Name: super-resolution imaging of bacterial secreted proteins using genetic code expansion
Uploaded: 2023-02-10T13:23:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage de la branche médicale de l’Université du Texas, Galveston, TX, et un prix Texas STAR à L.J.K. Nous remercions le Prof. Edward Lemke (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Allemagne) pour le plasmide pEVOL-PylRS-AF. Les images de la figure 1 ont été créées à l’aide de BioRender.

1. Construction plasmidique
<ol><li>Cloner le gène exprimant le POI dans un plasmide d’expression (p. ex. pET28a-sseJ 10TAG) qui exprime le POI dans E. coli BL21 (DE3). Cette étape facilite la détermination que les mutants sont fonctionnels.</li>
	<li>Pour la visualisation des effecteurs sécrétés par Salmonella dans les cellules hôtes, construire un plasmide d’expression (pWSK29-sseJ-HA) qui exprime le POI cible SseJ sous le contrôle de son promoteur nati...

<ol>
	<li>Marlovits, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+assembly+of+the+type+III+secretion+needle+complex.">Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex.</a> Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).</li><li>Kubori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+structure+of+the+Salmonella+typhimurium+type+III+protein+secretion+system.">Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system.</a> Science. 280 (5363), 602-605 (1998).</li><li>LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+by+phospho-OmpR+of+ssrA/B+gene+expression+in+Salmonella+pathogenicity+island+2.">Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2.</a> Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).</li><li>Walthers, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+response+regulator+SsrB+relieves+H-NS+silencing+by+displacing+H-NS+bound+in+polymerization+mode+and+directly+activates+transcription.">Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).</li><li>Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. 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M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+fluorescence+complementation+platform+for+visualizing+Salmonella+effector+proteins+reveals+distinctly+different+intracellular+niches+in+different+cell+types.">Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types.</a> ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).</li><li>Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. 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L’approche décrite ici a été utilisée pour suivre l’emplacement précis des protéines effectrices injectées dans la cellule hôte par la bactérie T3SS après l’infection. Les T3SS sont utilisés par des agents pathogènes intracellulaires tels que Salmonella, Shigella et Yersinia pour transporter les composants de virulence dans l’hôte. Le développement de technologies d’imagerie à super-résolution a permis de visualiser les facteurs de virulence à une résolution jusque-l...

