Name: super-resolution imaging of bacterial secreted proteins using genetic code expansion
Uploaded: 2023-02-10T13:23:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי קרנות סטארט-אפ מהשלוחה הרפואית של אוניברסיטת טקסס, גלווסטון, טקסס, ופרס טקסס סטאר ל- L.J.K. אנו מודים לפרופ' אדוארד למקה (המעבדה האירופית לביולוגיה מולקולרית, היידלברג, גרמניה) על פלסמיד pEVOL-PylRS-AF. התמונות באיור 1 נוצרו באמצעות BioRender.

1. בניית פלסמיד
<ol><li>שכפל את הגן המבטא את נקודת העניין לפלסמיד ביטוי (לדוגמה, pET28a-sseJ 10TAG) המבטא את נקודת העניין ב- E. coli BL21 (DE3). צעד זה מאפשר לקבוע כי המוטנטים מתפקדים.</li>
	<li>לצורך הדמיה של אפקטים המופרשים בסלמונלה בתאים מארחים, בנו פלסמיד ביטוי (pWSK29-sseJ-HA) המבטא את נקודת הע...

<ol>
	<li>Marlovits, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+assembly+of+the+type+III+secretion+needle+complex.">Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex.</a> Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).</li><li>Kubori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+structure+of+the+Salmonella+typhimurium+type+III+protein+secretion+system.">Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system.</a> Science. 280 (5363), 602-605 (1998).</li><li>LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonellae+interactions+with+host+processes.">Salmonellae interactions with host processes.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).</li><li>Galan, J. E., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-injection+machines+in+bacteria.">Protein-injection machines in bacteria.</a> Cell. 172 (6), 1306-1318 (2018).</li><li>Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+by+phospho-OmpR+of+ssrA/B+gene+expression+in+Salmonella+pathogenicity+island+2.">Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2.</a> Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).</li><li>Walthers, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+response+regulator+SsrB+relieves+H-NS+silencing+by+displacing+H-NS+bound+in+polymerization+mode+and+directly+activates+transcription.">Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).</li><li>Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+DNA+biosensor+tracks+OmpR-dependent+acidification+of+Salmonella+during+macrophage+infection.">A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection.</a> PLoS Biology. 13 (4), e1002116 (2015).</li><li>Liew, A. T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell,+super-resolution+imaging+reveals+an+acid+pH-dependent+conformational+switch+in+SsrB+regulates+SPI-2.">Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2.</a> eLife. 8, e45311 (2019).</li><li>Knuff, K., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+the+SIF+is+happening-the+role+of+intracellular+Salmonella-induced+filaments.">What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335 (2017).</li><li>Drecktrah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+behavior+of+Salmonella-induced+membrane+tubules+in+epithelial+cells.">Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells.</a> Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).</li><li>Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+induces+the+formation+of+filamentous+structures+containing+lysosomal+membrane+glycoproteins+in+epithelial+cells.">Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).</li><li>Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+code+expansion+enables+visualization+of+Salmonella+type+three+secretion+system+components+and+secreted+effectors.">Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors.</a> elife. 10, e67789 (2021).</li><li>Singh, M. K., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+bacterial+pathogens+and+visualization+of+their+secreted+effectors.">Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors.</a> FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050 (2020).</li><li>Akeda, Y., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+release+and+unfolding+of+substrates+in+type+III+secretion.">Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion.</a> Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).</li><li>Su, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+as+tools+to+aid+protein+production.">Fluorescent proteins as tools to aid protein production.</a> Microbial Cell Factories. 4 (1), 12 (2005).</li><li>Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+development+of+photoactivatable+fluorescent+proteins+for+single-molecule-based+superresolution+imaging.">Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).</li><li>Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+specific+mislocalization+of+red+fluorescent+proteins+in+live+Escherichia+coli.">Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).</li><li>Gahlmann, A., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+bacterial+cell+biology+with+single-molecule+tracking+and+super-resolution+imaging.">Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging.</a> Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).</li><li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).</li><li>Gautier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+protein+tag+for+multiprotein+labeling+in+living+cells.">An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells.