Name: super-resolution imaging of bacterial secreted proteins using genetic code expansion
Uploaded: 2023-02-10T13:23:00
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Este trabalho foi apoiado por fundos de start-up da filial médica da Universidade do Texas, Galveston, TX, e um prêmio Texas STAR para L.J.K. Agradecemos ao Prof. Edward Lemke (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Alemanha) pelo plasmídeo pEVOL-PylRS-AF. As imagens da Figura 1 foram criadas usando o BioRender.

1. Construção do plasmídeo
<ol><li>Clone o gene que expressa o POI em um plasmídeo de expressão (por exemplo, pET28a-sseJ 10TAG) que expressa o POI em E. coli BL21 (DE3). Essa etapa facilita na determinação de que os mutantes são funcionais.</li>
	<li>Para a visualização de efetores secretados por Salmonella em células hospedeiras, construir-se um plasmídeo de expressão (pWSK29-sseJ-HA) que expresse o alvo POI SseJ sob o controle de seu promotor nativo, ...

<ol>
	<li>Marlovits, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+assembly+of+the+type+III+secretion+needle+complex.">Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex.</a> Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).</li><li>Kubori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+structure+of+the+Salmonella+typhimurium+type+III+protein+secretion+system.">Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system.</a> Science. 280 (5363), 602-605 (1998).</li><li>LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+by+phospho-OmpR+of+ssrA/B+gene+expression+in+Salmonella+pathogenicity+island+2.">Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2.</a> Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).</li><li>Walthers, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+response+regulator+SsrB+relieves+H-NS+silencing+by+displacing+H-NS+bound+in+polymerization+mode+and+directly+activates+transcription.">Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).</li><li>Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+the+SIF+is+happening-the+role+of+intracellular+Salmonella-induced+filaments.">What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335 (2017).</li><li>Drecktrah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+behavior+of+Salmonella-induced+membrane+tubules+in+epithelial+cells.">Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells.</a> Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).</li><li>Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+induces+the+formation+of+filamentous+structures+containing+lysosomal+membrane+glycoproteins+in+epithelial+cells.">Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).</li><li>Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+code+expansion+enables+visualization+of+Salmonella+type+three+secretion+system+components+and+secreted+effectors.">Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors.</a> elife. 10, e67789 (2021).</li><li>Singh, M. K., Kenney, L. 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M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+fluorescence+complementation+platform+for+visualizing+Salmonella+effector+proteins+reveals+distinctly+different+intracellular+niches+in+different+cell+types.">Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types.</a> ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).</li><li>Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+incorporation+of+unnatural+amino+acids+and+bioorthogonal+labeling+of+proteins.">Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins.</a> Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).</li><li>Davis, L., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+proteins:+applications+of+genetic+code+expansion+in+cell+biology.">Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).</li><li>Chin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+p-azido-L-phenylalanine+to+the+genetic+code+of+Escherichia+coli.">Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).</li><li>Kipper, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+noncanonical+amino+acids+for+protein+labeling+in+a+genomically+recoded+Escherichia+coli.">Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).</li><li>Uttamapinant, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+code+expansion+enables+live-cell+and+super-resolution+imaging+of+site-specifically+labeled+cellular+proteins.">Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins.</a> Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).</li><li>Plass, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+for+Diels-Alder+reactions+in+living+cells.">Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).</li><li>Lang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+encoding+of+bicyclononynes+and+trans-cyclooctenes+for+site-specific+protein+labeling+in+vitro+and+in+live+mammalian+cells+via+rapid+fluorogenic+Diels-Alder+reactions.">Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-exploration+of+the+codon+context+effect+on+amber+codon-guided+incorporation+of+noncanonical+amino+acids+in+Escherichia+coli+by+the+blue-white+screening+assay.">Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay.