Name: super-resolution imaging of bacterial secreted proteins using genetic code expansion
Uploaded: 2023-02-10T13:23:00
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이 작업은 텍사스 주 갤버스턴에 있는 텍사스 대학교 의과대학 지부의 창업 자금과 L.J.K.에 대한 텍사스 STAR 어워드의 지원을 받았습니다. 플라스미드 pEVOL-PylRS-AF에 대해 Edward Lemke 교수(유럽 분자 생물학 연구소, 독일 하이델베르크)에게 감사드립니다. 그림 1 의 이미지는 BioRender를 사용하여 생성되었습니다.

1. 플라스미드 구성
<ol><li>POI를 발현하는 유전자를 대장균 BL21(DE3)에서 POI를 발현하는 발현 플라스미드(예: pET28a-sseJ 10TAG)로 클로닝합니다. 이 단계는 돌연변이체가 기능적인지 결정하는 것을 용이하게 합니다.</li>
	<li>숙주 세포에서 살모넬라 분비 이펙터의 시각화를 위해, 이전 보고서 7,12,24에 설명된 바와 같이, 그의 천연 프로모터의 제어 하에...

<ol>
	<li>Marlovits, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+assembly+of+the+type+III+secretion+needle+complex.">Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex.</a> Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).</li><li>Kubori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+structure+of+the+Salmonella+typhimurium+type+III+protein+secretion+system.">Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system.</a> Science. 280 (5363), 602-605 (1998).</li><li>LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonellae+interactions+with+host+processes.">Salmonellae interactions with host processes.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).</li><li>Galan, J. E., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-injection+machines+in+bacteria.">Protein-injection machines in bacteria.</a> Cell. 172 (6), 1306-1318 (2018).</li><li>Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+by+phospho-OmpR+of+ssrA/B+gene+expression+in+Salmonella+pathogenicity+island+2.">Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2.</a> Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).</li><li>Walthers, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+response+regulator+SsrB+relieves+H-NS+silencing+by+displacing+H-NS+bound+in+polymerization+mode+and+directly+activates+transcription.">Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).</li><li>Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+DNA+biosensor+tracks+OmpR-dependent+acidification+of+Salmonella+during+macrophage+infection.">A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection.</a> PLoS Biology. 13 (4), e1002116 (2015).</li><li>Liew, A. T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell,+super-resolution+imaging+reveals+an+acid+pH-dependent+conformational+switch+in+SsrB+regulates+SPI-2.">Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2.</a> eLife. 8, e45311 (2019).</li><li>Knuff, K., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+the+SIF+is+happening-the+role+of+intracellular+Salmonella-induced+filaments.">What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335 (2017).</li><li>Drecktrah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+behavior+of+Salmonella-induced+membrane+tubules+in+epithelial+cells.">Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells.</a> Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).</li><li>Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+induces+the+formation+of+filamentous+structures+containing+lysosomal+membrane+glycoproteins+in+epithelial+cells.">Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).</li><li>Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+code+expansion+enables+visualization+of+Salmonella+type+three+secretion+system+components+and+secreted+effectors.">Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors.</a> elife. 10, e67789 (2021).</li><li>Singh, M. K., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+bacterial+pathogens+and+visualization+of+their+secreted+effectors.">Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors.</a> FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050 (2020).</li><li>Akeda, Y., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+release+and+unfolding+of+substrates+in+type+III+secretion.">Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion.</a> Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).</li><li>Su, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+as+tools+to+aid+protein+production.">Fluorescent proteins as tools to aid protein production.</a> Microbial Cell Factories. 4 (1), 12 (2005).</li><li>Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+development+of+photoactivatable+fluorescent+proteins+for+single-molecule-based+superresolution+imaging.">Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).</li><li>Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+specific+mislocalization+of+red+fluorescent+proteins+in+live+Escherichia+coli.">Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).</li><li>Gahlmann, A., Moerner, W. 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M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+fluorescence+complementation+platform+for+visualizing+Salmonella+effector+proteins+reveals+distinctly+different+intracellular+niches+in+different+cell+types.">Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types.