</a> Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).</li><li>Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+fluorescence+complementation+platform+for+visualizing+Salmonella+effector+proteins+reveals+distinctly+different+intracellular+niches+in+different+cell+types.">Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types.</a> ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).</li><li>Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell-based+optimization+of+the+biarsenical-binding+tetracysteine+motif+for+improved+fluorescence+and+affinity.">Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity.</a> Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li><li>Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pearling+transition+provides+evidence+of+force-driven+endosomal+tubulation+during+Salmonella+infection.">The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection.</a> mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).</li><li>Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SifA,+a+type+III+secreted+effector+of+Salmonella+typhimurium,+directs+Salmonella-induced+filament+(Sif)+formation+along+microtubules.">SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules.</a> Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).</li><li>Lang, K., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+incorporation+of+unnatural+amino+acids+and+bioorthogonal+labeling+of+proteins.">Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins.</a> Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).</li><li>Davis, L., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+proteins:+applications+of+genetic+code+expansion+in+cell+biology.">Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).</li><li>Chin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+p-azido-L-phenylalanine+to+the+genetic+code+of+Escherichia+coli.">Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).</li><li>Kipper, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+noncanonical+amino+acids+for+protein+labeling+in+a+genomically+recoded+Escherichia+coli.">Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).</li><li>Uttamapinant, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+code+expansion+enables+live-cell+and+super-resolution+imaging+of+site-specifically+labeled+cellular+proteins.">Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins.</a> Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).</li><li>Plass, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+for+Diels-Alder+reactions+in+living+cells.">Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).</li><li>Lang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+encoding+of+bicyclononynes+and+trans-cyclooctenes+for+site-specific+protein+labeling+in+vitro+and+in+live+mammalian+cells+via+rapid+fluorogenic+Diels-Alder+reactions.">Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-exploration+of+the+codon+context+effect+on+amber+codon-guided+incorporation+of+noncanonical+amino+acids+in+Escherichia+coli+by+the+blue-white+screening+assay.">Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay.</a> ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).</li><li>Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+tabulated+from+the+international+DNA+sequence+databases:+status+for+the+year+2000.">Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 292 (2000).</li><li>Spahn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+super-resolution+imaging+of+bacterial+regulatory+proteins:+the+nucleoid+and+the+cell+membrane+in+single,+fixed+E.+coli+cells.">Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).</li><li>Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy.">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li><li>Xu, J., Ma, H., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy+(STORM).">Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM).</a> Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).</li><li>Meineke, B., Heimg&#228;rtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Els&#228;sser, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+incorporation+of+two+ncAAs+for+two-color+bioorthogonal+labeling+and+crosslinking+of+proteins+on+live+mammalian+cells.">Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells.</a> Cell Reports. 31 (12), 107811 (2020).</li><li>Bessa-Neto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+labeling+of+transmembrane+proteins+with+non-canonical+amino+acids+unveils+masked+epitopes+in+live+neurons.">Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons.</a> Nature Communications. 12 (1), 6715 (2021).</li><li>Beliu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+labeling+with+tetrazine-dyes+for+super-resolution+microscopy.">Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy.</a> Communication Biology. 2, 261 (2019).</li><li>Arsi&#263;, A., Hagemann, C., Stajkovi&#263;, N., Schubert, T., Niki&#263;-Spiegel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+genetically+encoded+tags+for+fluorescent+protein+labeling+in+living+neurons.">Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons.</a> Nature Communications. 13 (1), 314 (2022).</li></ol>