</a> ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).</li><li>Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+tabulated+from+the+international+DNA+sequence+databases:+status+for+the+year+2000.">Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 292 (2000).</li><li>Spahn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+super-resolution+imaging+of+bacterial+regulatory+proteins:+the+nucleoid+and+the+cell+membrane+in+single,+fixed+E.+coli+cells.">Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).</li><li>Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy.">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li><li>Xu, J., Ma, H., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy+(STORM).">Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM).</a> Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).</li><li>Meineke, B., Heimg&#228;rtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Els&#228;sser, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+incorporation+of+two+ncAAs+for+two-color+bioorthogonal+labeling+and+crosslinking+of+proteins+on+live+mammalian+cells.">Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells.</a> Cell Reports. 31 (12), 107811 (2020).</li><li>Bessa-Neto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+labeling+of+transmembrane+proteins+with+non-canonical+amino+acids+unveils+masked+epitopes+in+live+neurons.">Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons.</a> Nature Communications. 12 (1), 6715 (2021).</li><li>Beliu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+labeling+with+tetrazine-dyes+for+super-resolution+microscopy.">Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy.</a> Communication Biology. 2, 261 (2019).</li><li>Arsi&#263;, A., Hagemann, C., Stajkovi&#263;, N., Schubert, T., Niki&#263;-Spiegel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+genetically+encoded+tags+for+fluorescent+protein+labeling+in+living+neurons.">Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons.</a> Nature Communications. 13 (1), 314 (2022).</li></ol>

A abordagem aqui descrita foi utilizada para rastrear a localização precisa das proteínas efetoras injetadas na célula hospedeira pela bactéria T3SS após a infecção. T3SSs são empregados por patógenos intracelulares como Salmonella, Shigella e Yersinia para transportar componentes de virulência para o hospedeiro. O desenvolvimento de tecnologias de imagem de super-resolução possibilitou a visualização de fatores de virulência com resolução antes inimaginável12,13,24.<sup clas...

As infecções bacterianas têm sido consideradas como um sério perigo para a saúde humana. Os patógenos utilizam sistemas de defesa altamente evoluídos, extremamente poderosos e intrincados, bem como uma variedade de fatores de virulência bacteriana (referidos como proteínas efetoras) para escapar das respostas imunes do hospedeiro e estabelecer infecções 1,2. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes a esses sistemas e o papel de proteínas efetoras individuais ainda são amplamente desconhecidos devido à escassez de abordagens adequadas para seguir diretamente os componentes e efetores cruciais da proteína nas células hospedeiras durante a patogênese.
Um exemplo típico é o sorovar Typhimurium de Salmonella enterica, que causa gastroenterite aguda. Salmonella Typhimurium usa sistemas de secreção tipo três (T3SS) para injetar uma variedade de proteínas efetoras diretamente nas células hospedeiras. Assim que a Salmonella entra na célula hospedeira, ela reside em um compartimento ácido ligado à membrana, denominado vacúolo contendo Salmonella (SCV)3,4. O pH ácido do SCV ativa a T3SS codificada pela ilha de patogenicidade de Salmonella 2 (SPI-2) e transloca uma quantidade de 20 ou mais proteínas efetoras através da membrana vacuolar para o citosol do hospedeiro 5,6,7,8. No interior do hospedeiro, esses coquetéis complexos de proteínas efetoras manipulam coordenadamente as vias de sinalização da célula hospedeira, resultando na formação de estruturas tubulares complexas e altamente dinâmicas estendidas a partir do SCV ao longo de microtúbulos, denominados filamentos induzidos por Salmonella (SIFs), que permitem que a Salmonella sobreviva e se replique dentro das células hospedeiras9,10,11.
Métodos para visualizar, rastrear e monitorar localizações de efetores bacterianos, e examinar seu tráfego e interações dentro das células hospedeiras, fornecem informações críticas sobre os mecanismos subjacentes à patogênese bacteriana. A marcação e localização de proteínas efetoras de T3SS secretadas por Salmonella dentro das células do hospedeiro tem se mostrado um desafio tecnológico12,13; No entanto, o desenvolvimento de proteínas fluorescentes codificadas geneticamente, transformou nossa capacidade de estudar e visualizar proteínas dentro de sistemas vivos. No entanto, o tamanho das proteínas fluorescentes (~25-30 kDa)15 é frequentemente comparável ou até maior do que o da proteína de interesse (POI; por exemplo, 13,65 kDa para SsaP, 37,4 kDa para SifA). De fato, a marcação de proteínas fluorescentes dos efetores frequentemente bloqueia a secreção do efetor marcado e obstrui o T3SS14.
