefter er kovalent bundet til 3'-enden af tRNA'et, der genkender det gule kodon. ncAA indføres simpelthen i vækstmediet, men det skal optages af cellen og nå cytosolen, hvor aminoacyl-tRNA-syntetasen (aaRS) kan forbinde den med det ortogonale tRNA; Det inkorporeres derefter i IP'et på det angivne sted (se figur 1)12. GCE muliggør således stedspecifik inkorporering af en overflod af bio-ortogonale reaktive grupper såsom keton, azid, alkyn, cyclooctyn, transcycloocten, tetrazin, norbonen, α, β-umættet amid og bicyclo [6.1.0]-nonyne i et POI, hvilket potentielt overvinder begrænsningerne ved konventionelle proteinmærkningsmetoder 12,26,27,28.
De seneste nye tendenser inden for billeddannelsesteknikker med superopløsning har åbnet nye veje til at undersøge biologiske strukturer på molekylært niveau. Især STORM, en lokaliseringsbaseret superopløsningsteknik med et enkelt molekyle, er blevet et uvurderligt værktøj til at visualisere cellulære strukturer ned til ~ 20-30 nm og er i stand til at undersøge biologiske processer et molekyle ad gangen og derved opdage rollerne af intracellulære molekyler, der endnu er ukendte i traditionelle ensemble-gennemsnitlige undersøgelser13 . Enkeltmolekyle- og superopløsningsteknikker kræver et lille mærke med lyse, fototable organiske fluoroforer for den bedste opløsning. Vi demonstrerede for nylig, at GCE kan bruges til at inkorporere egnede sonder til superopløsningsbilleddannelse12.
To af de bedste valg til proteinmærkning i celler er bicyclo [6.1.0] nonynelysin (BCN) og transcycloocten-lysin (TCO; vist i figur 1), som kan genetisk kodes ved hjælp af en variant af tRNA / syntetaseparret (her kaldet tRNA Pyl / PylRS AF), hvorPyl repræsenterer pyrrolysin, ogAF repræsenterer en rationelt designet dobbeltmutant (Y306A, Y384F) afledt af Methanosarcina-labyrint, der naturligt koder for pyrrolysin12, 29,30,31. Gennem den stamme-fremmet inverse elektron-efterspørgsel Diels-Alder cycloaddition (SPIEDAC) reaktion, reagerer disse aminosyrer kemoselektivt med tetrazin konjugater (figur 1)12,30,31. Sådanne cycloadditionsreaktioner er usædvanligt hurtige og kompatible med levende celler; De kan også være fluorogene, hvis en passende fluorofor er funktionaliseret med tetrazindelen12,26,32. Dette papir præsenterer en optimeret protokol til overvågning af dynamikken i bakterielle effektorer leveret til værtsceller ved hjælp af GCE, efterfulgt af subcellulær lokalisering af udskillede proteiner i HeLa-celler ved hjælp af dSTORM. Resultaterne indikerer, at inkorporering af en ncAA via GCE, efterfulgt af en klikreaktion med fluorogene tetrazinbærende farvestoffer, repræsenterer en alsidig metode til selektiv mærkning, visualisering af udskillede proteiner og efterfølgende subcellulær lokalisering i værten. Alle de komponenter og procedurer, der er beskrevet her, kan dog justeres eller erstattes, så GCE-systemet kan tilpasses til at undersøge andre biologiske spørgsmål.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine SDS running buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A661-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulphate</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP212R-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>ThermiFischer Scientific</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Agar</td>
			<td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDP-FL-tetrazine</td>
			<td>Lumiprobe (USA)</td>
			<td>2.14E+02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>444203</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en &#8211; L - Lysine (TCO*A)</td>
			<td>SiChem GmbH</td>
			<td>SC-8008</td>
			<td>Size: 500 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (Hoechst33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeNovix DS-11+ Spectrophotometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM*</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>* Used for maintaining HeLa Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM**</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>**Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain BL21 (DE3)</td>
			<td>Novagen (Madison, WI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 897-BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>30123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>97203</td>
			<td>Pack of 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7141-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BF229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-C1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocloric acid</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image processing and analysis:&#160; http://rsbweb.nih.gov/ij</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>Coomassie-based stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janelia Fluoro 646-tetrazine</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;Manager (v. 1.4.2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pulser cuvette</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2086</td>
			<td>0.2 cm electrode gap, pkg. of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon N-STORM</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks</td>
			<td>ThermiFischer Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnipur Casamino Acid</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>2240</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehhyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (100x)</td>
			<td>GenDEPOT&#160;</td>
			<td>CA005-010</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL-PylRS-AF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For plasmid construction and map see following references 
			1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 
			2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Mini-prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: elife. 2021, 10, e67789.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pWSK29-sseJ-HA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: elife. 2021, 10, e67789.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>540025</td>
			<td>Protein grade, 10% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sulphate</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>424220250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>539131</td>
			<td>100x Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-HA primary antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. enterica. serovar Typhimurium 14028s</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036-50G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM), 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-C1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator Model 100</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>24932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system)</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThunderSTORM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://zitmen.github.io/thunderstorm/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (1x), 0.25%&#160;&#160;</td>
			<td>GenDEPOT&#160;</td>
			<td>CA014-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-well tissue culture chamber slides</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>94.6190.802</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of bacterial secreted proteins using genetic code expansion