הגישה המתוארת כאן שימשה למעקב אחר המיקום המדויק של חלבוני אפקט המוזרקים לתא המארח על ידי החיידק T3SS לאחר ההדבקה. T3SSs משמשים פתוגנים תוך תאיים כגון סלמונלה, שיגלה וירסיניה, כדי להעביר רכיבים אלימים לתוך הפונדקאי. הפיתוח של טכנולוגיות הדמיה ברזולוציית על איפשר לדמיין גורמי אלי...

זיהומים חיידקיים נחשבים זה מכבר לסכנה חמורה לבריאות האדם. פתוגנים משתמשים במערכות הגנה מפותחות, חזקות מאוד ומורכבות, כמו גם במגוון גורמי אלימות חיידקיים (המכונים חלבוני אפקטור) כדי להתחמק מתגובות החיסון של המאכסן וליצור זיהומים 1,2. עם זאת, המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס מערכות אלה ותפקידם של חלבוני השפעה בודדים עדיין אינם ידועים במידה רבה בשל המחסור בגישות מתאימות למעקב ישיר אחר רכיבי החלבון החיוניים והמשפיעים בתאים המארחים במהלך הפתוגנזה.
דוגמה אופיינית אחת היא Salmonella enterica serovar Typhimurium, אשר גורם דלקת גסטרואנטריטיס חריפה. סלמונלה טיפימוריום משתמש במערכות הפרשה מסוג שלוש (T3SS) כדי להזריק מגוון חלבונים משפיעים ישירות לתאים מארחים. ברגע שהסלמונלה נכנסת לתא המארח, היא שוכנת בתא הקשור לקרום חומצי, המכונה VACUOLE המכיל סלמונלה (SCV)3,4. ה- pH החומצי של ה- SCV מפעיל את האי T3SS המקודד לסלמונלה פתוגניות 2 (SPI-2) ומעביר מטח של 20 חלבוני השפעה או יותר על פני הממברנה החללית לתוך הציטוזול המארח 5,6,7,8. בתוך הפונדקאי, קוקטיילים מורכבים אלה של חלבוני אפקט מתמרנים באופן מתאם את מסלולי האיתות של תאי המארח, וכתוצאה מכך נוצרים מבנים צינוריים דינמיים ומורכבים ביותר המשתרעים מה- SCV לאורך מיקרוטובולים, המכונים חוטים המושרים על ידי סלמונלה (SIFs), המאפשרים לסלמונלה לשרוד ולשכפל בתוך תאי המאכסן 9,10,11.
שיטות לדמיין, לעקוב ולנטר לוקליזציה של גורמים חיידקיים, ולבחון את הסחר והאינטראקציות שלהם בתוך תאים מארחים, מספקות תובנה קריטית לגבי המנגנונים העומדים בבסיס הפתוגנזה החיידקית. תיוג ולוקליזציה של חלבוני אפקט T3SS המופרשים בסלמונלה בתוך תאי המאכסן הוכיחו את עצמם כאתגר טכנולוגי12,13; עם זאת, התפתחותם של חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית שינתה את יכולתנו לחקור ולדמיין חלבונים בתוך מערכות חיות. עם זאת, גודלם של חלבונים פלואורסצנטיים (~25-30 kDa)15 דומה לעתים קרובות או אפילו גדול מזה של החלבון המעניין (POI; למשל, 13.65 kDa עבור SsaP, 37.4 kDa עבור SifA). למעשה, סימון חלבון פלואורסצנטי של אפקטורים חוסם לעתים קרובות את הפרשת האפקט המסומן ותוקע את T3SS14.
יתר על כן, חלבונים פלואורסצנטיים הם פחות יציבים ופולטים מספר נמוך של פוטונים לפני הלבנה, מה שמגביל את השימוש בהם בטכניקות מיקרוסקופיות ברזולוציה סופר 16,17,18, במיוחד במיקרוסקופ לוקליזציה פוטואקטיבציה (PALM), STORM ומיקרוסקופ דלדול פליטה מגורה (STED). בעוד התכונות הפוטופיזיקליות של צבעים פלואורסצנטיים אורגניים עדיפות על אלה של חלבונים פלואורסצנטיים, שיטות/טכניקות כגון CLIP/SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH/FlAsH 22,23 ו-HA-Tags 24,25 דורשות תוספת חלבון או נספח פפטידי שעלול לפגוע במבנה-תפקוד של חלבון המשפיע המעניין על ידי הפרעה לשינוי או סחר לאחר תרגום. שיטה חלופית הממזערת את שינוי החלבונים הדרוש כוללת שילוב של ncAAs לתוך POI במהלך תרגום באמצעות GCE. ncAAs הם פלואורסצנטיים או ניתן להפוך פלואורסצנטי באמצעות כימיה קליק 12,13,26,27,28.
באמצעות GCE, ncAAs עם קבוצות ביו-אורתוגונליות זעירות, פונקציונליות (כגון אזיד, ציקלופרופן או קבוצת ציקלואוקטיין) יכולות להיות מוצגות כמעט בכל מקום בחלבון המטרה. באסטרטגיה זו, קודון יליד מוחלף עם קודון נדיר כגון קודון עצירה ענברי (TAG) במיקום מוגדר בגן של POI. החלבון המהונדס מתבטא לאחר מכן בתאים לצד זוג אמינואציל-tRNA סינתאז/tRNA אורתוגונלי. האתר הפעיל tRNA synthetase מתוכנן לקבל רק ncAA מסוים אחד, אשר לאחר מכן מחובר באופן קוולנטי לקצה 3' של tRNA המזהה את קודון הענבר. ה-ncAA פשוט מוכנס למדיום הגידול, אבל הוא חייב להיקלט על ידי התא ולהגיע לציטוזול שבו האמינואציל-tRNA סינטטאז (aaRS) יכול לקשר אותו ל-tRNA האורתוגונלי; לאחר מכן הוא משולב בנקודת העניין במיקום שצוין (ראה איור 1)12. לפיכך, GCE מאפשר שילוב ספציפי לאתר של שפע של קבוצות תגובתיות ביו-אורתוגונליות כגון קטון, אזיד, אלקין, ציקלואוקטיין, טרנסציקלוקטן, טטרזין, נורבונן, α, אמיד β בלתי רווי וביציקלו [6.1.0]-nonyne לתוך POI, ובכך עשוי להתגבר על המגבלות של שיטות סימון חלבונים קונבנציונליות 12,26,27,28.
מגמות חדשות בטכניקות הדמיה ברזולוציית על פתחו דרכים חדשות לחקור מבנים ביולוגיים ברמה המולקולרית. בפרט, STORM, טכניקה של מולקולה יחידה, מבוססת לוקליזציה, ברזולוציית על, הפכה לכלי רב ערך לדמיין מבנים תאיים עד ~20-30 ננומטר והוא מסוגל לחקור תהליכים ביולוגיים מולקולה אחת בכל פעם, ובכך לגלות את תפקידן של מולקולות תוך תאיות שעדיין אינן ידועות במחקרים מסורתיים ממוצעים13 . טכניקות של מולקולה בודדת וסופר-רזולוציה דורשות תג קטן עם פלואורופורים אורגניים בהירים הניתנים לצילום לקבלת הרזולוציה הטובה ביותר. לאחרונה הדגמנו כי GCE יכול לשמש לשילוב בדיקות מתאימות להדמיה ברזולוציית על12.
