Name: super-resolution imaging of bacterial secreted proteins using genetic code expansion
Uploaded: 2023-02-10T13:23:00
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Diese Arbeit wurde durch Anschubfinanzierungen der University of Texas Medical Branch, Galveston, TX, und einen Texas STAR Award an L.J.K. Wir danken Prof. Edward Lemke (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Deutschland) für das Plasmid pEVOL-PylRS-AF. Die Bilder in Abbildung 1 wurden mit BioRender erstellt.

1. Plasmid-Konstruktion
<ol><li>Klonen Sie das Gen, das das POI exprimiert, in ein Expressionsplasmid (z. B. pET28a-sseJ 10TAG), das das POI in E. coli BL21 (DE3) exprimiert. Dieser Schritt erleichtert die Feststellung, ob die Mutanten funktionsfähig sind.</li>
	<li>Für die Visualisierung von Salmonella-sezernierten Effektoren in Wirtszellen wird ein Expressionsplasmid (pWSK29-sseJ-HA) konstruiert, das das Ziel-POI-SseJ unter der Kontrolle seines nativen Promotors exprimiert</em...

<ol>
	<li>Marlovits, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+assembly+of+the+type+III+secretion+needle+complex.">Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex.</a> Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).</li><li>Kubori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+structure+of+the+Salmonella+typhimurium+type+III+protein+secretion+system.">Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system.</a> Science. 280 (5363), 602-605 (1998).</li><li>LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. 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Der hier beschriebene Ansatz wurde verwendet, um die genaue Position von Effektorproteinen zu verfolgen, die nach der Infektion vom bakteriellen T3SS in die Wirtszelle injiziert werden. T3SSs werden von intrazellulären Krankheitserregern wie Salmonellen, Shigellen und Yersinien eingesetzt, um Virulenzkomponenten in den Wirt zu transportieren. Die Entwicklung von hochauflösenden Bildgebungstechnologien hat es möglich gemacht, Virulenzfaktoren mit einer bisher unvorstellbaren Auflösung sichtb...