</a> ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).</li><li>Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell-based+optimization+of+the+biarsenical-binding+tetracysteine+motif+for+improved+fluorescence+and+affinity.">Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity.</a> Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li><li>Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pearling+transition+provides+evidence+of+force-driven+endosomal+tubulation+during+Salmonella+infection.">The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection.</a> mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).</li><li>Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SifA,+a+type+III+secreted+effector+of+Salmonella+typhimurium,+directs+Salmonella-induced+filament+(Sif)+formation+along+microtubules.">SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules.</a> Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).</li><li>Lang, K., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+incorporation+of+unnatural+amino+acids+and+bioorthogonal+labeling+of+proteins.">Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins.</a> Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).</li><li>Davis, L., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+proteins:+applications+of+genetic+code+expansion+in+cell+biology.">Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).</li><li>Chin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+p-azido-L-phenylalanine+to+the+genetic+code+of+Escherichia+coli.">Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).</li><li>Kipper, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+noncanonical+amino+acids+for+protein+labeling+in+a+genomically+recoded+Escherichia+coli.">Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).</li><li>Uttamapinant, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+code+expansion+enables+live-cell+and+super-resolution+imaging+of+site-specifically+labeled+cellular+proteins.">Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins.</a> Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).</li><li>Plass, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+for+Diels-Alder+reactions+in+living+cells.">Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).</li><li>Lang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+encoding+of+bicyclononynes+and+trans-cyclooctenes+for+site-specific+protein+labeling+in+vitro+and+in+live+mammalian+cells+via+rapid+fluorogenic+Diels-Alder+reactions.">Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-exploration+of+the+codon+context+effect+on+amber+codon-guided+incorporation+of+noncanonical+amino+acids+in+Escherichia+coli+by+the+blue-white+screening+assay.">Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay.</a> ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).</li><li>Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+tabulated+from+the+international+DNA+sequence+databases:+status+for+the+year+2000.">Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 292 (2000).</li><li>Spahn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+super-resolution+imaging+of+bacterial+regulatory+proteins:+the+nucleoid+and+the+cell+membrane+in+single,+fixed+E.+coli+cells.">Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).</li><li>Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy.">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li><li>Xu, J., Ma, H., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy+(STORM).">Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM).</a> Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).</li><li>Meineke, B., Heimg&#228;rtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Els&#228;sser, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+incorporation+of+two+ncAAs+for+two-color+bioorthogonal+labeling+and+crosslinking+of+proteins+on+live+mammalian+cells.">Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells.</a> Cell Reports. 31 (12), 107811 (2020).</li><li>Bessa-Neto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+labeling+of+transmembrane+proteins+with+non-canonical+amino+acids+unveils+masked+epitopes+in+live+neurons.">Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons.</a> Nature Communications. 12 (1), 6715 (2021).</li><li>Beliu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+labeling+with+tetrazine-dyes+for+super-resolution+microscopy.">Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy.</a> Communication Biology. 2, 261 (2019).</li><li>Arsi&#263;, A., Hagemann, C., Stajkovi&#263;, N., Schubert, T., Niki&#263;-Spiegel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+genetically+encoded+tags+for+fluorescent+protein+labeling+in+living+neurons.">Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons.</a> Nature Communications. 13 (1), 314 (2022).</li></ol>