שתיים מהבחירות הטובות ביותר לסימון חלבונים בתאים הן bicyclo [6.1.0] nonynelysine (BCN) ו-trans-cyclooctene-lysine (TCO; מוצג באיור 1), אשר עשוי להיות מקודד גנטית באמצעות גרסה של זוג tRNA/synthetase (כאן נקרא tRNAPyl/PylRS AF), כאשר Pyl מייצג pyrrolysine, ו-AF מייצג מוטציה כפולה מתוכננת באופן רציונלי (Y306A, Y384F) שמקורה ב-Methanosarcina mazei המקודד באופן טבעי פירוליזין12, 29,30,31. באמצעות תגובת SPIEDAC (ראשי תיבות של Diels-Alder cycloaddition - Diels-Alder cycloaddition) המקודמת על ידי זן, חומצות אמינו אלה מגיבות באופן כימוסלקטי עם מצומדות טטרזין (איור 1)12,30,31. תגובות ציקלואידיות כאלה מהירות במיוחד ותואמות תאים חיים; הם עשויים גם להיות פלואורוגניים, אם פלואורופור מתאים הוא פונקציונלי עם tetrazine moiety12,26,32. מאמר זה מציג פרוטוקול אופטימלי לניטור הדינמיקה של אפקטורים חיידקיים המועברים לתאים מארחים באמצעות GCE, ולאחר מכן לוקליזציה תת-תאית של חלבונים המופרשים בתאי HeLa באמצעות dSTORM. התוצאות מצביעות על כך ששילוב של ncAA באמצעות GCE, ואחריו תגובת קליק עם צבעים נושאי טטרזין פלואורוגניים, מייצג שיטה רב-תכליתית לתיוג סלקטיבי, הדמיה של חלבונים מופרשים ולאחר מכן לוקליזציה תת-תאית בפונדקאי. עם זאת, ניתן להתאים או להחליף את כל המרכיבים והנהלים המפורטים כאן, כך שניתן יהיה להתאים את מערכת GCE לחקר שאלות ביולוגיות אחרות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine SDS running buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A661-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulphate</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP212R-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>ThermiFischer Scientific</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Agar</td>
			<td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDP-FL-tetrazine</td>
			<td>Lumiprobe (USA)</td>
			<td>2.14E+02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>444203</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en &#8211; L - Lysine (TCO*A)</td>
			<td>SiChem GmbH</td>
			<td>SC-8008</td>
			<td>Size: 500 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (Hoechst33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeNovix DS-11+ Spectrophotometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM*</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>* Used for maintaining HeLa Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM**</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>**Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain BL21 (DE3)</td>
			<td>Novagen (Madison, WI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 897-BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>30123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>97203</td>
			<td>Pack of 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7141-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BF229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-C1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocloric acid</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image processing and analysis:&#160; http://rsbweb.nih.gov/ij</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>Coomassie-based stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janelia Fluoro 646-tetrazine</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;Manager (v. 1.4.2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pulser cuvette</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2086</td>
			<td>0.2 cm electrode gap, pkg. of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon N-STORM</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks</td>
			<td>ThermiFischer Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnipur Casamino Acid</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>2240</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehhyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (100x)</td>
			<td>GenDEPOT&#160;</td>
			<td>CA005-010</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL-PylRS-AF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For plasmid construction and map see following references 
			1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 
			2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Mini-prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: elife. 2021, 10, e67789.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pWSK29-sseJ-HA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: elife. 2021, 10, e67789.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>540025</td>
			<td>Protein grade, 10% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sulphate</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>424220250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>539131</td>
			<td>100x Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-HA primary antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. enterica. serovar Typhimurium 14028s</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036-50G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM), 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-C1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator Model 100</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>24932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system)</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThunderSTORM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://zitmen.github.io/thunderstorm/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (1x), 0.25%&#160;&#160;</td>
			<td>GenDEPOT&#160;</td>
			<td>CA014-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-well tissue culture chamber slides</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>94.6190.802</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of bacterial secreted proteins using genetic code expansion