Les infections bactériennes ont longtemps été considérées comme un danger grave pour la santé humaine. Les agents pathogènes utilisent des systèmes de défense très évolués, extrêmement puissants et complexes, ainsi qu’une variété de facteurs de virulence bactérienne (appelés protéines effectrices) pour échapper aux réponses immunitaires de l’hôte et établir des infections 1,2. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents à ces systèmes et le rôle des protéines effectrices individuelles sont encore largement inconnus en raison du manque d’approches appropriées pour suivre directement les composants protéiques cruciaux et les effecteurs dans les cellules hôtes pendant la pathogenèse.
Un exemple typique est Salmonella enterica sérovar Typhimurium, qui provoque une gastro-entérite aiguë. Salmonelle Typhimurium utilise des systèmes de sécrétion de type trois (T3SS) pour injecter une variété de protéines effectrices directement dans les cellules hôtes. Dès que Salmonella pénètre dans la cellule hôte, elle réside dans un compartiment membranaire acide, appelé vacuole contenant Salmonella (SCV)3,4. Le pH acide du SCV active le T3SS codé par l’îlot de pathogénicité 2 de Salmonella (SPI-2) et transloque une volée de 20 protéines effectrices ou plus à travers la membrane vacuolaire dans le cytosolhôte 5,6,7,8. À l’intérieur de l’hôte, ces cocktails complexes de protéines effectrices manipulent de manière coordonnée les voies de signalisation de la cellule hôte, ce qui entraîne la formation de structures membranaires tubulaires complexes et hautement dynamiques étendues à partir du SCV le long de microtubules, appelées filaments induits par Salmonella (SIF), qui permettent à Salmonella de survivre et de se répliquer dans les cellules hôtes9,10,11.
Les méthodes permettant de visualiser, de suivre et de surveiller les localisations des effecteurs bactériens, et d’examiner leur trafic et leurs interactions à l’intérieur des cellules hôtes, fournissent un aperçu essentiel des mécanismes qui sous-tendent la pathogenèse bactérienne. Le marquage et la localisation des protéines effectrices T3SS sécrétées par Salmonella à l’intérieur des cellules hôtes se sont avérés être un défi technologique12,13; Néanmoins, le développement de protéines fluorescentes codées génétiquement a transformé notre capacité à étudier et à visualiser les protéines dans les systèmes vivants. Cependant, la taille des protéines fluorescentes (~25-30 kDa)15 est souvent comparable ou même supérieure à celle de la protéine d’intérêt (POI; par exemple, 13,65 kDa pour SsaP, 37,4 kDa pour SifA). En fait, le marquage des protéines fluorescentes des effecteurs bloque souvent la sécrétion de l’effecteur marqué et bloque le T3SS14.
De plus, les protéines fluorescentes sont moins stables et émettent un faible nombre de photons avant photoblanchiment, ce qui limite leur utilisation dans les techniques microscopiques à super-résolution16,17,18, en particulier en microscopie de localisation par photoactivation (PALM), STORM et en microscopie à déplétion par émission stimulée (STED). Bien que les propriétés photophysiques des colorants fluorescents organiques soient supérieures à celles des protéines fluorescentes, des méthodes et techniques telles que CLIP/SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH/FlAsH 22,23 et HA-Tags 24,25 nécessitent un appendice protéique ou peptidique supplémentaire qui peut altérer la structure-fonction de la protéine effectrice d’intérêt en interférant avec la modification ou le trafic post-traductionnel. Une méthode alternative qui minimise la modification nécessaire des protéines implique l’incorporation de ncAA dans un POI pendant la traduction par GCE. Les ncAA sont fluorescents ou peuvent être rendus fluorescents via la chimie de clic 12,13,26,27,28.
En utilisant l’ECG, les ncAA avec de minuscules groupes bio-orthogonaux fonctionnels (tels qu’un groupe azoture, cyclopropène ou cyclooctyne) peuvent être introduits à presque n’importe quel endroit d’une protéine cible. Dans cette stratégie, un codon natif est échangé avec un codon rare tel qu’un codon stop ambre (TAG) à une position spécifiée dans le gène du POI. La protéine modifiée est ensuite exprimée dans les cellules aux côtés d’une paire orthogonale aminoacyl-ARNt synthétase/ARNt. Le site actif de l’ARNt synthétase est conçu pour recevoir un seul ncAA particulier, qui est ensuite attaché de manière covalente à l’extrémité 3' de l’ARNt qui reconnaît le codon ambre. Le ncAA est simplement introduit dans le milieu de croissance, mais il doit être absorbé par la cellule et atteindre le cytosol où l’aminoacyl-ARNt synthétase (aaRS) peut le lier à l’ARNt orthogonal; il est ensuite incorporé dans la POI à l’emplacement spécifié (voir la figure 1)12. Ainsi, la CME permet l’incorporation spécifique au site d’une pléthore de groupes réactifs bio-orthogonaux tels que la cétone, l’azoye, l’alcyne, le cyclooctyne, le transcyclooctène, la tétrazine, le norbonène, le α, l’amide β-insaturé et le bicyclo [6.1.0]-nonyne dans un POI, surmontant potentiellement les limites des méthodes conventionnelles de marquage des protéines 12,26,27,28.
Les tendances émergentes récentes dans les techniques d’imagerie à super-résolution ont ouvert de nouvelles voies pour étudier les structures biologiques au niveau moléculaire. En particulier, STORM, une technique de super-résolution basée sur la localisation et basée sur la localisation, est devenue un outil inestimable pour visualiser les structures cellulaires jusqu’à ~20-30 nm et est capable d’étudier les processus biologiques une molécule à la fois, découvrant ainsi les rôles de molécules intracellulaires qui sont encore inconnus dans les études traditionnelles de moyenne d’ensemble13 . Les techniques monomoléculaires et de super-résolution nécessitent une petite étiquette avec des fluorophores organiques brillants et photostables pour la meilleure résolution. Nous avons récemment démontré que GCE peut être utilisé pour incorporer des sondes appropriées pour l’imagerie à super-résolution12.