Type tre sekretionssystemer (T3SS'er) gør det muligt for gramnegative bakterier at injicere et batteri af effektorproteiner direkte i cytosolen i eukaryote værtsceller. Ved indgangen modulerer de injicerede effektorproteiner kooperativt eukaryote signalveje og omprogrammerer cellulære funktioner, hvilket muliggør bakteriel indgang og overlevelse. Overvågning og lokalisering af disse udskillede effektorproteiner i forbindelse med infektioner giver et fodaftryk til at definere den dynamiske grænseflade mellem værtspatogeninteraktioner. Imidlertid er mærkning og billeddannelse af bakterielle proteiner i værtsceller uden at forstyrre deres struktur / funktion teknisk udfordrende. 
Konstruktion af fluorescerende fusionsproteiner løser ikke dette problem, fordi fusionsproteinerne sidder fast i sekretorisk apparat og dermed ikke udskilles. For at overvinde disse forhindringer anvendte vi for nylig en metode til stedspecifik fluorescerende mærkning af bakterielle udskillede effektorer samt andre proteiner, der er vanskelige at mærke, ved hjælp af genetisk kodeudvidelse (GCE). Dette papir giver en komplet trin-for-trin protokol til mærkning af salmonellaudskillede effektorer ved hjælp af GCE stedspecifikt, efterfulgt af anvisninger til billeddannelse af subcellulær lokalisering af udskillede proteiner i HeLa-celler ved hjælp af direkte stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM)
Nylige resultater tyder på, at inkorporering af ikke-kanoniske aminosyrer (ncAA'er) via GCE, efterfulgt af bio-ortogonal mærkning med tetrazinholdige farvestoffer, er en levedygtig teknik til selektiv mærkning og visualisering af bakterielle udskillede proteiner og efterfølgende billedanalyse i værten. Målet med denne artikel er at give en ligetil og klar protokol, der kan anvendes af efterforskere, der er interesserede i at udføre superopløsningsbilleddannelse ved hjælp af GCE til at studere forskellige biologiske processer i bakterier og vira samt værtspatogeninteraktioner.

Dette protokolpapir beskriver en GCE-baseret metode til stedspecifik fluorescerende mærkning og visualisering af salmonellaudskillede effektorer, som vist i figur 1. Den kemiske struktur af den ncAA-bærende transcyclooctenbioortogonale gruppe (TCO) og det fluorescerende farvestof er vist i figur 1A. SseJ-mærkning blev opnået ved genetisk inkorporering af bioortogonale ncAA'er ved et gult stopkodon (se <strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion at JoVE.com

Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion

Denne artikel giver en ligetil og klar protokol til mærkning af salmonellaudskillede effektorer ved hjælp af genetisk kodeudvidelse (GCE) stedspecifikt og billede af subcellulær lokalisering af udskillede proteiner i HeLa-celler ved hjælp af direkte stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM)

Superopløsningsbilleddannelse af bakterielle udskillede proteiner ved hjælp af genetisk kodeudvidelse

Type three secretion systems (T3SSs) enable gram-negative bacteria to inject a battery of effector proteins directly into the cytosol of eukaryotic host ...