מערכות הפרשה מסוג שלוש (T3SSs) מאפשרות לחיידקים גראם-שליליים להזריק סוללה של חלבוני אפקט ישירות לתוך הציטוזול של תאי המאכסן האיקריוטיים. עם כניסתם, חלבוני ההשפעה המוזרקים מווסתים בשיתוף פעולה מסלולי איתות אאוקריוטים ומתכנתים מחדש תפקודים תאיים, מה שמאפשר כניסה והישרדות של חיידקים. ניטור ולוקליזציה של חלבוני השפעה מופרשים אלה בהקשר של זיהומים מספק טביעת רגל להגדרת הממשק הדינמי של אינטראקציות מארח-פתוגן. עם זאת, תיוג והדמיה של חלבוני חיידקים בתאים מארחים מבלי לשבש את המבנה / תפקוד שלהם הוא מאתגר מבחינה טכנית. 
בניית חלבוני היתוך פלואורסצנטיים אינה פותרת בעיה זו, מכיוון שחלבוני ההיתוך תוקעים את מנגנון ההפרשה ולכן אינם מופרשים. כדי להתגבר על מכשולים אלה, השתמשנו לאחרונה בשיטה לתיוג פלואורסצנטי ספציפי לאתר של חיידקים המופרשים אפקטורים, כמו גם חלבונים אחרים שקשה לתייג, באמצעות הרחבת קוד גנטי (GCE). מאמר זה מספק פרוטוקול מלא שלב אחר שלב לסימון אפקטורים המופרשים בסלמונלה באמצעות אתר GCE ספציפי, ואחריו הוראות להדמיית לוקליזציה תת-תאית של חלבונים המופרשים בתאי HeLa באמצעות מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM) 
ממצאים אחרונים מצביעים על כך ששילוב של חומצות אמינו לא קנוניות (ncAAs) באמצעות GCE, ואחריו תיוג ביו-אורתוגונלי עם צבעים המכילים טטרזין, היא טכניקה בת קיימא לתיוג סלקטיבי והדמיה של חלבונים המופרשים על ידי חיידקים וניתוח תמונה לאחר מכן בפונדקאי. מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול פשוט וברור שיכול לשמש חוקרים המעוניינים לבצע הדמיה ברזולוציית על באמצעות GCE כדי לחקור תהליכים ביולוגיים שונים בחיידקים ווירוסים, כמו גם אינטראקציות מארח-פתוגן.