본원에 기재된 접근법은 감염 후 박테리아 T3SS에 의해 숙주 세포 내로 주입된 이펙터 단백질의 정확한 위치를 추적하기 위해 사용되었다. T3SS는 살모넬라균, 시겔라균 및 예르시니아와 같은 세포내 병원체에 의해 사용되어 독성 성분을 숙주로 운반합니다. 초고해상도 이미징 기술의 개발로 이전에는 상상할 수 없었던 해상도12,13,24<s...

박테리아 감염은 오랫동안 인체 건강에 심각한 위험으로 간주되어 왔습니다. 병원체는 숙주 면역 반응을 회피하고 감염을 확립하기 위해 다양한 박테리아 독성 인자(이펙터 단백질이라고 함)뿐만 아니라 고도로 진화되고 매우 강력하며 복잡한 방어 시스템을 사용합니다 1,2. 그러나, 이러한 시스템의 기초가 되는 분자 메커니즘과 개별 이펙터 단백질의 역할은 병인 동안 숙주 세포에서 중요한 단백질 성분 및 이펙터를 직접 따르기 위한 적절한 접근법의 부족으로 인해 여전히 거의 알려지지 않았습니다.
한 가지 전형적인 예는 급성 위장염을 유발하는 Salmonella enterica serovar Typhimurium입니다. 살모넬라균 Typhimurium은 유형 3 분비 시스템 (T3SS)을 사용하여 다양한 이펙터 단백질을 숙주 세포에 직접 주입합니다. 살모넬라균은 숙주 세포에 들어가자마자 살모넬라균 함유 액포(SCV)라고 하는 산성 막 결합 구획에 존재합니다.3,4. SCV의 산 pH는 살모넬라 병원성 섬 2(SPI-2)로 인코딩된 T3SS를 활성화하고 액포막을 가로질러 20개 이상의 이펙터 단백질의 발리를 숙주 세포질 5,6,7,8로 전위시킵니다. 숙주 내부에서, 이펙터 단백질의 이러한 복잡한 칵테일은 숙주 세포 신호 전달 경로를 조정하여 살모넬라 유도 필라멘트(SIF)라고 하는 미세소관을 따라 SCV에서 확장된 매우 역동적이고 복잡한 관형 막 구조를 형성하여 살모넬라균이 숙주 세포 내에서 생존하고 복제할 수 있도록 합니다9,10,11.
박테리아 이펙터 국소화를 시각화, 추적 및 모니터링하고 숙주 세포 내부의 트래피킹 및 상호 작용을 조사하는 방법은 박테리아 발병을 뒷받침하는 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 숙주 세포 내에서 살모넬라균 분비 T3SS 이펙터 단백질의 표지 및 국소화는 기술적 과제임이 입증되었습니다12,13; 그럼에도 불구하고 유전적으로 암호화된 형광 단백질의 개발은 살아있는 시스템 내에서 단백질을 연구하고 시각화하는 우리의 능력을 변화시켰습니다. 그러나 형광 단백질의 크기(~25-30 kDa)15는 종종 관심 단백질의 크기와 비슷하거나 더 큽니다(POI; 예: SsaP의 경우 13.65 kDa, SifA의 경우 37.4 kDa). 실제로, 이펙터의 형광 단백질 표지는 종종 표지된 이펙터의 분비를 차단하고 T3SS14를 방해합니다.
또한, 형광 단백질은 덜 안정적이고, 광표백 전에 적은 수의 광자를 방출하여, 초해상도 현미경 기술(16,17,18), 특히 광활성화 국소화 현미경(PALM), STORM 및 자극 방출 고갈(STED) 현미경에서의 사용을 제한한다. 유기 형광 염료의 광물리적 특성은 형광 단백질의 광물리적 특성보다 우수하지만, CLIP/SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH/FlAsH 22,23 및 HA-Tags 24,25와 같은 방법/기술은 번역 후 변형 또는 트래피킹을 방해하여 관심 있는 이펙터 단백질의 구조-기능을 손상시킬 수 있는 추가 단백질 또는 펩타이드 부속물을 필요로 합니다. 필요한 단백질 변형을 최소화하는 대체 방법은 GCE를 통한 번역 중에 ncAA를 POI에 통합하는 것입니다. ncAA는 형광성이거나 클릭 화학 12,13,26,27,28을 통해 형광으로 만들 수 있습니다.
GCE를 사용하면 작고 기능적인 생체 직교 그룹(예: 아자이드, 사이클로프로펜 또는 사이클로옥틴 그룹)을 가진 ncAA를 표적 단백질의 거의 모든 위치에 도입할 수 있습니다. 이 전략에서, 천연 코돈은 POI의 유전자의 특정 위치에서 호박 (TAG) 정지 코돈과 같은 희귀 코돈으로 스왑된다. 변형된 단백질은 직교 아미노아실-tRNA 합성효소/tRNA 쌍과 함께 세포에서 연속적으로 발현됩니다. tRNA 합성효소 활성 부위는 하나의 특정 ncAA만을 수용하도록 설계되며, 이는 호박색 코돈을 인식하는 tRNA의 3'-말단에 공유 결합됩니다. ncAA는 단순히 성장 배지에 도입되지만 세포에 흡수되어 아미노아실-tRNA 합성효소(aaRS)가 직교 tRNA에 연결할 수 있는 세포질에 도달해야 합니다. 그런 다음 지정된 위치의 POI에 통합됩니다(그림 1 참조)12. 따라서, GCE는 케톤, 아자이드, 알킨, 시클로옥틴, 트랜스시클로옥텐, 테트라진, 노르보넨, α, β-불포화 아미드 및 비시클로[6.1.0]-노닌과 같은 과다한 생체 직교 반응성 그룹의 부위 특이적 통합을 가능하게 하여 잠재적으로 기존의 단백질 표지 방법 12,26,27,28의 한계를 극복합니다.
초고해상도 이미징 기술의 최근 새로운 트렌드는 분자 수준에서 생물학적 구조를 조사할 수 있는 새로운 길을 열었습니다. 특히, 단일 분자, 국소화 기반, 초분해능 기술인 STORM은 세포 구조를 ~20-30nm까지 시각화하는 데 매우 유용한 도구가 되었으며, 한 번에 한 분자씩 생물학적 과정을 조사할 수 있어 기존의 앙상블 평균 연구에서는 아직 알려지지 않은 세포 내 분자의 역할을 발견할 수 있습니다13 . 단일 분자 및 초분해능 기술에는 최상의 분해능을 위해 밝고 광안정성이 있는 유기 형광단이 있는 작은 태그가 필요합니다. 우리는 최근에 GCE가 초고해상도 이미징12에 적합한 프로브를 통합하는 데 사용될 수 있음을 입증했습니다.
세포에서 단백질 표지를 위한 최선의 선택 중 두 가지는 바이사이클로[6.1.0] 노니넬리신(BCN) 및 트랜스-사이클로옥텐-라이신(TCO, 그림 1에 표시됨)이며, 이는 tRNA/합성효소 쌍(여기서는 tRNA Pyl/PylRS AF라고 함)의 변이체를 사용하여 유전적으로 암호화될 수 있으며, 여기서Pyl은 피롤리신을 나타내고AF는 자연적으로 피롤리신12를 암호화하는 Methanosarcina mazei에서 파생된 합리적으로 설계된 이중 돌연변이(Y306A, Y384F)를 나타냅니다. 29,30,31. 균주 촉진 역 전자 수요 Diels-Alder 고리 첨가 (SPIEDAC) 반응을 통해 이러한 아미노산은 테트라 진 접합체와 화학 선택적으로 반응합니다 (그림 1) 12,30,31. 이러한 고리첨가 반응은 매우 빠르고 살아있는 세포와 호환됩니다. 이들은 또한 적절한 형광단이 테트라진 잔기 12,26,32로 기능화되는 경우 형광성일 수 있다. 이 논문은 GCE를 사용하여 숙주 세포로 전달되는 박테리아 이펙터의 역학을 모니터링한 후 dSTORM을 사용하여 HeLa 세포에서 분비된 단백질의 세포 내 국소화를 모니터링하기 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 결과는 GCE를 통한 ncAA의 통합에 이어 형광 생성 테트라진 함유 염료와의 클릭 반응이 선택적 라벨링, 분비된 단백질의 시각화 및 숙주에서의 후속 세포 내 국소화를 위한 다양한 방법을 나타낸다는 것을 나타냅니다. 그러나 여기에 설명 된 모든 구성 요소와 절차는 GCE 시스템이 다른 생물학적 질문을 조사하도록 조정할 수 있도록 조정하거나 대체 할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine SDS running buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A661-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulphate</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP212R-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>ThermiFischer Scientific</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Agar</td>
			<td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDP-FL-tetrazine</td>