Deux des meilleurs choix pour le marquage des protéines dans les cellules sont la bicyclo [6.1.0] nonynelysine (BCN) et la transcyclooctène-lysine (TCO; illustrée à la figure 1), qui peuvent être génétiquement codées en utilisant une variante de la paire ARNt / synthétase (ici appelée ARNt Pyl / PylRS AF), oùPyl représente la pyrrolysine, et AF représente un double mutant rationnellement conçu (Y306A, Y384F) dérivé de Methanosarcina mazei qui code naturellement pour la pyrrolysine12, 29,30,31. Grâce à la réaction de cycloaddition Diels-Alder (Siels-Alder) à demande inverse d’électrons favorisée par la déformation, ces acides aminés réagissent chimiosélectivement avec les conjugués de tétrazine (Figure 1)12,30,31. De telles réactions de cycloaddition sont exceptionnellement rapides et compatibles avec les cellules vivantes; Ils peuvent également être fluorogéniques, si un fluorophore approprié est fonctionnalisé avec la fraction tétrazine12,26,32. Cet article présente un protocole optimisé pour surveiller la dynamique des effecteurs bactériens délivrés dans les cellules hôtes à l’aide de la CME, suivi de la localisation subcellulaire des protéines sécrétées dans les cellules HeLa à l’aide de dSTORM. Les résultats indiquent que l’incorporation d’un ncAA via GCE, suivie d’une réaction de clic avec des colorants fluorogéniques contenant de la tétrazine, représente une méthode polyvalente pour le marquage sélectif, la visualisation des protéines sécrétées et la localisation sous-cellulaire ultérieure dans l’hôte. Cependant, tous les composants et procédures détaillés ici peuvent être ajustés ou remplacés afin que le système GCE puisse être adapté pour étudier d’autres questions biologiques.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine SDS running buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A661-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulphate</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP212R-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>ThermiFischer Scientific</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Agar</td>
			<td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDP-FL-tetrazine</td>
			<td>Lumiprobe (USA)</td>
			<td>2.14E+02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>444203</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en &#8211; L - Lysine (TCO*A)</td>
			<td>SiChem GmbH</td>
			<td>SC-8008</td>
			<td>Size: 500 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (Hoechst33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeNovix DS-11+ Spectrophotometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM*</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>* Used for maintaining HeLa Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM**</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>**Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain BL21 (DE3)</td>
			<td>Novagen (Madison, WI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 897-BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>30123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>97203</td>
			<td>Pack of 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7141-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BF229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-C1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocloric acid</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image processing and analysis:&#160; http://rsbweb.nih.gov/ij</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>Coomassie-based stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janelia Fluoro 646-tetrazine</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;Manager (v. 1.4.2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pulser cuvette</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2086</td>
			<td>0.2 cm electrode gap, pkg. of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon N-STORM</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks</td>
			<td>ThermiFischer Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnipur Casamino Acid</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>2240</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehhyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (100x)</td>
			<td>GenDEPOT&#160;</td>
			<td>CA005-010</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL-PylRS-AF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For plasmid construction and map see following references 
			1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 
			2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Mini-prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: elife. 2021, 10, e67789.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pWSK29-sseJ-HA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: elife. 2021, 10, e67789.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>540025</td>
			<td>Protein grade, 10% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sulphate</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>424220250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>539131</td>
			<td>100x Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-HA primary antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. enterica. serovar Typhimurium 14028s</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036-50G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM), 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-C1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator Model 100</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>24932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system)</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThunderSTORM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://zitmen.github.io/thunderstorm/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (1x), 0.25%&#160;&#160;</td>
			<td>GenDEPOT&#160;</td>
			<td>CA014-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-well tissue culture chamber slides</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>94.6190.802</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of bacterial secreted proteins using genetic code expansion