נייר פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת GCE לתיוג פלואורסצנטי ספציפי לאתר ולהדמיה של אפקטורים המופרשים מסלמונלה, כפי שמתואר באיור 1. המבנה הכימי של קבוצת ה-ncAA הנושאת טרנס-ציקלואוקטן ביו-אורתוגונלי (TCO) והצבע הפלואורסצנטי מוצגים באיור 1A. תיוג ...

Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion at JoVE.com

Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion

מאמר זה מספק פרוטוקול פשוט וברור לסימון אפקטורים המופרשים בסלמונלה באמצעות אתר הרחבת קוד גנטי (GCE) ספציפי ותמונה של לוקליזציה תת-תאית של חלבונים המופרשים בתאי HeLa באמצעות מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM)

הדמיה ברזולוציית על של חלבונים המופרשים על ידי חיידקים באמצעות הרחבת קוד גנטי

Type three secretion systems (T3SSs) enable gram-negative bacteria to inject a battery of effector proteins directly into the cytosol of eukaryotic host ...

הרחבת הקוד הגנטי, או GCE, מתגברת על מגבלות של אסטרטגיות תיוג אחרות. זה מאפשר לנו לאתר חלבונים מסומנים ספציפית, ויש לנו פלואורופורים אורגניים בהירים המאפשרים הדמיה שלהם, כך שאנו יכולים להימנע מאסטרטגיות שיוצרות, למשל, איחוי חלבונים פלואורסצנטיים, שיכולים לשבש את תפקוד החלבון. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מערכת אחרת.לדוגמה, השתמשנו בו כדי לתייג חלבון זיקה CO, וזה מאפשר לנו לספק ולייצר נגיף זיקה מסומן שנוכל לצפות בו מדביק תאים מארחים. כדי להתחיל, להעביר 100 מיקרוליטר של תרבית ראשונית לתוך חמישה מיליליטר של LB בינוני המכיל 35 מיקרוגרם למיליליטר chloramphenicol ו 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין. דוגרים ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-250 סל"ד עד שהצפיפות האופטית ב-600 ננומטר מגיעה ל-0.6.החלף את מדיום LB בתווך N-minimal שונה בתוספת TCO מילימולרי אחד, חומצת אמינו לא קנונית. ולגדל את החיידקים ב 34 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. מוסיפים 0.2% אראבינוז, 25 מיליגרם למיליליטר כלוראמפניקול ו-100 מיליגרם למיליליטר אמפיצילין, ומגדלים את התאים עוד שש שעות, תוך רעידות ב-250 סל"ד.לאחר שש שעות, שטפו את החיידקים ארבע פעמים במרווח של 30 דקות עם מדיה טרייה של MgM ללא חומצות אמינו לא קנוניות או, ncAA. צנטריפוגו את החיידקים, השהו מחדש במאגר PBS, ודגרו במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס בחושך כדי להסיר עודפי ncAAs. לאחר שעה, צנטריפוגה את החיידקים ב 3, 000 גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחסן אותם לשימוש נוסף.עבור ניסוי בקרה, חזור על אותו ניסוי על ידי ביטוי חלבונים נושאי ncAA בהיעדר ncAA. השהיה מחדש של תאי סלמונלה המבטאים SseJ בשילוב עם TCO בהיעדר או נוכחות של TCO ב- PBS. התאימו את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר לארבעה ב-PBS, ודגרו על התאים עם 20 מיקרומולרי Janelia Fluor 646 tetrazene או 20 micromolar BDPFL tetrazine ב-37 מעלות צלזיוס בחושך, ונערו במשך שעה עד שעתיים ב-250 סל"ד.יש לשטוף את התאים שלוש עד ארבע פעמים עם PBS המכיל 5% DMSO ו-0.2% F-127 פלורוני. יש להשעות מחדש את הגלולה ב-PBS המכילה 5% DMSO. לאחר הדגירה במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס בחושך, יש לשטוף שוב פעמיים עם PBS.דמיינו את התאים מיד באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, או קבעו אותם עם 1.5% פרפורמלדהיד ב-PBS למשך 30 עד 45 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. תרבית ותחזוקת תאי HeLa בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ו-95% לחות ב-DMEM עתיר גלוקוז בתוספת 10% FBS בנוסף לפניצילין סטרפטומיצין. תרבית חיידקים יום לפני ההדבקה ותחסן מושבה אחת של סלמונלה פראית המכילה פלסמיד pEVOL המכיל זוג tRNA סינטטאז אורתוגונלי ופלסמיד pWSK29 המכיל גן SseJ בחמישה מילימטרים של אנטיביוטיקה המכילה מרק LB סטנדרטי למשך הלילה ב 37 מעלות צלזיוס עם טלטול ב 250 סל"ד.