Bakterielle Infektionen gelten seit langem als ernsthafte Gefahr für die menschliche Gesundheit. Krankheitserreger nutzen hochentwickelte, extrem leistungsfähige und komplizierte Abwehrsysteme sowie eine Vielzahl von bakteriellen Virulenzfaktoren (sogenannte Effektorproteine), um der Immunantwort des Wirts zu entgehen und Infektionen zu verursachen 1,2. Die molekularen Mechanismen, die diesen Systemen zugrunde liegen, und die Rolle einzelner Effektorproteine sind jedoch noch weitgehend unbekannt, da es an geeigneten Ansätzen mangelt, um die entscheidenden Proteinkomponenten und Effektoren in Wirtszellen während der Pathogenese direkt zu verfolgen.
Ein typisches Beispiel ist Salmonella enterica serovar Typhimurium, das eine akute Gastroenteritis verursacht. Salmonelle Typhimurium nutzt Typ-Drei-Sekretionssysteme (T3SS), um eine Vielzahl von Effektorproteinen direkt in Wirtszellen zu injizieren. Sobald Salmonellen in die Wirtszelle eindringen, befinden sie sich in einem sauren, membrangebundenen Kompartiment, das als Salmonellen-haltige Vakuole (SCV) bezeichnet wird3,4. Der saure pH-Wert des SCV aktiviert das Salmonella pathogenicity island 2 (SPI-2)-kodierte T3SS und transloziert eine Salve von 20 oder mehr Effektorproteinen über die vakuoläre Membran in das Wirtszytosol 5,6,7,8. Im Inneren des Wirts manipulieren diese komplexen Cocktails von Effektorproteinen koordiniert die Signalwege der Wirtszelle, was zur Bildung hochdynamischer, komplexer röhrenförmiger Membranstrukturen führt, die sich vom SCV entlang von Mikrotubuli erstrecken, die als Salmonellen-induzierte Filamente (SIFs) bezeichnet werden und es Salmonellen ermöglichen, in den Wirtszellen zu überleben und sich zu vermehren 9,10,11.
Methoden zur Visualisierung, Verfolgung und Überwachung bakterieller Effektorlokalisationen sowie zur Untersuchung ihres Transports und ihrer Interaktionen innerhalb von Wirtszellen bieten wichtige Einblicke in die Mechanismen, die der bakteriellen Pathogenese zugrunde liegen. Die Markierung und Lokalisierung von Salmonella-sezernierten T3SS-Effektorproteinen in Wirtszellen hat sich als technologische Herausforderung erwiesen 12,13; Nichtsdestotrotz hat die Entwicklung genetisch kodierter fluoreszierender Proteine unsere Fähigkeit verändert, Proteine in lebenden Systemen zu untersuchen und sichtbar zu machen. Die Größe fluoreszierender Proteine (~25-30 kDa)15 ist jedoch oft vergleichbar mit der des interessierenden Proteins (POI; z. B. 13,65 kDa für SsaP, 37,4 kDa für SifA). Tatsächlich blockiert die fluoreszierende Proteinmarkierung von Effektoren oft die Sekretion des markierten Effektors und blockiert das T3SS14.
Darüber hinaus sind fluoreszierende Proteine weniger stabil und emittieren vor dem Photobleichen eine geringe Anzahl von Photonen, was ihre Verwendung in hochauflösenden mikroskopischen Techniken einschränkt16,17,18, insbesondere in der Photoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie (PALM), STORM und STED-Mikroskopie (Stimulated Emission Depletion). Während die photophysikalischen Eigenschaften organischer Fluoreszenzfarbstoffe denen von fluoreszierenden Proteinen überlegen sind, erfordern Methoden/Techniken wie CLIP/SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH/FlAsH 22,23 und HA-Tags24,25 ein zusätzliches Protein- oder Peptidanhang, das die Strukturfunktion des interessierenden Effektorproteins beeinträchtigen kann, indem es die posttranslationale Modifikation oder den Transport stört. Eine alternative Methode, die die notwendige Proteinmodifikation minimiert, ist der Einbau von ncAAs in einen POI während der Translation durch GCE. Die ncAAs sind entweder fluoreszierend oder können mittels Click-Chemie fluoreszierend gemacht werden 12,13,26,27,28.
Mit Hilfe von GCE können ncAAs mit winzigen, funktionellen, bioorthogonalen Gruppen (wie z. B. einer Azid-, Cyclopropen- oder Cyclooctingruppe) an nahezu jeder Stelle in einem Zielprotein eingeführt werden. Bei dieser Strategie wird ein natives Codon mit einem seltenen Codon, wie z.B. einem bernsteinfarbenen (TAG) Stoppcodon an einer bestimmten Position im Gen des POI ausgetauscht. Das modifizierte Protein wird anschließend zusammen mit einem orthogonalen Aminoacyl-tRNA-Synthetase/tRNA-Paar in Zellen exprimiert. Das aktive Zentrum der tRNA-Synthetase ist so konzipiert, dass es nur ein bestimmtes ncAA erhält, das dann kovalent an das 3'-Ende der tRNA gebunden wird, das das Bernsteincodon erkennt. Das ncAA wird einfach in das Wachstumsmedium eingebracht, muss aber von der Zelle aufgenommen werden und das Zytosol erreichen, wo die Aminoacyl-tRNA-Synthetase (aaRS) es mit der orthogonalen tRNA verknüpfen kann. es wird dann an der angegebenen Stelle in den POI eingebunden (siehe Abbildung 1)12. Somit ermöglicht GCE den ortsspezifischen Einbau einer Vielzahl von bioorthogonalen reaktiven Gruppen wie Keton, Azid, Alkin, Cyclooctin, Transcycloocten, Tetrazin, Norboneen, α, β-ungesättigtes Amid und Bicyclo [6.1.0]-Nonin in einen POI, wodurch möglicherweise die Einschränkungen herkömmlicher Proteinmarkierungsmethoden überwundenwerden 12,26,27,28.
Die jüngsten Trends bei hochauflösenden Bildgebungsverfahren haben neue Wege zur Untersuchung biologischer Strukturen auf molekularer Ebene eröffnet. Insbesondere STORM, eine auf Lokalisierung basierende, superauflösende Einzelmolekültechnik, hat sich zu einem unschätzbaren Werkzeug zur Visualisierung zellulärer Strukturen bis hinunter zu ~20-30 nm entwickelt und ist in der Lage, biologische Prozesse Molekül für Molekül zu untersuchen und dadurch die Rolle intrazellulärer Moleküle zu entdecken, die in traditionellen ensemblegemittelten Studien noch unbekannt sind13 . Einzelmolekül- und Super-Resolution-Techniken erfordern eine kleine Markierung mit hellen, photostabilen organischen Fluorophoren, um die beste Auflösung zu erzielen. Wir haben kürzlich gezeigt, dass GCE für die Integration geeigneter Sonden für die hochauflösende Bildgebung verwendet werden kann12.