Genetisk kodeudvidelse, eller GCE, overvinder begrænsninger af andre mærkningsstrategier. Det gør det muligt for os at placere specifikt mærkede proteiner, og vi har lyse organiske fluoroforer, der muliggør deres visualisering, så vi kan undgå strategier, der for eksempel laver fluorescerende proteinfusioner, som kan forstyrre proteinfunktionen. Denne metode kan anvendes på ethvert andet system.For eksempel har vi brugt det til at mærke Zika CO-protein, og det gør det muligt for os at levere og producere mærket Zika-virus, som vi derefter kan observere inficere værtsceller. Til at begynde med overføres 100 mikroliter primærkultur til fem ml LB-medium indeholdende 35 mikrogram pr. milliliter chloramphenicol og 100 mikrogram pr. milliliter ampicillin. Inkuber ved 37 grader Celsius med omrystning ved 250 RPM, indtil den optiske densitet ved 600 nanometer når 0,6.LB-substratet erstattes med det modificerede N-minimalmedium suppleret med en millimolær TCO, en ikke-kanonisk aminosyre. Og dyrk bakterierne ved 34 grader Celsius i 30 minutter. Tilsæt 0,2% arabinose, 25 milligram pr. milliliter chloramphenicol og 100 milligram pr. milliliter ampicillin, og dyrk cellerne i yderligere seks timer og ryst ved 250 RPM.Efter seks timer vaskes bakterierne fire gange over et interval på 30 minutter med friske MgM-medier uden ikke-kanoniske aminosyrer eller ncAA. Centrifuger bakterierne, genopslæv i PBS-buffer og inkuber i en time ved fire grader Celsius i mørke for at fjerne overskydende ncAA'er. Efter en time centrifugeres bakterierne ved 3.000 G i 15 minutter ved fire grader Celsius og opbevares til videre brug.For et kontroleksperiment gentages det samme eksperiment ved at udtrykke ncAA-bærende proteiner i fravær af ncAA. Salmonellaceller, der udtrykker SseJ inkorporeret med TCO, suspenderes igen ved fravær eller tilstedeværelse af TCO i PBS. Juster den optiske tæthed ved 600 nanometer til fire i PBS, og inkuber cellerne med 20 mikromolær Janelia Fluor 646 tetrazen eller 20 mikromolær BDPFL tetrazin ved 37 grader Celsius i mørket, og ryst i en til to timer ved 250 RPM.Ppellet cellerne og vask tre til fire gange med PBS indeholdende 5% DMSO og 0,2% Pluronic F-127. Re-suspendering pellet i PBS indeholdende 5% DMSO. Efter inkubation natten over ved fire grader Celsius i mørke, vask to gange igen med PBS.Tag straks billeder af cellerne ved hjælp af et konfokalmikroskop, eller fastgør dem med 1,5% paraformaldehyd i PBS i 30 til 45 minutter ved stuetemperatur i mørke. Dyrk og vedligehold HeLa-celler ved 37 grader Celsius, 5% kuldioxid og 95% fugtighed i DMEM med høj glukose suppleret med 10% FBS ud over penicillin streptomycin. Dyrk bakterier en dag før infektion og pod en enkelt koloni af vildtype salmonella, der huser pEVOL-plasmid indeholdende ortogonalt tRNA-syntetasepar og pWSK29-plasmid indeholdende SseJ-gen i fem millimeter antibiotika indeholdende standard LB-bouillon natten over ved 37 grader Celsius med omrystning ved 250 RPM.Reparer en fortyndet cellebestand ved 100.000 celler pr. milliliter og frø 50.000 HeLA-celler pr. Brønd i 500 mikroliter DMEM indeholdende 10% FBS-vækstmedium i et otte brøndkammerglas. Hold kammeret glide i en inkubator i 24 timer ved 37 grader Celsius, 5% kuldioxid og 95% fugtighed. Til bakteriel infektion, subkultur vildtype salmonella huser pEVOL plasmid og pWSK29 plasmid indeholdende SseJ gen ved fortynding 100 mikroliter natten over bakteriekultur i tre ml LB medium indeholdende 35 mikrogram per milliliter chloramphenicol og 100 mikrogram per milliliter ampicillin.Inkuber ved 37 grader Celsius med omrystning ved 250 RPM i fem til syv