Name: super-resolution imaging of bacterial secreted proteins using genetic code expansion
Uploaded: 2023-02-10T13:23:00
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इस काम को टेक्सास मेडिकल शाखा, गैलवेस्टन, टेक्सास विश्वविद्यालय से स्टार्ट-अप फंड और एलजेके को टेक्सास स्टार पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था। एडवर्ड लेमके (यूरोपीय आणविक जीवविज्ञान प्रयोगशाला, हीडलबर्ग, जर्मनी) को प्लास्मिड पीईवीओएल-पाइलआरएस-एएफ के लिए धन्यवाद देते हैं। चित्रा 1 में छवियां बायोरेंडर का उपयोग करके बनाई गई थीं।

1. प्लास्मिड निर्माण
<ol><li>पीओआई को व्यक्त करने वाले जीन को एक अभिव्यक्ति प्लास्मिड (जैसे, पीईटी 28 ए-एसएसईजे10टीएजी) में क्लोन करें जो ई कोलाई बीएल 21 (डीई 3) में पीओआई को व्यक्त करता है। यह कदम यह न?...

<ol>
	<li>Marlovits, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+assembly+of+the+type+III+secretion+needle+complex.">Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex.</a> Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).</li><li>Kubori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+structure+of+the+Salmonella+typhimurium+type+III+protein+secretion+system.">Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system.</a> Science. 280 (5363), 602-605 (1998).</li><li>LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+bacterial+pathogens+and+visualization+of+their+secreted+effectors.">Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors.</a> FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050 (2020).</li><li>Akeda, Y., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+release+and+unfolding+of+substrates+in+type+III+secretion.">Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion.</a> Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).</li><li>Su, W. 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यहां वर्णित दृष्टिकोण का उपयोग संक्रमण के बाद बैक्टीरियल टी 3 एसएस द्वारा मेजबान सेल में इंजेक्ट किए गए प्रभावक प्रोटीन के सटीक स्थान को ट्रैक करने के लिए किया गया था। टी 3 एसएस को इंट्रासेल्युलर रोगजन?...