			<td>Lumiprobe (USA)</td>
			<td>2.14E+02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>444203</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en &#8211; L - Lysine (TCO*A)</td>
			<td>SiChem GmbH</td>
			<td>SC-8008</td>
			<td>Size: 500 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (Hoechst33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeNovix DS-11+ Spectrophotometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM*</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>* Used for maintaining HeLa Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM**</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>**Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain BL21 (DE3)</td>
			<td>Novagen (Madison, WI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 897-BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>30123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>97203</td>
			<td>Pack of 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7141-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BF229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-C1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocloric acid</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image processing and analysis:&#160; http://rsbweb.nih.gov/ij</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>Coomassie-based stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janelia Fluoro 646-tetrazine</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;Manager (v. 1.4.2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pulser cuvette</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2086</td>
			<td>0.2 cm electrode gap, pkg. of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon N-STORM</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks</td>
			<td>ThermiFischer Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnipur Casamino Acid</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>2240</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehhyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (100x)</td>
			<td>GenDEPOT&#160;</td>
			<td>CA005-010</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL-PylRS-AF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For plasmid construction and map see following references 
			1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 
			2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Mini-prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: elife. 2021, 10, e67789.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pWSK29-sseJ-HA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: elife. 2021, 10, e67789.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>540025</td>
			<td>Protein grade, 10% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sulphate</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>424220250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>539131</td>
			<td>100x Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-HA primary antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. enterica. serovar Typhimurium 14028s</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036-50G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM), 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-C1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator Model 100</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>24932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system)</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThunderSTORM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://zitmen.github.io/thunderstorm/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (1x), 0.25%&#160;&#160;</td>
			<td>GenDEPOT&#160;</td>
			<td>CA014-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-well tissue culture chamber slides</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>94.6190.802</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of bacterial secreted proteins using genetic code expansion