Zwei der besten Optionen für die Proteinmarkierung in Zellen sind Bicyclo [6.1.0]nonynelysin (BCN) und trans-Cycloocten-Lysin (TCO; siehe Abbildung 1), die genetisch mit einer Variante des tRNA/Synthetase-Paares (hier als tRNAPyl/PylRS AF bezeichnet) kodiert werden können, wobei Pyl für Pyrrolysin steht undAF für eine rational gestaltete Doppelmutante (Y306A, Y384F) steht, die von Methanosarcina mazei abgeleitet ist und auf natürliche Weise für Pyrrolysin12 kodiert. 29,30,31. Durch die dehnungsgeförderte inverse Elektronenbedarfs-Diels-Alder-Cycloadditionsreaktion (SPIEDAC) reagieren diese Aminosäuren chemoselektiv mit Tetrazin-Konjugaten (Abbildung 1)12,30,31. Solche Cycloadditionsreaktionen sind außergewöhnlich schnell und mit lebenden Zellen kompatibel; Sie können auch fluorogen sein, wenn ein geeigneter Fluorophor mit der Tetrazin-Einheit12,26,32 funktionalisiert wird. In dieser Arbeit wird ein optimiertes Protokoll zur Überwachung der Dynamik von bakteriellen Effektoren vorgestellt, die mittels GCE in Wirtszellen eingebracht werden, gefolgt von der subzellulären Lokalisierung von sezernierten Proteinen in HeLa-Zellen unter Verwendung von dSTORM. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Einbau eines ncAA über GCE, gefolgt von einer Click-Reaktion mit fluorogenen Tetrazin-haltigen Farbstoffen, eine vielseitige Methode zur selektiven Markierung, Visualisierung sezernierter Proteine und anschließender subzellulärer Lokalisation im Wirt darstellt. Alle hier beschriebenen Komponenten und Verfahren können jedoch angepasst oder ersetzt werden, so dass das GCE-System für die Untersuchung anderer biologischer Fragestellungen angepasst werden kann.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine SDS running buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A661-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulphate</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP212R-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>ThermiFischer Scientific</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Agar</td>
			<td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDP-FL-tetrazine</td>
			<td>Lumiprobe (USA)</td>
			<td>2.14E+02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>444203</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en &#8211; L - Lysine (TCO*A)</td>
			<td>SiChem GmbH</td>
			<td>SC-8008</td>
			<td>Size: 500 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (Hoechst33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeNovix DS-11+ Spectrophotometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM*</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>* Used for maintaining HeLa Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM**</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>**Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain BL21 (DE3)</td>
			<td>Novagen (Madison, WI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 897-BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>30123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>97203</td>
			<td>Pack of 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7141-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BF229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-C1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocloric acid</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image processing and analysis:&#160; http://rsbweb.nih.gov/ij</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>Coomassie-based stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janelia Fluoro 646-tetrazine</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;Manager (v. 1.4.2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pulser cuvette</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2086</td>
			<td>0.2 cm electrode gap, pkg. of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon N-STORM</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks</td>
			<td>ThermiFischer Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnipur Casamino Acid</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>2240</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehhyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (100x)</td>
			<td>GenDEPOT&#160;</td>
			<td>CA005-010</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL-PylRS-AF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For plasmid construction and map see following references 
			1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 
			2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Mini-prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: elife. 2021, 10, e67789.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pWSK29-sseJ-HA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: elife. 2021, 10, e67789.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>540025</td>
			<td>Protein grade, 10% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sulphate</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>424220250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>539131</td>
			<td>100x Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-HA primary antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. enterica. serovar Typhimurium 14028s</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036-50G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM), 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-C1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator Model 100</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>24932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system)</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThunderSTORM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://zitmen.github.io/thunderstorm/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (1x), 0.25%&#160;&#160;</td>
			<td>GenDEPOT&#160;</td>
			<td>CA014-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-well tissue culture chamber slides</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>94.6190.802</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of bacterial secreted proteins using genetic code expansion