לתקן מלאי תאים מדולל ב 100, 000 תאים למיליליטר זרע 50, 000 תאי HeLA לכל באר ב 500 מיקרוליטר של DMEM המכיל 10% FBS מדיום גידול בשקופית שמונה באר. שמור את התא מחליק באינקובטור למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ו-95% לחות. עבור זיהום חיידקי, תת-תרבית סלמונלה מסוג פרא המכילה פלסמיד pEVOL ופלסמיד pWSK29 המכיל גן SseJ על ידי דילול 100 מיקרוליטר של תרבית חיידקים בן לילה לשלושה מיליליטר של מדיום LB המכיל 35 מיקרוגרם למיליליטר כלוראמפניקול ו-100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין.דוגרים ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-250 סל"ד למשך חמש עד שבע שעות. כדי ליזום את זיהום תאי HeLa, לאחר הוצאת תאי HeLa מהאינקובטור, לשטוף את התאים עם DPBS שחומם מראש, ולהוסיף 500 מיקרוליטר של DMEM טרי המכיל 10% FBS לכל באר. הניחו את החלקת התא בחזרה באינקובטור הפחמן הדו-חמצני עד לתחילת הזיהום.לאחר חמש עד שבע שעות של דגירה, לדלל את תרבית הסלמונלה כך שהצפיפות האופטית של 600 ננומטר היא 0.2 מיליליטר אחד של מדיום גידול DMEM, ולהוסיף את הכמויות הדרושות של חיסון הסלמונלה לכל באר של שקופית התא, כך שריבוי הזיהום הוא 100. לאחר הדגירה על התאים הנגועים באינקובטור פחמן דו חמצני במשך 30 דקות, שטפו את התאים שלוש פעמים עם DPBS שחומם מראש כדי להסיר סלמונלה חוץ-תאית. הגדר נקודת זמן זו לאפס שעות לאחר ההדבקה, והוסף 500 מיקרוליטר של מדיום שלם המכיל 100 מיקרוגרם למיליליטר של גנטמיצין למשך שעה אחת.לאחר הדגירה, שוב, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם DPBS כפי שהוצג קודם לכן ולהוסיף 500 מיקרוליטר של המדיום המלא בתוספת 0.2% arabinose, 10 מיקרוגרם למיליליטר של gentamicin לכל באר של שקופית התא. בניסוי בקרה, לבצע זיהומים דומים של תאי HeLa ללא TCO. לאחר הדגירה על שקופית התא במשך 10 שעות באינקובטור הפחמן הדו-חמצני, יש להחליף את המדיום המלא בתווך שלם טרי ללא TCO, ולשטוף את תאי HeLa ארבע פעמים במרווח של 30 דקות כל אחד עם DPBS שחומם מראש.לאחר מכן לשטוף את התאים עם מדיום שלם טרי ללא TCO. לאחר 12 שעות לאחר ההדבקה, לשאוף את התווך מן התאים ולשטוף את התא עם DPBS שחומם מראש פעמיים או שלוש פעמים. בקבוצה אחת של הבארות, להוסיף 500 מיקרוליטר של תערובת תמיסת צבע אחד, ובקבוצה אחרת של בארות של אותו שקופית החדר, להוסיף 500 מיקרוליטר של תערובת תמיסת צבע שניים.הניחו את החלקת התא בחזרה לתוך אינקובטור הפחמן הדו-חמצני למשך שעה וחצי עד שעתיים. לאחר 13.5 עד 14 שעות לאחר ההדבקה, שטפו את תאי HeLa פעמיים עם DPBS שחומם מראש, והוסיפו 500 מיקרוליטר של DMEM טרי בתוספת FBS. לאחר הדגירה במשך 30 דקות, שטפו שוב את התאים עם DPBS שחומם מראש כפי שהוצג קודם לכן, ולאחר מכן שטפו עם DMEM טרי ארבע פעמים במרווח של 30 דקות.ב 16 שעות לאחר ההדבקה, לתקן את תאי HeLa עם paraformaldehyde על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של 4% paraformaldehyde לכל באר ולדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לשאוף את paraformaldehyde. שטפו שלוש פעמים עם PBS, ואחסנו את התאים ב-PBS בארבע מעלות צלזיוס בחושך.הביאו את התאים למיקרוסקופ, והניחו את תא ההדמיה על במת המיקרוסקופ במחזיק הדגימה. לאחר מכן שנה את המדיום בבאר עם 0.4 מיליליטר של חיץ הדמיה GLOX BME טרי. הפחת את עוצמת הלייזר לכמילי-וואט אחד כדי לזהות תא HeLa מעניין וכוונן את מישור המוקד ואת זווית קרן הלייזר תוך הארת הדגימה בצפיפות לייזר נמוכה של 647 ננומטר.