유형 3 분비 시스템(T3SSs)은 그람 음성 박테리아가 진핵 숙주 세포의 세포질에 직접 이펙터 단백질 배터리를 주입할 수 있도록 합니다. 진입 시 주입된 이펙터 단백질은 진핵 생물 신호 전달 경로를 협력적으로 조절하고 세포 기능을 재프로그래밍하여 박테리아 진입 및 생존을 가능하게 합니다. 감염의 맥락에서 이러한 분비된 이펙터 단백질을 모니터링하고 국소화하는 것은 숙주-병원체 상호작용의 동적 인터페이스를 정의하기 위한 발자국을 제공합니다. 그러나 숙주 세포의 구조/기능을 방해하지 않고 박테리아 단백질을 표지하고 이미징하는 것은 기술적으로 어렵습니다. 
형광 융합 단백질을 구성하는 것은 융합 단백질이 분비 장치를 방해하여 분비되지 않기 때문에 이 문제를 해결하지 못합니다. 이러한 장애물을 극복하기 위해 우리는 최근 유전자 코드 확장(GCE)을 사용하여 박테리아 분비 이펙터 및 기타 라벨링하기 어려운 단백질의 부위 특이적 형광 라벨링 방법을 채택했습니다. 이 논문은 GCE 부위를 사용하여 살모넬라 분비 이펙터를 라벨링하는 완전한 단계별 프로토콜을 제공한 다음 직접 확률적 광학 재구성 현미경(dSTORM)을 사용하여 HeLa 세포에서 분비된 단백질의 세포내 국소화를 이미징하는 지침을 제공합니다 
최근 연구 결과에 따르면 GCE를 통한 비표준 아미노산(ncAA)의 통합에 이어 테트라진 함유 염료를 사용한 생체 직교 표지는 박테리아 분비 단백질의 선택적 표지 및 시각화 및 숙주에서의 후속 이미지 분석을 위한 실행 가능한 기술입니다. 이 기사의 목표는 박테리아와 바이러스의 다양한 생물학적 과정과 숙주-병원체 상호 작용을 연구하기 위해 GCE를 사용하여 초고해상도 이미징을 수행하는 데 관심이 있는 조사자가 사용할 수 있는 간단하고 명확한 프로토콜을 제공하는 것입니다.