बैक्टीरियल संक्रमण को लंबे समय से मानव स्वास्थ्य के लिए एक गंभीर खतरा माना जाता है। रोगजनक मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं से बचने और संक्रमण 1,2 स्थापित करने के लिए अत्यधिक विकसित, अत्यंत शक्तिशाली और जटिल रक्षा प्रणालियों के साथ-साथ विभिन्न प्रकार के जीवाणु विषाणु कारकों (प्रभावक प्रोटीन के रूप में संदर्भित) का उपयोग करते हैं। हालांकि, इन प्रणालियों के अंतर्निहित आणविक तंत्र और व्यक्तिगत प्रभावक प्रोटीन की भूमिका अभी भी काफी हद तक अज्ञात है क्योंकि रोगजनन के दौरान मेजबान कोशिकाओं में महत्वपूर्ण प्रोटीन घटकों और प्रभावकों का सीधे पालन करने के लिए उपयुक्त दृष्टिकोण की कमी है।
एक विशिष्ट उदाहरण साल्मोनेला एंटरिका सेरोवर टाइफिमुरियम है, जो तीव्र गैस्ट्रोएंटेराइटिस का कारण बनता है। साल्मोनेला टाइफीम्यूरियम मेजबान कोशिकाओं में सीधे विभिन्न प्रकार के प्रभावक प्रोटीन इंजेक्ट करने के लिए टाइप तीन स्राव प्रणालियों (टी 3 एसएस) का उपयोग करता है। जैसे ही साल्मोनेला मेजबान कोशिका में प्रवेश करता है, यह एक अम्लीय झिल्ली-बाध्य डिब्बे में रहता है, जिसे साल्मोनेला युक्त रिक्तिका (एससीवी) 3,4 कहा जाता है। एससीवी का एसिड पीएच साल्मोनेला रोगजनकता द्वीप 2 (एसपीआई -2) -एन्कोडेड टी 3 एसएस को सक्रिय करता है और मेजबान साइटोसोल 5,6,7,8 में वैक्यूलर झिल्ली में 20 या अधिक प्रभावकारक प्रोटीन की एक श्रृंखला को स्थानांतरित करता है। मेजबान के अंदर, प्रभावक प्रोटीन के ये जटिल कॉकटेल समन्वय रूप से मेजबान सेल सिग्नलिंग मार्गों में हेरफेर करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप सूक्ष्मनलिकाएं के साथ एससीवी से विस्तारित अत्यधिक गतिशील, जटिल ट्यूबलर झिल्ली संरचनाओं का निर्माण होता है, जिसे साल्मोनेला-प्रेरित फिलामेंट्स (एसआईएफ) कहा जाता है, जो साल्मोनेला को मेजबान कोशिकाओं 9,10,11 के भीतर जीवित रहने और दोहराने में सक्षम बनाता है।
बैक्टीरियल प्रभावक स्थानीयकरण की कल्पना, ट्रैक और निगरानी करने के तरीके, और मेजबान कोशिकाओं के अंदर उनकी तस्करी और बातचीत की जांच करते हैं, जीवाणु रोगजनन को रेखांकित करने वाले तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। मेजबान कोशिकाओं के अंदर साल्मोनेला स्रावित टी 3 एसएस प्रभावक प्रोटीन का लेबलिंग और स्थानीयकरण एक तकनीकी चुनौती साबित हुआ है12,13; बहरहाल, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन के विकास ने जीवित प्रणालियों के भीतर प्रोटीन का अध्ययन और कल्पना करने की हमारी क्षमता को बदल दिया है। हालांकि, फ्लोरोसेंट प्रोटीन (~ 25-30 केडीए) 15 का आकार अक्सर रुचि के प्रोटीन (पीओआई; उदाहरण के लिए, एसएसएपी के लिए 13.65 केडीए, एसआईएफए के लिए 37.4 केडीए) के बराबर या उससे भी अधिक होता है। वास्तव में, प्रभावकों के फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबलिंग अक्सर लेबल किए गए प्रभावक के स्राव को अवरुद्ध करते हैं और टी 3 एसएस14 को जाम करते हैं।
इसके अलावा, फ्लोरोसेंट प्रोटीन कम स्थिर होते हैं और फोटोब्लीचिंग से पहले कम संख्या में फोटॉन का उत्सर्जन करते हैं, जिससे सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपिकतकनीकों 16,17,18 में उनका उपयोग सीमित हो जाता है, विशेष रूप से फोटोएक्टिवेशन लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी (पाम), स्टॉर्म और उत्तेजित उत्सर्जन कमी (एसटीईडी) माइक्रोस्कोपी में। जबकि कार्बनिक फ्लोरोसेंट रंगों के फोटोफिजिकल गुण फ्लोरोसेंट प्रोटीन से बेहतर होते हैं, CLIP / SNAP19,20, स्प्लिट-GFP 21, ReAsH / FLASH22,23, और HA-Tags 24,25 जैसे तरीकों / तकनीकों के लिए एक अतिरिक्त प्रोटीन या पेप्टाइड उपांग की आवश्यकता होती है जो पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन या तस्करी में हस्तक्षेप करके रुचि के प्रभावक प्रोटीन की संरचना-कार्य को खराब कर सकता है। एक वैकल्पिक विधि जो आवश्यक प्रोटीन संशोधन को कम करती है, उसमें जीसीई के माध्यम से अनुवाद के दौरान पीओआई में एनसीएए को शामिल करना शामिल है। एनसीएए या तो फ्लोरोसेंट हैं या क्लिक रसायन विज्ञान 12,13,26,27,28 के माध्यम से फ्लोरोसेंट बनाया जा सकता है।