Typ-Drei-Sekretionssysteme (T3SSs) ermöglichen es gramnegativen Bakterien, eine Batterie von Effektorproteinen direkt in das Zytosol eukaryotischer Wirtszellen zu injizieren. Beim Eintritt modulieren die injizierten Effektorproteine kooperativ eukaryotische Signalwege und programmieren zelluläre Funktionen um, was das Eindringen und Überleben von Bakterien ermöglicht. Die Beobachtung und Lokalisierung dieser sezernierten Effektorproteine im Kontext von Infektionen liefert einen Fußabdruck für die Definition der dynamischen Schnittstelle von Wirt-Pathogen-Interaktionen. Die Markierung und Bildgebung bakterieller Proteine in Wirtszellen ohne Störung ihrer Struktur/Funktion ist jedoch technisch anspruchsvoll. 
Die Konstruktion fluoreszierender Fusionsproteine löst dieses Problem nicht, da die Fusionsproteine den sekretorischen Apparat blockieren und somit nicht sezerniert werden. Um diese Hindernisse zu überwinden, haben wir kürzlich eine Methode zur ortsspezifischen Fluoreszenzmarkierung von bakteriell sezernierten Effektoren sowie anderen schwer zu markierenden Proteinen unter Verwendung der genetischen Code-Expansion (GCE) eingesetzt. Diese Arbeit bietet ein vollständiges Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Markierung von Salmonella-sezernierten Effektoren mit GCE-Ortsspezifischkeit, gefolgt von Anweisungen zur Abbildung der subzellulären Lokalisation von sezernierten Proteinen in HeLa-Zellen mit Hilfe der direkten stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM)
Neuere Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Einbau von nicht-kanonischen Aminosäuren (ncAAs) über GCE, gefolgt von bioorthogonaler Markierung mit tetrazinhaltigen Farbstoffen, eine praktikable Technik zur selektiven Markierung und Visualisierung von bakteriell sezernierten Proteinen und anschließender Bildanalyse im Wirt ist. Das Ziel dieses Artikels ist es, ein einfaches und klares Protokoll bereitzustellen, das von Forschern verwendet werden kann, die daran interessiert sind, hochauflösende Bildgebung mit GCE durchzuführen, um verschiedene biologische Prozesse in Bakterien und Viren sowie Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen.