이 프로토콜 논문은 그림 1과 같이 살모넬라균 분비 이펙터의 부위별 형광 라벨링 및 시각화를 위한 GCE 기반 방법을 설명합니다. 트랜스사이클로옥텐 생체직교기(TCO) 및 형광 염료를 담지한 ncAA의 화학 구조는 도 1A에 나타내었다. SseJ 표지는 GCE 기술을 통해 직교 아미노아실-tRNA 합성효소/tRNA 쌍을 사용하여 호박색 ...

Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion at JoVE.com

Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion

이 기사는 유전자 코드 확장(GCE) 부위 특이적 표지를 사용하여 살모넬라균 분비 이펙터에 라벨을 붙이고 직접 확률적 광학 재구성 현미경(dSTORM)을 사용하여 HeLa 세포에서 분비된 단백질의 세포 내 국소화를 이미지화하는 간단하고 명확한 프로토콜을 제공합니다

유전자 코드 확장을 이용한 박테리아 분비 단백질의 초고해상도 이미징

Type three secretion systems (T3SSs) enable gram-negative bacteria to inject a battery of effector proteins directly into the cytosol of eukaryotic host ...

유전자 코드 확장 또는 GCE는 다른 라벨링 전략의 한계를 극복합니다. 이를 통해 특이적으로 표지된 단백질의 위치를 파악할 수 있으며, 시각화를 가능하게 하는 밝은 유기 형광단을 가지고 있으므로 단백질 기능을 방해할 수 있는 형광 단백질 융합을 만드는 전략을 피할 수 있습니다. 이 방법은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.예를 들어, 우리는 지카 CO 단백질을 라벨링하는 데 사용했으며, 이를 통해 숙주 세포를 감염시키는 것을 관찰할 수 있는 라벨링된 지카 바이러스를 제공하고 생산할 수 있습니다. 시작하려면 100 마이크로 리터의 1 차 배양 물을 밀리 리터 당 35 마이크로 그램의 클로람페니콜과 밀리 리터 당 100 마이크로 그램의 암피실린을 함유 한 5 밀리리터의 LB 배지로 옮깁니다. 섭씨 37도에서 250RPM으로 진탕하면서 600나노미터의 광학 밀도가 0.6에 도달할 때까지 배양합니다.LB 배지를 비표준 아미노산인 1밀리몰 TCO가 보충된 변형된 N-최소 배지로 교체합니다. 그리고 섭씨 34도에서 30분 동안 박테리아를 키웁니다. 아라비노스 0.2%, 클로람페니콜 밀리리터당 25밀리그램, 암피실린 밀리리터당 100밀리그램을 넣고 250RPM으로 진탕하면서 6시간 더 세포를 성장시킵니다.6시간 후, 비정준 아미노산 또는 ncAA가 없는 신선한 MgM 배지로 30분 간격으로 박테리아를 4회 세척합니다. 박테리아를 원심분리하고 PBS 완충액에 다시 현탁한 다음 암흑 속에서 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양하여 과도한 ncAA를 제거합니다. 1 시간 후, 박테리아를 섭씨 4도에서 15 분 동안 3, 000 G에서 원심 분리하고 추가 사용을 위해 보관하십시오.대조 실험의 경우, ncAA가 없는 상태에서 ncAA 보유 단백질을 발현하여 동일한 실험을 반복합니다. TCO와 혼입된 SseJ를 발현하는 살모넬라 세포를 PBS에서 TCO의 부재 또는 존재 하에 재현탁한다. PBS에서 600 나노미터에서 4로 광학 밀도를 조정하고, 암흑 속에서 섭씨 37도에서 20 마이크로몰 Janelia Fluor 646 테트라젠 또는 20 마이크로몰 BDPFL 테트라진으로 세포를 배양하고, 250 RPM에서 1 내지 2시간 동안 흔들어 준다.세포를 펠렛화하고 5% DMSO 및 0.2% Pluronic F-127을 함유한 PBS로 3-4회 세척합니다. 5%DMSO를 함유한 PBS에 펠릿을 다시 현탁합니다. 어둠 속에서 섭씨 4도에서 밤새 배양한 후 PBS로 다시 두 번 세척합니다.컨포칼 현미경을 사용하여 세포를 즉시 이미지화하거나 PBS의 1.5% 파라포름알데히드로 실온에서 30-45분 동안 암흑 속에서 고정합니다. 페니실린 스트렙토마이신과 함께 10% FBS가 보충된 고혈당 DMEM에서 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 습도 95%에서 HeLa 세포를 배양하고 유지합니다. 감염 하루 전에 균을 배양하고, 표준 LB 배양액을 함유하는 항생제 5mm에 직교 tRNA 합성효소 쌍을 함유하는 pEVOL 플라스미드와 pWSK29 플라스미드를 함유하는 야생형 살모넬라균 단일 콜로니를 섭씨 37도에서 250RPM으로 진탕하여 하룻밤 동안 접종한다.