Além disso, as proteínas fluorescentes são menos estáveis e emitem um baixo número de fótons antes do fotoclareamento, limitando seu uso em técnicas microscópicas de super-resolução16,17,18, particularmente em microscopia de localização por fotoativação (PALM), STORM e microscopia de depleção de emissão estimulada (STED). Embora as propriedades fotofísicas dos corantes fluorescentes orgânicos sejam superiores às das proteínas fluorescentes, métodos/técnicas como CLIP/SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH/FlAsH 22,23 e HA-Tags24,25 requerem uma proteína adicional ou apêndice peptídico que pode prejudicar a função-estrutura da proteína efetora de interesse, interferindo com a modificação ou tráfico pós-traducional. Um método alternativo que minimiza a modificação proteica necessária envolve a incorporação de ncAAs em um POI durante a tradução através de GCE. Os ncAAs são fluorescentes ou podem ser tornados fluorescentes via click chemistry 12,13,26,27,28.
Usando GCE, ncAAs com grupos bio-ortogonais minúsculos, funcionais (como um grupo azida, ciclopropeno ou ciclooctyne) podem ser introduzidos em quase qualquer local em uma proteína-alvo. Nessa estratégia, um códon nativo é trocado por um códon raro, como um códon de parada âmbar (TAG) em uma posição especificada no gene do POI. A proteína modificada é subsequentemente expressa em células ao lado de um par ortogonal aminoacil-tRNA sintetase/tRNA. O sítio ativo da tRNA sintetase é projetado para receber apenas um ncAA particular, que é então ligado covalentemente à extremidade 3' do tRNA que reconhece o códon âmbar. A ncAA é simplesmente introduzida no meio de crescimento, mas deve ser absorvida pela célula e chegar ao citosol, onde a aminoacil-tRNA sintetase (aaRS) pode ligá-la ao RNAt ortogonal; em seguida, é incorporado ao POI no local especificado (ver Figura 1)12. Assim, a ECG permite a incorporação sítio-específica de uma infinidade de grupos reativos bio-ortogonais como cetona, azida, alquina, ciclooctila, transcicloocteno, tetrazina, norboneno, α, amida β-insaturada e biciclo[6.1.0]-nonina em um POI, potencialmente superando as limitações dos métodos convencionais de marcação de proteínas 12,26,27,28.
Tendências recentes emergentes em técnicas de imagem de super-resolução abriram novos caminhos para investigar estruturas biológicas em nível molecular. Em particular, o STORM, uma técnica de super-resolução baseada em localização e molécula única, tornou-se uma ferramenta inestimável para visualizar estruturas celulares até ~20-30 nm e é capaz de investigar processos biológicos uma molécula de cada vez, descobrindo assim os papéis de moléculas intracelulares que ainda são desconhecidos em estudos tradicionais de média de conjunto13 . Técnicas de molécula única e super-resolução requerem uma pequena etiqueta com fluoróforos orgânicos brilhantes e fotoestáveis para a melhor resolução. Recentemente, demonstramos que a ECG pode ser usada para incorporar sondas adequadas para imagens de super-resolução12.