जीसीई का उपयोग करके, छोटे, कार्यात्मक, जैव-ऑर्थोगोनल समूहों (जैसे एज़ाइड, साइक्लोप्रोपेन, या साइक्लोक्टाइन समूह) के साथ एनसीएए को लक्ष्य प्रोटीन में लगभग किसी भी स्थान पर पेश किया जा सकता है। इस रणनीति में, एक देशी कोडन को पीओआई के जीन में एक निर्दिष्ट स्थिति में एक एम्बर (टीएजी) स्टॉप कोडन जैसे दुर्लभ कोडन के साथ स्वैप किया जाता है। संशोधित प्रोटीन को बाद में एक ऑर्थोगोनल एमिनोसिल-टीआरएनए सिंथेटेस / टीआरएनए जोड़ी के साथ कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। टीआरएनए सिंथेटेस सक्रिय साइट को केवल एक विशेष एनसीएए प्राप्त करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो तब टीआरएनए के 3'-अंत से सहसंयोजक रूप से जुड़ा होता है जो एम्बर कोडन को पहचानता है। एनसीएए को बस विकास माध्यम में पेश किया जाता है, लेकिन इसे सेल द्वारा लिया जाना चाहिए और साइटोसोल तक पहुंचना चाहिए जहां एमिनोसिल-टीआरएनए सिंथेटेस (एएआरएस) इसे ऑर्थोगोनल टीआरएनए से जोड़ सकता है; फिर इसे निर्दिष्ट स्थान पर पीओआई में शामिल किया जाता है (चित्र 1)12 देखें)। इस प्रकार, जीसीई बायो-ऑर्थोगोनल प्रतिक्रियाशील समूहों जैसे कि कीटोन, एज़ाइड, एल्केन, साइक्लोक्टाइन, ट्रांससाइक्लोक्लॉक्टिन, टेट्राज़िन, नॉरबोनेन, α, β-असंतृप्त एमाइड, और बाइसाइक्लो [6.1.0]-नॉनाइन को पीओआई में शामिल करने में सक्षम बनाता है, जो संभावित रूप से पारंपरिक प्रोटीन लेबलिंग विधियों12,26,27,28 की सीमाओं पर काबू पा लेता है।
सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग तकनीकों में हाल के उभरते रुझानों ने आणविक स्तर पर जैविक संरचनाओं की जांच करने के लिए नए रास्ते खोल दिए हैं। विशेष रूप से, स्टॉर्म, एक एकल-अणु, स्थानीयकरण-आधारित, सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीक, ~ 20-30 एनएम तक सेलुलर संरचनाओं की कल्पना करने के लिए एक अमूल्य उपकरण बन गया है और एक समय में एक अणु की जैविक प्रक्रियाओं की जांच करने में सक्षम है, जिससे इंट्रासेल्युलर अणुओं की भूमिकाओं की खोज होती है जो पारंपरिक पहनावा-औसतअध्ययनों में अभी तक अज्ञात हैं। . एकल-अणु और सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकों को सर्वोत्तम रिज़ॉल्यूशन के लिए उज्ज्वल, फोटोटेबल कार्बनिक फ्लोरोफोरेस के साथ एक छोटे टैग की आवश्यकता होती है। हमने हाल ही में प्रदर्शित किया कि जीसीई का उपयोग सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग12 के लिए उपयुक्त जांच को शामिल करने के लिए किया जा सकता है।
कोशिकाओं में प्रोटीन लेबलिंग के लिए दो सबसे अच्छे विकल्प बाइसाइक्लो [6.1.0] नॉनयनेलिसिन (बीसीएन) और ट्रांस-साइक्लोएक्टिन-लाइसिन (टीसीओ; चित्रा 1 में दिखाए गए) हैं, जिन्हें आनुवंशिक रूप से टीआरएनए / सिंथेटेस जोड़ी के एक संस्करण का उपयोग करके एन्कोड किया जा सकता है (जिसे यहां टीआरएनएपाइल / पाइलआरएसएएफ कहा जाता है), जहां पाइल पाइरोलिसिन का प्रतिनिधित्व करता है, और एएफ एक तर्कसंगत रूप से डिज़ाइन किए गए डबल म्यूटेंट (वाई 306 ए, वाई 384 एफ) का प्रतिनिधित्व करता है जो स्वाभाविक रूप से मेथानोसिन से प्राप्त होता है। 29,30,31. तनाव-प्रचारित व्युत्क्रम इलेक्ट्रॉन-मांग डाइल्स-एल्डर साइक्लोडिशन (एसपीआईईडीएसी) प्रतिक्रिया के माध्यम से, ये अमीनो एसिड टेट्राज़िन संयुग्म (चित्रा 1) 12,30,31 के साथ केमोसेलेक्टिव रूप से प्रतिक्रिया करते हैं। इस तरह की साइक्लोडिशन प्रतिक्रियाएं असाधारण रूप से तेज और जीवित कोशिकाओं के साथ संगत हैं; वे फ्लोरोजेनिक भी हो सकते हैं, अगर एक उपयुक्त फ्लोरोफोरे को टेट्राज़िन मोइटी12,26,32 के साथ कार्यात्मक किया जाता है। यह पेपर जीसीई का उपयोग करके मेजबान कोशिकाओं में वितरित जीवाणु प्रभावकों की गतिशीलता की निगरानी के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, इसके बाद डीएसटीआरएम का उपयोग करके हेला कोशिकाओं में स्रावित प्रोटीन का उपकोशिकीय स्थानीयकरण होता है। परिणामों से संकेत मिलता है कि जीसीई के माध्यम से एक एनसीएए का समावेश, इसके बाद फ्लोरोजेनिक टेट्राज़िन-असर रंगों के साथ एक क्लिक प्रतिक्रिया, चयनात्मक लेबलिंग, स्रावित प्रोटीन के विज़ुअलाइज़ेशन और बाद में मेजबान में उप-सेलुलर स्थानीयकरण के लिए एक बहुमुखी विधि का प्रतिनिधित्व करती है। हालांकि, यहां विस्तृत सभी घटकों और प्रक्रियाओं को समायोजित या प्रतिस्थापित किया जा सकता है ताकि जीसीई प्रणाली को अन्य जैविक प्रश्नों की जांच के लिए अनुकूलित किया जा सके।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine SDS running buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A661-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulphate</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP212R-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>ThermiFischer Scientific</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Agar</td>
			<td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDP-FL-tetrazine</td>
			<td>Lumiprobe (USA)</td>