Les systèmes de sécrétion de type trois (T3SS) permettent aux bactéries à Gram négatif d’injecter une batterie de protéines effectrices directement dans le cytosol des cellules hôtes eucaryotes. À l’entrée, les protéines effectrices injectées modulent de manière coopérative les voies de signalisation eucaryotes et reprogramment les fonctions cellulaires, permettant l’entrée et la survie des bactéries. La surveillance et la localisation de ces protéines effectrices sécrétées dans le contexte des infections fournissent une empreinte pour définir l’interface dynamique des interactions hôte-pathogène. Cependant, le marquage et l’imagerie des protéines bactériennes dans les cellules hôtes sans perturber leur structure / fonction est techniquement difficile. 
La construction de protéines de fusion fluorescentes ne résout pas ce problème, car les protéines de fusion bloquent l’appareil sécrétoire et ne sont donc pas sécrétées. Pour surmonter ces obstacles, nous avons récemment utilisé une méthode de marquage fluorescent spécifique au site des effecteurs sécrétés bactériens, ainsi que d’autres protéines difficiles à étiqueter, en utilisant l’expansion du code génétique (ECG). Cet article fournit un protocole complet étape par étape pour marquer les effecteurs sécrétés par Salmonella à l’aide du site GCE, suivi de directives pour l’imagerie de la localisation subcellulaire des protéines sécrétées dans les cellules HeLa à l’aide de la microscopie de reconstruction optique stochastique directe (dSTORM) 
Des découvertes récentes suggèrent que l’incorporation d’acides aminés non canoniques (ncAA) via GCE, suivie d’un marquage bio-orthogonal avec des colorants contenant de la tétrazine, est une technique viable pour le marquage sélectif et la visualisation des protéines sécrétées bactériennes et l’analyse ultérieure de l’image chez l’hôte. L’objectif de cet article est de fournir un protocole simple et clair qui peut être utilisé par les chercheurs intéressés à effectuer une imagerie à super-résolution en utilisant GCE pour étudier divers processus biologiques dans les bactéries et les virus, ainsi que les interactions hôte-pathogène.