희석된 세포 스톡을 밀리리터당 100, 000 세포로 복구하고 8웰 챔버 슬라이드에서 10% FBS 성장 배지를 함유하는 500 마이크로리터의 DMEM에서 웰당 50, 000 HeLA 세포를 시드한다. 챔버 슬라이드를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 습도 95%에서 24시간 동안 인큐베이터에 보관합니다. 세균 감염의 경우, 100 마이크로리터의 하룻밤 박테리아 배양을 밀리리터당 35 마이크로그램 및 밀리리터당 100 마이크로그램의 암피실린을 함유하는 LB 배지 3밀리리터에 희석하여 pEVOL 플라스미드 및 SseJ 유전자를 함유하는 pWSK29 플라스미드를 보유하는 야생형 살모넬라균을 계대배양한다.섭씨 37도에서 250RPM으로 5-7시간 동안 진탕하여 배양합니다. HeLa 세포 감염을 시작하기 위해 인큐베이터에서 HeLa 세포를 꺼낸 후 예열된 DPBS로 세포를 세척하고 10% FBS를 함유한 500마이크로리터의 신선한 DMEM을 각 웰에 추가합니다. 감염이 시작될 때까지 챔버 슬라이드를 이산화탄소 인큐베이터에 다시 놓습니다.5 내지 7 시간의 배양 후, 600 나노 미터에서의 광학 밀도가 DMEM 성장 배지 1 밀리리터에서 0.2가되도록 살모넬라 배양 물을 희석하고, 살모넬라 접종 물의 필요한 양을 챔버 슬라이드의 각 웰에 첨가하여 감염의 다중도가 100이되도록한다. 감염된 세포를 이산화탄소 배양기에서 30분 동안 배양한 후 예열된 DPBS로 세포를 3회 세척하여 세포외 살모넬라균을 제거한다. 이 시점을 감염 후 0시간으로 설정하고 1시간 동안 겐타마이신 밀리리터당 100마이크로그램을 포함하는 완전한 배지 500마이크로리터를 추가합니다.인큐베이션 후, 다시 앞서 나타낸 바와 같이 DPBS로 세포를 3회 세척하고, 0.2% 아라비노스로 보충된 완전 배지 500마이크로리터, 겐타마이신 밀리리터당 10마이크로그램을 챔버 슬라이드의 각 웰에 첨가한다. 대조 실험에서, TCO 없이 HeLa 세포의 유사한 감염을 수행한다. 챔버 슬라이드를 이산화탄소 인큐베이터에서 10시간 동안 배양한 후, 완전 배지를 TCO가 없는 새로운 완전 배지로 교체하고, 예열된 DPBS로 각각 30분 간격으로 4회 HeLa 세포를 세척하였다.그런 다음 TCO없이 신선한 완전 배지로 세포를 세척하십시오. 감염 후 12시간 후, 세포에서 배지를 흡인하고 예열된 DPBS로 세포를 두세 번 세척합니다. 웰의 한 그룹에서, 염료 용액 혼합물 1의 500 마이크로리터를 추가하고, 동일한 챔버 슬라이드의 웰의 다른 그룹에서, 염료 용액 혼합물 2의 500 마이크로리터를 추가한다.챔버 슬라이드를 다시 이산화탄소 인큐베이터에 1시간 및 1/2 내지 2시간 동안 놓는다. 감염 후 13.5 내지 14 시간 후, 헬라 세포를 예열 된 DPBS로 두 번 헹구고, FBS가 보충 된 신선한 DMEM 500 마이크로 리터를 첨가한다. 30분 동안 배양한 후, 앞서 나타낸 바와 같이 예열된 DPBS로 세포를 다시 세척한 후, 30분 간격으로 신선한 DMEM으로 4회 세척한다.감염 후 16 시간에, 200 마이크로 리터의 4 % 파라 포름 알데히드를 각 웰에 첨가하고 어둠 속에서 실온에서 10 분 동안 배양하여 파라 포름 알데히드로 헬라 세포를 고정시킨다. 파라포름알데히드를 흡인합니다. PBS로 3회 헹구고 세포를 섭씨 4도의 어둠 속에서 PBS에 보관한다.세포를 현미경으로 가져오고 이미징 챔버를 현미경 s에 놓습니다.tage 샘플 홀더. 그런 다음 갓 만든 GLOX BME 이미징 버퍼 0.4 밀리리터로 웰의 배지를 교체합니다. 레이저 출력을 약 1밀리와트로 줄여 관심 있는 HeLa 세포를 식별하고 초점면과 레이저 빔 각도를 조정하면서 647나노미터의 낮은 레이저 밀도로 샘플을 비춥니다.HILO 조명 각도를 조정합니다. 표적 구조의 분율 제한 이미지에 대한 참조를 캡처하고 레이저를 최대 출력으로 돌려 형광단을 어두운 상태로 전환합니다. 프리앰프 게인을 3으로 설정하고 프레임 전송을 활성화합니다.그런 다음 dSTORM 측정에서 더 높은 감도를 위해 EM 게인을 200으로 설정합니다. 깜박이는 이벤트가 공간과 시간에서 분리되는 적절한 수준으로 레이저 강도를 조정합니다. 노출 시간을 30밀리초로 설정하고 획득을 시작합니다.10, 000에서 30, 000 프레임을 획득합니다. 서로 다른 ROI에서 유사한 획득을 반복합니다. dSTORM의 영상 재구성을 위해 영상 J를 열고 원시 데이터를 가져옵니다.Thunderstorm 플러그인을 열고 장치에 해당하는 카메라 설정을 구성합니다. 