Dieses Protokollpapier beschreibt eine GCE-basierte Methode zur ortsspezifischen Fluoreszenzmarkierung und Visualisierung von Salmonella-sezernierten Effektoren, wie in Abbildung 1 dargestellt. Die chemische Struktur der ncAA-tragenden trans-Cycloocten-Bioorthogonalgruppe (TCO) und des Fluoreszenzfarbstoffs ist in Abbildung 1A dargestellt. Die SseJ-Markierung wurde durch genetischen Einbau von bioorthogonalen ncAAs an ei...

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Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion

Dieser Artikel bietet ein einfaches und klares Protokoll zur ortsspezifischen Markierung von Salmonella-sezernierten Effektoren mittels genetischer Code-Expansion (GCE) und zur Abbildung der subzellulären Lokalisation von sezernierten Proteinen in HeLa-Zellen mit Hilfe der direkten stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM)

Super-Resolution-Bildgebung von bakteriell sezernierten Proteinen mittels genetischer Code-Expansion

Type three secretion systems (T3SSs) enable gram-negative bacteria to inject a battery of effector proteins directly into the cytosol of eukaryotic host ...

Die genetische Codeerweiterung (GCE) überwindet die Einschränkungen anderer Markierungsstrategien. Es ermöglicht uns, spezifisch markierte Proteine zu lokalisieren, und wir haben helle organische Fluorophore, die ihre Visualisierung ermöglichen, so dass wir Strategien vermeiden können, die beispielsweise fluoreszierende Proteinfusionen bewirken, die die Proteinfunktion stören können. Diese Methode kann auf jedes andere System angewendet werden.Wir haben es zum Beispiel verwendet, um das Zika-CO-Protein zu markieren, und das ermöglicht es uns, markierte Zika-Viren bereitzustellen und zu produzieren, die wir dann bei der Infektion von Wirtszellen beobachten können. Zu Beginn werden 100 Mikroliter Primärkultur in fünf Milliliter LB-Medium mit 35 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol und 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin überführt. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius unter Schütteln bei 250 U/min, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,6 erreicht.Ersetzen Sie das LB-Medium durch das modifizierte N-Minimal-Medium, das mit einer millimolaren TCO, einer nicht-kanonischen Aminosäure, ergänzt wird. Und lassen Sie die Bakterien 30 Minuten lang bei 34 Grad Celsius wachsen. Fügen Sie 0,2 % Arabinose, 25 Milligramm pro Milliliter Chloramphenicol und 100 Milligramm pro Milliliter Ampicillin hinzu und lassen Sie die Zellen weitere sechs Stunden lang bei 250 U/min züchten.Waschen Sie die Bakterien nach sechs Stunden viermal in einem Intervall von 30 Minuten mit frischem MgM-Medium ohne nicht-kanonische Aminosäuren oder ncAA. Zentrifugieren Sie die Bakterien, suspendieren Sie sie erneut in PBS-Puffer und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln, um überschüssige ncAAs zu entfernen. Nach einer Stunde zentrifugieren Sie die Bakterien bei 3.000 G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius und lagern sie für die weitere Verwendung.Für ein Kontrollexperiment wiederholen Sie das gleiche Experiment, indem Sie ncAA-tragende Proteine in Abwesenheit von ncAA exprimieren. Resuspendierung von Salmonellenzellen, die SseJ exprimieren, das mit TCO inkorporiert ist, wenn TCO in PBS fehlt oder vorhanden ist. Stellen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern auf vier in PBS ein und inkubieren Sie die Zellen mit 20 mikromolaren Janelia Fluor 646-Tetrazen oder 20 mikromolaren BDPFL-Tetrazin bei 37 Grad Celsius im Dunkeln und schütteln Sie sie ein bis zwei Stunden lang bei 250 U/min.Die Zellen pelletieren und drei- bis viermal mit PBS waschen, das 5 % DMSO und 0,2 % Pluronic F-127 enthält. Resuspendieren Sie das Pellet in PBS, das 5 % DMSO enthält. Nach der Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius im Dunkeln zweimal mit PBS waschen.Nehmen Sie die Zellen sofort mit einem konfokalen Mikroskop auf oder fixieren Sie sie mit 1,5 % Paraformaldehyd in PBS für 30 bis 45 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Kultivieren und pflegen Sie HeLa-Zellen bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit in DMEM mit hohem Glukosegehalt, ergänzt mit 10 % FBS