			<td>2.14E+02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>444203</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en &#8211; L - Lysine (TCO*A)</td>
			<td>SiChem GmbH</td>
			<td>SC-8008</td>
			<td>Size: 500 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (Hoechst33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeNovix DS-11+ Spectrophotometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM*</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>* Used for maintaining HeLa Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM**</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>**Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain BL21 (DE3)</td>
			<td>Novagen (Madison, WI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 897-BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>30123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>97203</td>
			<td>Pack of 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7141-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BF229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-C1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocloric acid</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image processing and analysis:&#160; http://rsbweb.nih.gov/ij</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>Coomassie-based stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janelia Fluoro 646-tetrazine</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;Manager (v. 1.4.2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pulser cuvette</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2086</td>
			<td>0.2 cm electrode gap, pkg. of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon N-STORM</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks</td>
			<td>ThermiFischer Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnipur Casamino Acid</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>2240</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehhyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (100x)</td>
			<td>GenDEPOT&#160;</td>
			<td>CA005-010</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL-PylRS-AF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For plasmid construction and map see following references 
			1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 
			2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Mini-prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: elife. 2021, 10, e67789.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pWSK29-sseJ-HA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: elife. 2021, 10, e67789.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>540025</td>
			<td>Protein grade, 10% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sulphate</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>424220250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>539131</td>
			<td>100x Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-HA primary antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. enterica. serovar Typhimurium 14028s</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036-50G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM), 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-C1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator Model 100</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>24932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system)</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThunderSTORM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://zitmen.github.io/thunderstorm/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (1x), 0.25%&#160;&#160;</td>
			<td>GenDEPOT&#160;</td>
			<td>CA014-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-well tissue culture chamber slides</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>94.6190.802</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of bacterial secreted proteins using genetic code expansion