Ce document de protocole décrit une méthode basée sur l’ECG pour le marquage fluorescent spécifique au site et la visualisation des effecteurs sécrétés par Salmonella, comme illustré à la figure 1. La structure chimique du groupe bioorthogonal transcyclooctène (TCO) ncAA et du colorant fluorescent est illustrée à la figure 1A. Le marquage SseJ a été réalisé par incorporation génétique de ncAA bioortho...

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Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion

Cet article fournit un protocole simple et clair pour marquer les effecteurs sécrétés par Salmonella en utilisant le site d’expansion du code génétique (ECG) et imager la localisation subcellulaire des protéines sécrétées dans les cellules HeLa à l’aide de la microscopie de reconstruction optique stochastique directe (dSTORM)

Imagerie à super-résolution de protéines sécrétées par des bactéries à l’aide de l’expansion du code génétique

Type three secretion systems (T3SSs) enable gram-negative bacteria to inject a battery of effector proteins directly into the cytosol of eukaryotic host ...

L’expansion du code génétique, ou ECM, surmonte les limites des autres stratégies d’étiquetage. Cela nous permet de localiser des protéines spécifiquement marquées, et nous avons des fluorophores organiques brillants qui permettent leur visualisation, de sorte que nous pouvons éviter les stratégies qui font, par exemple, des fusions de protéines fluorescentes, ce qui peut perturber la fonction des protéines. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quel autre système.Par exemple, nous l’avons utilisé pour marquer la protéine Zika CO, ce qui nous permet de fournir et de produire le virus Zika marqué que nous pouvons ensuite observer infecter les cellules hôtes. Pour commencer, transférez 100 microlitres de culture primaire dans cinq millilitres de milieu LB contenant 35 microgrammes par millilitre de chloramphénicol et 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline. Incuber à 37 degrés Celsius avec agitation à 250 RPM jusqu’à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne 0,6.Remplacer le milieu LB par le milieu N-minimal modifié complété par un TCO millimolaire, un acide aminé non canonique. Et cultivez les bactéries à 34 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ajouter 0,2% d’arabinose, 25 milligrammes par millilitre de chloramphénicol et 100 milligrammes par millilitre d’ampicilline, et faire croître les cellules pendant six heures supplémentaires, en agitant à 250 RPM.Après six heures, laver les bactéries quatre fois sur un intervalle de 30 minutes avec un milieu MgM frais sans acides aminés non canoniques ou, ncAA. Centrifuger les bactéries, les remettre en suspension dans un tampon PBS et incuber pendant une heure à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pour éliminer l’excès de ncAA. Après une heure, centrifuger les bactéries à 3 000 g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius et les stocker pour une utilisation ultérieure.Pour une expérience de contrôle, répétez la même expérience en exprimant des protéines contenant des ncAA en l’absence de ncAA. Resuspendre les cellules de salmonelles exprimant SseJ incorporées avec le TCO en l’absence ou la présence de TCO dans le PBS. Ajustez la densité optique à 600 nanomètres à quatre dans PBS, et incuber les cellules avec 20 micromolaires Janelia Fluor 646 tétrazène ou 20 micromolaires BDPFL tétrazine à 37 degrés Celsius dans l’obscurité, et agiter pendant une à deux heures à 250 RPM.Ensemencez les cellules et lavez trois à quatre fois avec du PBS contenant 5 % de DMSO et 0,2 % de F-127 pluronique. Remettez en suspension la pastille dans du PBS contenant 5 % de DMSO. Après avoir incubé pendant la nuit à quatre degrés Celsius dans l’obscurité, laver deux fois de plus avec du PBS.Imagez immédiatement les cellules à l’aide d’un microscope confocal, ou fixez-les avec 1,5% de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 30 à 45 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Cultiver et maintenir les cellules HeLa à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone et 95% d’humidité dans du DMEM à haute teneur en glucose complété par 10% FBS en plus de la streptomycine à pénicilline. Cultivez des bactéries un jour avant l’infection et inoculez une seule colonie de salmonelles de type sauvage hébergeant un plasmide pEVOL contenant une paire orthogonale d’ARNt synthétase et un plasmide pWSK29 contenant le gène SseJ dans cinq millimètres d’antibiotique contenant un bouillon LB standard pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec agitation à 250 RPM.Réparer un stock de cellules diluées à 100 000 cellules par millilitre et ensemencer 50 000 cellules HeLA par puits dans 500 microlitres de DMEM contenant 10% de milieu de croissance FBS dans une lame de chambre de huit puits. Gardez la glissière de la chambre dans un incubateur pendant 24 heures à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone et 95% d’humidité. Pour l’infection bactérienne, sous-culture de salmonelles de type sauvage hébergeant le plasmide pEVOL et le plasmide pWSK29 contenant le gène SseJ en diluant 100 microlitres de culture bactérienne de nuit dans trois millilitres de milieu LB contenant 35 microgrammes par millilitre de chloramphénicol et 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline.Incuber à 37 degrés Celsius en agitant à 250 tr / min pendant cinq à sept heures. Pour initier l’infection des cellules HeLa, après avoir retiré les cellules HeLa de l’incubateur, lavez les cellules avec du DPBS préchauffé et ajoutez 500 microlitres de DMEM frais contenant 10% de FBS à chaque puits. Replacez la glissière de la chambre dans l’incubateur de dioxyde de carbone jusqu’à ce que l’infection commence.Après cinq à sept heures d’incubation, diluer la culture de salmonelles de sorte que la densité optique à 600 nanomètres soit de 0,2 dans un millilitre de milieu de croissance DMEM et ajouter les quantités requises d’inoculum de salmonelle à chaque puits de la lame de chambre, de sorte que la multiplicité de l’infection soit de 100. Après avoir incubé les cellules infectées dans un