Duas das melhores escolhas para marcação de proteínas em células são a biciclo[6.1.0] nonilisina (BCN) e a transciclooctena-lisina (TCO; mostrada na Figura 1), que podem ser codificadas geneticamente usando uma variante do par tRNA/sintetase (aqui denominado tRNA Pyl/PylRS AF), ondePyl representa pirrolisina, eAF representa um mutante duplo racionalmente projetado (Y306A, Y384F) derivado de Methanosarcina mazei que codifica naturalmente pirrolisina 12, 29,30,31. Através da reação de Diels-Alder (SPIEDAC) de demanda eletrônica inversa promovida por deformação, esses aminoácidos reagem quimoseletivamente com conjugados de tetrazina (Figura 1)12,30,31. Tais reações de cicloadição são excepcionalmente rápidas e compatíveis com células vivas; Também podem ser fluorogênicos, se um fluoróforo apropriado for funcionalizado com a porção tetrazina12,26,32. Este trabalho apresenta um protocolo otimizado para monitorar a dinâmica de efetores bacterianos entregues em células hospedeiras usando GCE, seguido de localização subcelular de proteínas secretadas em células HeLa usando dSTORM. Os resultados indicam que a incorporação de uma ncAA via GCE, seguida por uma reação de clique com corantes fluorogênicos portadores de tetrazina, representa um método versátil para marcação seletiva, visualização de proteínas secretadas e subsequente localização subcelular no hospedeiro. Todos os componentes e procedimentos aqui detalhados, no entanto, podem ser ajustados ou substituídos para que o sistema GCE possa ser adaptado para investigar outras questões biológicas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine SDS running buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A661-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulphate</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP212R-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>ThermiFischer Scientific</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Agar</td>
			<td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDP-FL-tetrazine</td>
			<td>Lumiprobe (USA)</td>
			<td>2.14E+02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>444203</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en &#8211; L - Lysine (TCO*A)</td>
			<td>SiChem GmbH</td>
			<td>SC-8008</td>
			<td>Size: 500 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (Hoechst33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeNovix DS-11+ Spectrophotometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM*</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>* Used for maintaining HeLa Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM**</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>**Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain BL21 (DE3)</td>
			<td>Novagen (Madison, WI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 897-BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>30123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>97203</td>
			<td>Pack of 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7141-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BF229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-C1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocloric acid</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image processing and analysis:&#160; http://rsbweb.nih.gov/ij</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>Coomassie-based stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janelia Fluoro 646-tetrazine</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;Manager (v. 1.4.2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pulser cuvette</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2086</td>
			<td>0.2 cm electrode gap, pkg. of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon N-STORM</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks</td>
			<td>ThermiFischer Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnipur Casamino Acid</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>2240</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehhyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (100x)</td>
			<td>GenDEPOT&#160;</td>
			<td>CA005-010</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL-PylRS-AF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For plasmid construction and map see following references 
			1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 
			2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Mini-prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: elife. 2021, 10, e67789.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pWSK29-sseJ-HA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: elife. 2021, 10, e67789.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>540025</td>
			<td>Protein grade, 10% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sulphate</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>424220250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>539131</td>
			<td>100x Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-HA primary antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. enterica. serovar Typhimurium 14028s</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036-50G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM), 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-C1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator Model 100</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>24932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system)</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThunderSTORM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://zitmen.github.io/thunderstorm/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (1x), 0.25%&#160;&#160;</td>
			<td>GenDEPOT&#160;</td>
			<td>CA014-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-well tissue culture chamber slides</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>94.6190.802</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of bacterial secreted proteins using genetic code expansion

Os sistemas de secreção tipo três (T3SSs) permitem que bactérias gram-negativas injetem uma bateria de proteínas efetoras diretamente no citosol de células hospedeiras eucarióticas. Após a entrada, as proteínas efetoras injetadas modulam cooperativamente as vias de sinalização eucarióticas e reprogramam as funções celulares, permitindo a entrada e a sobrevivência bacteriana. O monitoramento e a localização dessas proteínas efetoras secretadas no contexto de infecções fornecem uma pegada para definir a interface dinâmica das interações patógeno-hospedeiro. No entanto, marcar e criar imagens de proteínas bacterianas em células hospedeiras sem interromper sua estrutura/função é tecnicamente desafiador. 