टाइप थ्री स्राव प्रणाली (टी 3 एसएस) ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया को यूकेरियोटिक मेजबान कोशिकाओं के साइटोसोल में सीधे प्रभावक प्रोटीन की एक बैटरी इंजेक्ट करने में सक्षम बनाती है। प्रवेश पर, इंजेक्शन प्रभावक प्रोटीन सहकारी रूप से यूकेरियोटिक सिग्नलिंग मार्गों को संशोधित करते हैं और सेलुलर कार्यों को पुन: प्रोग्राम करते हैं, जिससे जीवाणु प्रवेश और अस्तित्व को सक्षम किया जा सकता है। संक्रमण के संदर्भ में इन स्रावित प्रभावक प्रोटीनों की निगरानी और स्थानीयकरण मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन के गतिशील इंटरफ़ेस को परिभाषित करने के लिए एक पदचिह्न प्रदान करता है। हालांकि, मेजबान कोशिकाओं में उनकी संरचना / कार्य को बाधित किए बिना बैक्टीरिया प्रोटीन को लेबल करना और इमेजिंग करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। 
फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन का निर्माण इस समस्या को हल नहीं करता है, क्योंकि संलयन प्रोटीन स्रावी तंत्र को जाम करते हैं और इस प्रकार स्रावित नहीं होते हैं। इन बाधाओं को दूर करने के लिए, हमने हाल ही में आनुवंशिक कोड विस्तार (जीसीई) का उपयोग करके बैक्टीरिया स्रावित प्रभावकों के साथ-साथ अन्य कठिन-से-लेबल प्रोटीन के साइट-विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए एक विधि नियोजित की। यह पेपर विशेष रूप से जीसीई साइट का उपयोग करके साल्मोनेला स्रावित प्रभावकों को लेबल करने के लिए एक पूर्ण चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान करता है, इसके बाद प्रत्यक्ष स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (डीएसटीओआरएम) का उपयोग करके हेला कोशिकाओं में स्रावित प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण की इमेजिंग के लिए निर्देश दिए जाते हैं। 
हाल के निष्कर्ष बताते हैं कि जीसीई के माध्यम से गैर-कैननिकल अमीनो एसिड (एनसीएए) का समावेश, इसके बाद टेट्राज़िन युक्त रंगों के साथ बायो-ऑर्थोगोनल लेबलिंग, बैक्टीरिया स्रावित प्रोटीन के चयनात्मक लेबलिंग और विज़ुअलाइज़ेशन और मेजबान में बाद में छवि विश्लेषण के लिए एक व्यवहार्य तकनीक है। इस लेख का लक्ष्य एक सीधा और स्पष्ट प्रोटोकॉल प्रदान करना है जिसे बैक्टीरिया और वायरस में विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं के साथ-साथ मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए जीसीई का उपयोग करके सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग करने में रुचि रखने वाले जांचकर्ताओं द्वारा नियोजित किया जा सकता है।

यह प्रोटोकॉल पेपर साइट-विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबलिंग और साल्मोनेला स्रावित प्रभावकों के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक जीसीई-आधारित विधि का वर्णन करता है, जैसा कि चित्र 1 में दर्शा?...

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Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion

यह लेख आनुवंशिक कोड विस्तार (जीसीई) साइट का उपयोग करके साल्मोनेला स्रावित प्रभावकों को लेबल करने के लिए एक सीधा और स्पष्ट प्रोटोकॉल प्रदान करता है- विशेष रूप से और प्रत्यक्ष स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (डीएसटीओआरएम) का उपयोग करके हेला कोशिकाओं में स्रावित प्रोटीन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण की छवि बनाता है।

आनुवंशिक कोड विस्तार का उपयोग करके बैक्टीरियल स्रावित प्रोटीन की सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग

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