incubateur de dioxyde de carbone pendant 30 minutes, lavez les cellules trois fois avec du DPBS préchauffé pour éliminer les salmonelles extracellulaires. Réglez ce point de temps à zéro heure après l’infection et ajoutez 500 microlitres de milieu complet contenant 100 microgrammes par millilitre de gentamicine pendant une heure.Après l’incubation, lavez à nouveau les cellules trois fois avec DPBS comme indiqué précédemment et ajoutez 500 microlitres du milieu complet supplémenté avec 0,2% d’arabinose, 10 microgrammes par millilitre de gentamicine à chaque puits de la lame de chambre. Dans une expérience de contrôle, effectuer des infections similaires de cellules HeLa sans TCO. Après avoir incubé la lame de chambre pendant 10 heures dans l’incubateur de dioxyde de carbone, remplacez le milieu complet par un milieu complet frais sans TCO et lavez les cellules HeLa quatre fois sur un intervalle de 30 minutes chacune avec du DPBS préchauffé.Ensuite, lavez les cellules avec un milieu complet frais sans TCO. Après 12 heures après l’infection, aspirer le milieu des cellules et laver la cellule avec du DPBS préchauffé deux ou trois fois. Dans un groupe de puits, ajouter 500 microlitres du mélange de solution de colorant un, et dans un autre groupe de puits de la même lame de chambre, ajouter 500 microlitres du mélange de solution de colorant deux.Placez la chambre glisser dans l’incubateur de dioxyde de carbone pendant une heure et 1/2 à deux heures. Après 13,5 à 14 heures après l’infection, rincer les cellules HeLa deux fois avec du DPBS préchauffé et ajouter 500 microlitres de DMEM frais complété par FBS. Après avoir incubé pendant 30 minutes, laver à nouveau les cellules avec du DPBS préchauffé comme indiqué précédemment, puis laver avec du DMEM frais quatre fois sur un intervalle de 30 minutes.16 heures après l’infection, fixer les cellules HeLa avec du paraformaldéhyde en ajoutant 200 microlitres de paraformaldéhyde à 4% à chaque puits et en incubant pendant 10 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Aspirer le paraformaldéhyde. Rincer trois fois avec du PBS et stocker les cellules dans du PBS à quatre degrés Celsius dans l’obscurité.Amenez les cellules au microscope et placez la chambre d’imagerie sur la platine du microscope dans le porte-échantillon. Changez ensuite le milieu dans le puits avec 0,4 millilitre du tampon d’imagerie GLOX BME fraîchement fabriqué. Réduisez la puissance laser à environ un milliwatt pour identifier une cellule HeLa d’intérêt et ajuster le plan focal et l’angle du faisceau laser tout en éclairant l’échantillon avec de faibles densités laser de 647 nanomètres.Ajustez l’angle d’éclairage HILO. Capturez une référence à une image à fraction limitée de la structure cible et passez les fluorophores à l’état sombre en tournant le laser à sa puissance maximale. Réglez le gain du préamplificateur sur trois et activez le transfert d’images.Réglez ensuite le gain EM sur 200 pour une sensibilité plus élevée dans les mesures dSTORM. Ajustez la force du laser à un niveau approprié où les événements clignotants sont séparés dans l’espace et le temps. Réglez le temps d’exposition sur 30 millisecondes et commencez l’acquisition.Acquérir 10 000 à 30 000 cadres. Répétez l’acquisition similaire à différents retours sur investissement. Pour la reconstruction d’images de dSTORM, ouvrez l’image J et importez les données brutes.Ouvrez le plugin Thunderstorm et configurez le paramètre de caméra correspondant à l’appareil. Accédez à Exécuter l’analyse et définissez les paramètres appropriés, tels que le filtrage d’image, les méthodes de localisation et la localisation des molécules par sous-pixels. Cliquez sur OK pour démarrer la reconstruction de l’image et commencer l’analyse du résultat final post-traitement.Les salmonelles exprimant SseJ incorporées avec TCO sont traitées avec Janelia Fluor 646 tétrazine et imagées avec Janelia Fluor 646 fluorescence en l’absence ou en présence de TCO. La fluorescence de SseJ n’est détectée que lorsque le TCO est présent. Les cellules HeLa sont infectées par des salmonelles hébergeant le psseJ-HA pendant 16 heures, fixées et immunocolorées avec des anticorps anti-HA, du LPS et du DAPI.Comme prévu, des filaments induits par la salmonelle dépendants de SseJ, ou SIF, sont formés dans les cellules infectées. En l’absence de TCO, le codon ambre n’est pas supprimé et les SIF dépendants de SseJ sont absents dans les cellules HeLa infectées. Des SIF dépendants de SseJ sont observés en présence de TCO, ce qui indique clairement que SseJ a été sauvé par l’expression de SseJF10TCOHA en utilisant l’expansion du code génétique, ou GCE.La spécificité du marquage du SseJF10TCOHA sécrété dans les cellules HeLa par le biais de réactions de clic SPIEDAC utilisant deux mélanges de colorants alternatifs un et deux mélanges de colorants sont présentés ici. Le colorant à clic Janelia Fluor 646 TZ a également été utilisé pour observer s’il y avait un marquage de fond dans les cellules HeLa infectées par Salmanella de type sauvage porteur de SseJ HA en présence de plasmide de la voûte TCO et P. SseJ a été libéré dans le cytoplasme de la cellule hôte sans signaux fluorescents intracellulaires ou non spécifiques démontrant que le signal fluorescent était spécifique à SseJ.L’imagerie à super résolution de SseJ marqués GCE dans les cellules HeLa est présentée dans cette figure. Une image en fond clair d’une cellule HeLa sous observation est montrée ici. L’image à grand champ limité par diffraction de SseJ sécrété étiqueté avec TCO et Janelia Fluor 646 et l’image dSTORM correspondante des SIF décorés SseJ sont présentées ici.L’encart montre une vue agrandie d’un SseJ super résolu dans la région de la boîte. Les solutions de stock NCAA ont été préparées en NaOH. N’oubliez pas de le neutraliser avant ou après l’ajout au support.Après avoir marqué la protéine d’intérêt, lavez la cellule abondamment, de sorte que le signal de fond soit minimal. En suivant notre procédure CME, nous pouvons maintenant marquer n’importe quel facteur de virulence dans les bactéries et suivre son activité à l’aide de nos techniques d’imagerie.

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