A construção de proteínas de fusão fluorescente não resolve esse problema, porque as proteínas de fusão obstruem o aparelho secretor e, portanto, não são secretadas. Para superar esses obstáculos, recentemente empregamos um método para marcação fluorescente sítio-específica de efetores secretados por bactérias, bem como outras proteínas difíceis de rotular, usando expansão de código genético (GCE). Este artigo fornece um protocolo passo-a-passo completo para marcar efetores secretados por Salmonella usando especificamente o sítio GCE, seguido de instruções para obter imagens da localização subcelular de proteínas secretadas em células HeLa usando microscopia direta de reconstrução óptica estocástica (dSTORM) 
Descobertas recentes sugerem que a incorporação de aminoácidos não-canônicos (ncAAs) via GCE, seguida de marcação bio-ortogonal com corantes contendo tetrazina, é uma técnica viável para marcação seletiva e visualização de proteínas secretadas por bactérias e posterior análise de imagens no hospedeiro. O objetivo deste artigo é fornecer um protocolo simples e claro que possa ser empregado por investigadores interessados em conduzir imagens de super-resolução usando GCE para estudar vários processos biológicos em bactérias e vírus, bem como interações patógeno-hospedeiro.

Este artigo de protocolo descreve um método baseado em GCE para marcação fluorescente sítio-específica e visualização de efetores secretados por Salmonella, como mostrado na Figura 1. A estrutura química do grupo bioortogonal transcicloocteno (TCO) e do corante fluorescente ncAA é mostrada na Figura 1A. A marcação de SseJ foi obtida pela incorporação genética de ncAAs bioortogonais em um códon de parada â...

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Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion

Este artigo fornece um protocolo simples e claro para marcar efetores secretados por Salmonella usando especificamente o sítio de expansão do código genético (GCE) e obter imagens da localização subcelular de proteínas secretadas em células HeLa usando microscopia de reconstrução óptica estocástica direta (dSTORM)

Imagem de Super-Resolução de Proteínas Secretadas por Bactérias Usando Expansão de Código Genético

Type three secretion systems (T3SSs) enable gram-negative bacteria to inject a battery of effector proteins directly into the cytosol of eukaryotic host ...

A expansão do código genético, ou GCE, supera as limitações de outras estratégias de rotulagem. Isso nos permite localizar proteínas especificamente marcadas, e temos fluoróforos orgânicos brilhantes que permitem sua visualização, para que possamos evitar estratégias que façam, digamos, fusões de proteínas fluorescentes, que podem interromper a função da proteína. Este método pode ser aplicado a qualquer outro sistema.Por exemplo, nós o usamos para rotular a proteína Zika CO, e isso nos permite fornecer e produzir o vírus Zika rotulado que podemos observar infectando células hospedeiras. Para começar, transfira 100 microlitros de cultura primária para cinco mililitros de meio LB contendo 35 microgramas por mililitro de cloranfenicol e 100 microgramas por mililitro de ampicilina. Incubar a 37 graus Celsius com agitação a 250 RPM até que a densidade óptica a 600 nanômetros atinja 0,6.Substitua o meio LB pelo meio N-mínimo modificado suplementado com um TCO milimolar, um aminoácido não canônico. E crescer as bactérias a 34 graus Celsius por 30 minutos. Adicione 0,2% de arabinose, 25 miligramas por mililitro de cloranfenicol e 100 miligramas por mililitro de ampicilina e cultive as células por mais seis horas, agitando a 250 RPM.Após seis horas, lavar as bactérias quatro vezes em um intervalo de 30 minutos com meios frescos de MgM sem aminoácidos não canônicos ou, ncAA. Centrifugar as bactérias, ressuspender em tampão PBS