zusätzlich zu Penicillin-Streptomycin. Kultivieren Sie Bakterien einen Tag vor der Infektion und inokulieren Sie eine einzelne Kolonie von Wildtyp-Salmonellen mit einem pEVOL-Plasmid, das ein orthogonales tRNA-Synthetase-Paar und ein pWSK29-Plasmid mit SseJ-Gen enthält, in fünf Millimetern antibiotikahaltiger Standard-LB-Brühe über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 250 U/min.Reparieren Sie einen verdünnten Zellbestand mit 100.000 Zellen pro Milliliter und säen Sie 50.000 HeLA-Zellen pro Well in 500 Mikroliter DMEM, das 10 % FBS-Wachstumsmedium enthält, in einen Objektträger mit acht Wells. Bewahren Sie den Kammerschlitten 24 Stunden lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit auf. Für die bakterielle Infektion werden Wildtyp-Salmonellen mit pEVOL-Plasmid und pWSK29-Plasmid, die das SseJ-Gen enthalten, subkultiviert, indem 100 Mikroliter Bakterienkultur über Nacht in drei Milliliter LB-Medium mit 35 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol und 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin verdünnt werden.Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius unter Schütteln bei 250 U/min für fünf bis sieben Stunden. Um die HeLa-Zellinfektion einzuleiten, waschen Sie die Zellen nach der Entnahme der HeLa-Zellen aus dem Inkubator mit vorgewärmtem DPBS und geben Sie 500 Mikroliter frisches DMEM mit 10 % FBS in jede Vertiefung. Legen Sie den Kammerschieber wieder in den Kohlendioxid-Inkubator, bis die Infektion beginnt.Nach fünf bis sieben Stunden Inkubationszeit verdünnen Sie die Salmonellenkultur so, dass die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,2 in einem Milliliter DMEM-Nährmedium beträgt, und geben Sie die erforderlichen Mengen des Salmonellen-Inokulums in jede Vertiefung des Kammerobjektträgers, so dass die Multiplizität der Infektion 100 beträgt. Nachdem Sie die infizierten Zellen 30 Minuten lang in einem Kohlendioxid-Inkubator inkubiert haben, waschen Sie die Zellen dreimal mit vorgewärmtem DPBS, um extrazelluläre Salmonellen zu entfernen. Stellen Sie diesen Zeitpunkt auf null Stunden nach der Infektion und fügen Sie eine Stunde lang 500 Mikroliter komplettes Medium mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Gentamicin hinzu.Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation erneut dreimal mit DPBS, wie zuvor gezeigt, und geben Sie 500 Mikroliter des vollständigen Mediums, ergänzt mit 0,2 % Arabinose, 10 Mikrogramm pro Milliliter Gentamicin, in jede Vertiefung des Kammerobjektträgers. Führen Sie in einem Kontrollexperiment ähnliche Infektionen von HeLa-Zellen ohne TCO durch. Nach 10-stündiger Inkubation des Kammerobjektträgers im Kohlendioxid-Inkubator wird das komplette Medium durch frisches Komplettmedium ohne TCO ersetzt und die HeLa-Zellen viermal im Abstand von jeweils 30 Minuten mit vorgewärmtem DPBS gewaschen.Waschen Sie dann die Zellen mit frischem Komplettmedium ohne TCO. Nach 12 Stunden nach der Infektion saugen Sie das Medium von den Zellen ab und waschen Sie die Zelle zwei- bis dreimal mit vorgewärmtem DPBS. In eine Gruppe der Vertiefungen geben Sie 500 Mikroliter der Farbstofflösungsmischung eins hinzu, und in eine andere Gruppe der Vertiefungen desselben Kammerschiebers fügen Sie 500 Mikroliter der Farbstofflösungsmischung zwei hinzu.Legen Sie die Kammerobjektträger für ein und 1/2 bis zwei Stunden zurück in den Kohlendioxid-Inkubator. Nach 13,5 bis 14 Stunden nach der Infektion werden die HeLa-Zellen zweimal mit vorgewärmtem DPBS gespült und 500 Mikroliter frisches DMEM, ergänzt mit FBS, hinzugefügt. Waschen Sie die Zellen nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten erneut mit vorgewärmtem DPBS, wie zuvor gezeigt, und waschen Sie sie dann viermal im Abstand von 30 Minuten mit frischem DMEM.Fixieren Sie die HeLa-Zellen 16 Stunden nach der Infektion mit Paraformaldehyd, indem Sie 200 Mikroliter 4%Paraformaldehyd in jede Vertiefung geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Das Paraformaldehyd absaugen. Spülen Sie dreimal mit PBS und lagern Sie die Zellen in PBS bei vier Grad Celsius im Dunkeln.Bringen Sie die Zellen zum Mikroskop und platzieren Sie die Bildgebungskammer auf dem Mikroskoptisch im Probenhalter. Wechseln Sie dann das Medium in der