분석 실행으로 이동하여 이미지 필터링, 위치 파악 방법 및 분자의 하위 픽셀 위치 파악과 같은 적절한 설정을 지정합니다. 확인을 클릭하여 이미지 재구성을 시작하고 후처리 최종 결과 분석을 시작합니다.TCO와 함께 통합된 SseJ를 발현하는 살모넬라균은 Janelia Fluor 646 테트라진으로 처리되고 TCO의 부재 또는 존재 하에 Janelia Fluor 646 형광으로 이미지화됩니다. SseJ의 형광은 TCO가 존재할 때만 검출됩니다. HeLa 세포는 16시간 동안 psseJ-HA를 보유하는 살모넬라균에 감염되고, 항HA 항체, LPS 및 DAPI로 고정되고 면역염색됩니다.예상한 바와 같이, SseJ 의존성 살모넬라 유도 필라멘트 또는 SIF가 감염된 세포에서 형성된다. TCO가 없는 경우, 호박 코돈은 억제되지 않고, SseJ 의존성 SIF는 감염된 헬라 세포에 존재하지 않는다. SseJ 의존성 SIF는 TCO의 존재 하에서 관찰되며, 이는 SseJ가 유전자 코드 확장 또는 GCE를 사용하여 SseJF10TCOHA의 발현에 의해 구조되었음을 명확하게 나타낸다.두 개의 대체 염료 혼합물 1과 염료 혼합물 2를 사용한 SPIEDAC 클릭 반응을 통해 HeLa 세포에서 분비된 SseJF10TCOHA의 표지 특이성이 여기에 나와 있습니다. 클릭 염료 Janelia Fluor 646 TZ를 추가로 사용하여 TCO 및 P 볼트 플라스미드의 존재 하에 SseJ HA를 운반하는 야생형 살마넬라로 감염된 HeLa 세포에서 임의의 배경 표지가 있었는지 관찰하였다. SseJ는 세포내 또는 비특이적 형광 신호 없이 숙주 세포의 세포질 내로 방출되어 형광 신호가 SseJ에 특이적임을 입증하였다.HeLa 세포에서 GCE 표지 SseJ의 초고해상도 이미징이 이 그림에 나와 있습니다. 관찰 중인 HeLa 세포의 명시야 이미지가 여기에 나와 있습니다. TCO 및 Janelia Fluor 646으로 표지된 분비된 SseJ의 회절 제한 광시야 이미지와 SseJ 데코레이팅된 SIF의 해당 dSTORM 이미지가 여기에 제시되어 있습니다.인서트는 박스형 영역에서 슈퍼 리졸브된 SseJ의 확대 보기를 보여줍니다. NCAA 스톡 용액은 NaOH에서 제조되었습니다. 미디어에 추가하기 전후에 중화하는 것을 잊지 마십시오.관심 있는 단백질을 라벨링한 후 세포를 광범위하게 세척하여 배경 신호가 최소화되도록 합니다. GCE 절차에 따라 이제 박테리아의 독성 인자에 라벨을 붙이고 이미징 기술을 사용하여 그 활동을 추적할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

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연구

생물학

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에 박테리아 기능 네트워크 및 경로를 매핑<em&gt; 대장균</em&gt; 합성 유전자 배열을 사용하여

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Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

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Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

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고속 3D 구조 조명 현미경을 사용하여 라이브 박테리아의 Cytokinetic Z 반지의 슈퍼 해상도 이미징 (F3D-SIM)

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멀티 플렉스 애플리케이션을위한 형광 단백질 유전자 바코드

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

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Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

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Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

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