e incubar por uma hora a quatro graus Celsius no escuro para remover o excesso de ncAAs. Após uma hora, centrifugar as bactérias a 3.000 G por 15 minutos a quatro graus Celsius e armazená-las para uso posterior.Para um experimento controle, repita o mesmo experimento expressando proteínas portadoras de ncAA na ausência de ncAA. Ressuspender células de salmonela que expressam SseJ incorporado com TCO na ausência ou presença de TCO em PBS. Ajustar a densidade óptica em 600 nanômetros a quatro em PBS e incubar as células com 20 micromolares Janelia Fluor 646 tetrazeno ou 20 micromolares BDPFL tetrazina a 37 graus Celsius no escuro, e agitar por uma a duas horas a 250 RPM.Pastilha as células e lavagem três a quatro vezes com PBS contendo 5% de DMSO e 0,2% de Pluronic F-127. Ressuspender o pellet em PBS contendo DMSO a 5%. Depois de incubar durante a noite a quatro graus Celsius no escuro, lave duas vezes novamente com PBS.Fotografe as células imediatamente usando um microscópio confocal ou fixe-as com paraformaldeído a 1,5% em PBS por 30 a 45 minutos à temperatura ambiente no escuro. Cultivar e manter células HeLa a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade em DMEM de alta glicose suplementado com 10% de FBS, além de penicilina estreptomicina. Cultivar bactérias um dia antes da infecção e inocular uma única colônia de salmonela selvagem contendo plasmídeo pEVOL contendo par de tRNA sintetase ortogonal e plasmídeo pWSK29 contendo o gene SseJ em cinco milímetros de antibiótico contendo caldo LB padrão durante a noite a 37 graus Celsius com agitação a 250 RPM.Reparar um estoque de células diluídas a 100.000 células por mililitro e sementes de 50.000 células HeLA por poço em 500 microlitros de DMEM contendo meio de crescimento 10%FBS em uma lâmina de câmara de oito poços. Mantenha a lâmina da câmara em uma incubadora por 24 horas a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade. Para a infecção bacteriana, subcultura de salmonela selvagem contendo plasmídeo pEVOL e plasmídeo pWSK29 contendo o gene SseJ, diluindo 100 microlitros de cultura bacteriana noturna em três mililitros de meio LB contendo 35 microgramas por mililitro de cloranfenicol e 100 microgramas por mililitro de ampicilina.Incubar a 37 graus Celsius com agitação a 250 RPM por cinco a sete horas. Para iniciar a infecção celular HeLa, depois de retirar as células HeLa da incubadora, lave as células com DPBS pré-aquecido e adicione 500 microlitros de DMEM fresco contendo 10% FBS a cada poço. Coloque a lâmina da câmara de volta na incubadora de dióxido de carbono até que a infecção comece.Após cinco a sete horas de incubação, diluir a cultura de salmonela de modo que a densidade óptica a 600 nanômetros seja de 0,2 em um mililitro de meio de crescimento DMEM e adicionar as quantidades necessárias do inóculo de salmonela a cada poço da lâmina da câmara, de modo que a multiplicidade de infecção seja de 100. Depois de incubar as células infectadas em uma incubadora de dióxido de carbono por 30 minutos, lave as células três vezes com DPBS pré-aquecido para remover salmonela extracelular. Defina este ponto de tempo para zero horas pós-infecção e adicione 500 microlitros de meio completo contendo 100 microgramas por mililitro de gentamicina por uma hora.Após a incubação, novamente, lavar as células três vezes com DPBS como mostrado anteriormente e adicionar 500 microlitros do meio completo suplementado com 0,2% de arabinose, 10 microgramas por mililitro de gentamicina em cada poço da lâmina da câmara. Em um experimento controle, realizar infecções semelhantes de células HeLa sem TCO. Depois de incubar a lâmina da câmara por 10 horas na incubadora de dióxido de carbono, substitua o meio completo por meio completo fresco sem TCO e lave as células HeLa quatro vezes em um intervalo de 30 minutos cada