timer. For at starte HeLa-celleinfektionen, efter at HeLa-cellerne er taget ud af inkubatoren, skal du vaske cellerne med forvarmet DPBS og tilføje 500 mikroliter frisk DMEM indeholdende 10% FBS til hver brønd. Placer kammeret glide tilbage i kuldioxidinkubatoren, indtil infektionen begynder.Efter fem til syv timers inkubation fortyndes salmonellakulturen, så den optiske densitet ved 600 nanometer er 0,2 i en milliliter DMEM-vækstmedium, og tilsæt de nødvendige mængder salmonellainokulum til hver brønd i kammerobjektglasset, således at infektionsmultipliciteten er 100. Efter inkubation af de inficerede celler i en kuldioxidinkubator i 30 minutter vaskes cellerne tre gange med forvarmet DPBS for at fjerne ekstracellulær salmonella. Indstil dette tidspunkt til nul timer efter infektion, og tilsæt 500 mikroliter komplet medium indeholdende 100 mikrogram pr. Milliliter gentamicin i en time.Efter inkubation vaskes cellerne igen tre gange med DPBS som vist tidligere og tilsættes 500 mikroliter af det komplette medium suppleret med 0,2% arabinose, 10 mikrogram pr. milliliter gentamicin til hver brønd i kammerobjektglasset. I et kontroleksperiment udføres lignende infektioner af HeLa-celler uden TCO. Efter inkubation af kammerobjektglasset i 10 timer i kuldioxidinkubatoren skal du udskifte det komplette medium med frisk komplet medium uden TCO og vaske HeLa-cellerne fire gange over et interval på 30 minutter hver med forvarmet DPBS.Vask derefter cellerne med frisk komplet medium uden TCO. Efter 12 timer efter infektion aspireres mediet fra cellerne og vaskes cellen med forvarmet DPBS to eller tre gange. I en gruppe af brøndene tilsættes 500 mikroliter farvestofopløsningsblanding en, og i en anden gruppe af brøndene i samme kammerglas tilsættes 500 mikroliter farvestofopløsningsblanding to.Placer kammeret glider tilbage i kuldioxidinkubatoren i en og 1/2 til to timer. Efter 13,5 til 14 timer efter infektion skylles HeLa-cellerne to gange med forvarmet DPBS, og der tilsættes 500 mikroliter frisk DMEM suppleret med FBS. Efter inkubation i 30 minutter vaskes cellerne igen med forvarmet DPBS som vist tidligere, og vaskes derefter med frisk DMEM fire gange over et interval på 30 minutter.16 timer efter infektion fastgøres HeLa-cellerne med paraformaldehyd ved at tilsætte 200 mikroliter 4% paraformaldehyd til hver brønd og inkubere i 10 minutter ved stuetemperatur i mørke. Aspirer paraformaldehydet af. Skyl tre gange med PBS, og opbevar cellerne i PBS ved fire grader Celsius i mørke.Bring cellerne til mikroskopet, og placer billeddannelseskammeret på mikroskopstadiet i prøveholderen. Skift derefter mediet i brønden med 0,4 ml af den frisklavede GLOX BME-billedbuffer. Reducer lasereffekten til omkring en milliwatt for at identificere en HeLa-celle af interesse og justere brændplanet og laserstrålevinklen, mens prøven belyses med lave 647 nanometer lasertætheder.Juster HILO-belysningsvinklen. Optag en reference til brøkbegrænset billede af målstrukturen, og skift fluoroforerne til den mørke tilstand ved at dreje laseren til sin maksimale effekt. Indstil forstærkningen til tre, og aktiver rammeoverførslen.Indstil derefter EM-forstærkning til 200 for højere følsomhed i dSTORM-målinger. Juster laserstyrken til et passende niveau, hvor blinkende hændelser adskilles i rum og tid. Indstil eksponeringstiden til 30 millisekunder, og start anskaffelsen.Erhverv 10.000 til 30.000 rammer. Gentag den lignende erhvervelse ved forskellige ROI'er. Til billedrekonstruktion af dSTORM skal du åbne billede J og importere rådataene.