Vertiefung mit 0,4 Millilitern des frisch hergestellten GLOX BME-Bildverarbeitungspuffers. Verringern Sie die Laserleistung auf etwa ein Milliwatt, um eine HeLa-Zelle von Interesse zu identifizieren, und passen Sie die Fokusebene und den Laserstrahlwinkel an, während Sie die Probe mit niedrigen Laserdichten von 647 Nanometern beleuchten.Passen Sie den HILO-Beleuchtungswinkel an. Nehmen Sie ein referenziertes und fraktionsbegrenztes Bild der Zielstruktur auf und schalten Sie die Fluorophore in den dunklen Zustand, indem Sie den Laser auf seine maximale Leistung drehen. Stellen Sie die Verstärkung des Vorverstärkers auf drei und aktivieren Sie die Bildübertragung.Stellen Sie dann die EM-Verstärkung auf 200 ein, um eine höhere Empfindlichkeit bei dSTORM-Messungen zu erzielen. Stellen Sie die Laserstärke auf ein geeignetes Niveau ein, bei dem Blinkereignisse räumlich und zeitlich getrennt sind. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 30 Millisekunden ein und beginnen Sie mit der Aufnahme.Erfassen Sie 10.000 bis 30.000 Frames. Wiederholen Sie die ähnliche Erfassung mit unterschiedlichen ROIs. Öffnen Sie für die Bilddatenrekonstruktion von dSTORM Bild J und importieren Sie die Rohdaten.Öffnen Sie das Thunderstorm-Plugin und konfigurieren Sie die Kameraeinstellung, die dem Gerät entspricht. Wechseln Sie zu Analyse ausführen und legen Sie die entsprechenden Einstellungen fest, z. B. Bildfilterung, Lokalisierungsmethoden und Subpixellokalisierung von Molekülen. Klicken Sie auf OK, um die Bildrekonstruktion zu starten und die Endergebnisanalyse der Nachbearbeitung zu starten.Salmonellen, die SseJ exprimieren und mit TCO inkorporiert sind, werden mit Janelia Fluor 646 Tetrazin behandelt und mit Janelia Fluor 646 Fluoreszenz in Abwesenheit oder Vorhandensein von TCO abgebildet. Die Fluoreszenz von SseJ wird nur detektiert, wenn TCO vorhanden ist. HeLa-Zellen werden 16 Stunden lang mit Salmonellen infiziert, die psseJ-HA beherbergen, fixiert und mit Anti-HA-Antikörpern, LPS und DAPI immungefärbt.Erwartungsgemäß werden in den infizierten Zellen SseJ-abhängige Salmonellen-induzierte Filamente, kurz SIFs, gebildet. In Abwesenheit von TCO wird das bernsteinfarbene Codon nicht unterdrückt, und SseJ-abhängige SIFs fehlen in infizierten HeLa-Zellen. SseJ-abhängige SIFs werden in Gegenwart von TCO beobachtet, was eindeutig darauf hindeutet, dass SseJ durch die Expression von SseJF10TCOHA mittels genetischer Code-Expansion (GCE) gerettet wurde.Die Markierungsspezifität von sezerniertem SseJF10TCOHA in HeLa-Zellen durch SPIEDAC-Click-Reaktionen unter Verwendung von zwei alternativen Farbstoffmischungen eins und Farbstoffmischungen zwei wird hier gezeigt. Der Click-Farbstoff Janelia Fluor 646 TZ wurde weiterhin verwendet, um zu beobachten, ob es in HeLa-Zellen, die mit Wildtyp-Salmanella infiziert waren, die SseJ HA trugen, in Gegenwart von TCO- und P-Tresorplasmid eine Hintergrundmarkierung gab. SseJ wurde in das Zytoplasma der Wirtszelle freigesetzt, ohne intrazelluläre oder unspezifische Fluoreszenzsignale, was darauf hindeutet, dass das Fluoreszenzsignal spezifisch für SseJ ist.Die hochauflösende Bildgebung von GCE-markiertem SseJ in HeLa-Zellen ist in dieser Abbildung dargestellt. Eine Hellfeldaufnahme einer HeLa-Zelle unter Beobachtung ist hier zu sehen. Das beugungsbegrenzte Weitfeldbild von sekretiertem SseJ, markiert mit TCO und Janelia Fluor 646, und das entsprechende dSTORM-Bild der SseJ-dekorierten SIFs werden hier vorgestellt.Das Insert zeigt eine vergrößerte Ansicht eines superaufgelösten SseJ im Boxed-Bereich. NCAA-Stammlösungen wurden in NaOH vorbereitet. Vergessen Sie nicht, es vor oder nach der Zugabe zum Medium zu neutralisieren.Nachdem Sie das gewünschte Protein markiert haben, waschen Sie die Zelle ausgiebig, so dass das Hintergrundsignal minimal ist. Nach unserem GCE-Verfahren können wir nun jeden Virulenzfaktor in Bakterien markieren und seine Aktivität mit unseren bildgebenden Verfahren verfolgen.

Research

JoVE Journal

Biology

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Forschung

Biologie

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Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

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