כוונן את זווית ההארה של HILO. צלם הפניה לתמונה מוגבלת חלקית של מבנה המטרה, והעבר את הפלואורופורים למצב כהה על ידי סיבוב הלייזר לעוצמתו המרבית. הגדר את רווח קדם-המגבר לשלוש והפעל את העברת המסגרת.לאחר מכן הגדר רווח EM ל- 200 לרגישות גבוהה יותר במדידות dSTORM. כוונן את עוצמת הלייזר לרמה מתאימה שבה אירועי מצמוץ מופרדים במרחב ובזמן. הגדר את זמן החשיפה ל- 30 אלפיות השנייה והתחל ברכישה.לרכוש 10, 000 עד 30, 000 מסגרות. חזור על רכישה דומה ב- ROI שונים. לשחזור התמונות של dSTORM, פתח את התמונה J וייבא את הנתונים הגולמיים.פתח את תוסף סופת הרעמים והגדר את הגדרת המצלמה המתאימה להתקן. עבור אל הפעלת ניתוח והגדר את ההגדרות המתאימות, כגון סינון תמונות, שיטות לוקליזציה ולוקליזציה של תת-פיקסלים של מולקולות. לחץ על אישור כדי להתחיל בשחזור התמונה ולהתחיל בניתוח התוצאה הסופית שלאחר העיבוד.סלמונלה המבטאת SseJ בשילוב TCO מטופלת עם Janelia Fluor 646 tetrazine ומצולמת עם Janelia Fluor 646 fluorescence בהיעדר או נוכחות של TCO. הפלואורסצנטיות של SseJ מזוהה רק כאשר TCO קיים. תאי HeLa נגועים בסלמונלה המכילה psseJ-HA למשך 16 שעות, קבועים ומוכתמים חיסונית בנוגדנים נגד HA, LPS ו- DAPI.כצפוי, חוטים המושרים בסלמונלה תלויי SseJ, או SIFs, נוצרים בתאים הנגועים. בהיעדר TCO, קודון הענבר אינו מדוכא, ו- SIF תלוי SseJ נעדר בתאי HeLa נגועים. SIFs תלויי SseJ נצפים בנוכחות TCO, מה שמצביע בבירור על כך ש- SseJ ניצל על ידי ביטוי של SseJF10TCOHA באמצעות הרחבת קוד גנטי, או GCE.ספציפיות התיוג של SseJF10TCOHA המופרש בתאי HeLa באמצעות תגובות לחיצה SPIEDAC באמצעות שתי תערובת צבע חלופית, אחת ותערובת צבע שתיים מוצגות כאן. צבע קליק Janelia Fluor 646 TZ שימש גם כדי לבחון אם יש תיוג רקע כלשהו בתאי HeLa נגועים בסלמנלה מסוג בר הנושא SseJ HA בנוכחות פלסמיד TCO ו- P vault. SseJ שוחרר לתוך הציטופלסמה של התא המארח ללא אותות פלואורסצנטיים תוך-תאיים או לא ספציפיים, מה שמוכיח כי האות הפלואורסצנטי היה ספציפי ל-SseJ.הדמיה ברזולוציית על של GCE המסומנת SseJ בתאי HeLa מוצגת באיור זה. תמונת שדה בהיר של תא HeLa תחת תצפית מוצגת כאן. תמונת השדה הרחב מוגבלת העקיפה של SseJ המופרש המסומנת עם TCO ו- Janelia Fluor 646 ותמונת dSTORM המתאימה של SIF המעוטרים ב- SseJ מוצגים כאן.ההוספה מציגה תצוגה מוגדלת של SseJ סופר פתור באזור התיבה. פתרונות מלאי NCAA הוכנו ב- NaOH. אל תשכחו לנטרל אותו לפני או אחרי התוספת לתקשורת.לאחר תיוג חלבון מעניין, לשטוף את התא בהרחבה, כך אות הרקע הוא מינימלי. בעקבות הליך GCE שלנו, כעת, אנו יכולים לתייג כל גורם אלים בחיידקים ולעקוב אחר פעילותו באמצעות טכניקות ההדמיה שלנו.

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

מחקרים גנטיים של חלבונים תיקון דנ&quot;א אנושי באמצעות שמרים כמודל למערכת

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

הדמית סופר רזולוציה של מכונות אגף קטריאלי

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

דוגמאות מבחן לייעול STORM סופר רזולוציה מיקרוסקופית

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

הדמיה ברזולוציה סופר של Cytokinetic Z הטבעת בחיידקים חיים באמצעות-Structured 3D מהיר תאורה מיקרוסקופית (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Barcoding הגנטי עם חלבונים ניאון עבור יישומי Multiplexed

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Electroporation, בידוד והדמיה של Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

הדמיה סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע בתאים בתרבית

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...