Åbn Thunderstorm-pluginet, og konfigurer kameraindstillingen, der svarer til enheden. Gå til kør analyse, og indstil de relevante indstillinger, såsom billedfiltrering, lokaliseringsmetoder og subpixellokalisering af molekyler. Klik på OK for at starte billedrekonstruktionen og starte efterbehandlingen af slutresultatanalysen.Salmonella, der udtrykker SseJ inkorporeret i TCO, behandles med Janelia Fluor 646 tetrazin og afbildes med Janelia Fluor 646 fluorescens i fravær eller tilstedeværelse af TCO. Fluorescensen af SseJ detekteres kun, når TCO er til stede. HeLa-celler er inficeret med salmonella, der huser psseJ-HA i 16 timer, fikseret og immunfarvet med anti-HA-antistof, LPS og DAPI.Som forventet dannes SseJ-afhængige salmonellainducerede filamenter eller SIF'er i de inficerede celler. I mangel af TCO undertrykkes det gule codon ikke, og SseJ-afhængige SIF'er er fraværende i inficerede HeLa-celler. SseJ-afhængige SIF'er observeres i nærvær af TCO, hvilket tydeligt indikerer, at SseJ blev reddet af ekspressionen af SseJF10TCOHA ved hjælp af genetisk kodeudvidelse eller GCE.Mærkningsspecificitet af udskilt SseJF10TCOHA i HeLa-celler gennem SPIEDAC-klikreaktioner ved hjælp af to alternative farvestofblanding en og farvestofblanding to er vist her. Klikfarvestof Janelia Fluor 646 TZ blev yderligere brugt til at observere, om der var nogen baggrundsmærkning i HeLa-celler inficeret med vildtype Salmanella, der bærer SseJ HA i nærvær af TCO og P vault plasmid. SseJ blev frigivet i værtscellens cytoplasma uden intracellulære eller ikke-specifikke fluorescerende signaler, hvilket viste, at fluorescerende signal var specifikt for SseJ.Superopløsningsbilleddannelse af GCE mærket SseJ i HeLa-celler er præsenteret i denne figur. Et brightfield-billede af en HeLa-celle under observation vises her. Det diffraktionsbegrænsede widefield-billede af udskilt SseJ mærket med TCO og Janelia Fluor 646 og det tilsvarende dSTORM-billede af de SseJ-dekorerede SIF'er præsenteres her.Indsatsen viser en forstørret visning af en superopløst SseJ i det indrammede område. NCAA-lagerløsninger blev fremstillet i NaOH. Glem ikke at neutralisere det før eller efter tilsætning til medierne.Efter mærkning af protein af interesse skal du vaske cellen grundigt, så baggrundssignalet er minimalt. Efter vores GCE-procedure kan vi nu mærke enhver virulensfaktor i bakterier og følge dens aktivitet ved hjælp af vores billeddannelsesteknikker.

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Kortlægning Bakterielle Funktionelle Networks og spredningsveje i<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Hjælp Syntetiske Genetiske Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Super-opløsning Imaging af Bakteriel Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Prøverne, til Optimering STORM Super-opløsning Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Prøve forberedelse til single virion Atomic Force mikroskopi og superopløsning fluorescens Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Super-opløsning Imaging af Cytokinetic Z Ring i levende bakterier Brug af Fast 3D-strukturerede Illumination Mikroskopi (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Genetisk Barcoding med fluorescerende proteiner for Multipleksede Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Elektroporation, Isolering og Imaging af -myofibre

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open source Single-partikel Analyse for Super-resolution Microscopy med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Grundtilstand udtynding super-resolution Imaging i pattedyrceller

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...