com DPBS pré-aquecido.Em seguida, lave as células com meio fresco completo sem TCO. Após 12 horas pós-infecção, aspirar o meio das células e lavá-lo com DPBS pré-aquecido duas ou três vezes. Em um grupo dos poços, adicione 500 microlitros da mistura de solução de corante um, e em outro grupo dos poços da mesma lâmina de câmara, adicione 500 microlitros da mistura de solução de corante dois.Coloque a câmara desliza de volta para a incubadora de dióxido de carbono por uma e 1/2 a duas horas. Após 13,5 a 14 horas pós-infecção, lave as células HeLa duas vezes com DPBS pré-aquecido e adicione 500 microlitros de DMEM fresco suplementado com FBS. Depois de incubar por 30 minutos, lave as células novamente com DPBS pré-aquecido, como mostrado anteriormente, e depois lave com DMEM fresco quatro vezes em um intervalo de 30 minutos.Às 16 horas pós-infecção, fixar as células HeLa com paraformaldeído adicionando 200 microlitros de paraformaldeído a 4% em cada poço e incubando por 10 minutos à temperatura ambiente no escuro. Aspirar o paraformaldeído. Enxaguar três vezes com PBS e armazenar as células em PBS a quatro graus Celsius no escuro.Leve as células ao microscópio e coloque a câmara de imagem no palco do microscópio no suporte da amostra. Em seguida, troque o meio no poço com 0,4 mililitros do tampão de imagem GLOX BME recém-feito. Diminua a potência do laser para cerca de um miliwatt para identificar uma célula HeLa de interesse e ajuste o plano focal e o ângulo do feixe de laser enquanto ilumina a amostra com baixas densidades de laser de 647 nanômetros.Ajuste o ângulo de iluminação HILO. Capture uma referência à imagem limitada por fração da estrutura alvo e alterne os fluoróforos para o estado escuro girando o laser para sua potência máxima. Ajuste o ganho do pré-amplificador para três e ative a transferência de quadros.Em seguida, defina o ganho de EM para 200 para maior sensibilidade nas medições de dSTORM. Ajuste a intensidade do laser para um nível adequado onde os eventos de piscar são separados no espaço e no tempo. Defina o tempo de exposição para 30 milissegundos e inicie a aquisição.Adquira de 10.000 a 30.000 quadros. Repita a aquisição semelhante em ROIs diferentes. Para a reconstrução de imagens do dSTORM, abra a imagem J e importe os dados brutos.Abra o plug-in Thunderstorm e defina a configuração da câmera correspondente ao dispositivo. Vá para executar a análise e defina as configurações apropriadas, como filtragem de imagem, métodos de localização e localização de subpixels de moléculas. Clique em OK para iniciar a reconstrução da imagem e iniciar a análise do resultado final pós-processamento.Salmonella expressando SseJ incorporada com TCO são tratadas com Janelia Fluor 646 tetrazina e imageadas com fluorescência Janelia Fluor 646 na ausência ou presença de TCO. A fluorescência do SseJ é detectada apenas quando o TCO está presente. As células HeLa são infectadas com salmonela contendo psseJ-HA por 16 horas, fixadas e imunocoradas com anticorpo anti HA, LPS e DAPI.Como esperado, filamentos induzidos por salmonela dependentes de SseJ, ou SIFs, são formados nas células infectadas. Na ausência de TCO, o códon âmbar não é suprimido, e SIFs dependentes de SseJ estão ausentes em células HeLa infectadas. SIFs dependentes de SseJ são observados na presença de TCO, o que indica claramente que SseJ foi resgatado pela expressão de SseJF10TCOHA usando expansão de código genético, ou GCE.A especificidade de marcação de SseJF10TCOHA secretado em células HeLa através de reações de clique SPIEDAC usando duas misturas de corantes alternativos um e dois são mostrados aqui. O corante Click Janelia Fluor 646 TZ foi ainda usado para observar se havia alguma marcação de fundo em células HeLa infectadas com Salmanella selvagem portando SseJ HA na presença de TCO e plasmídeo de abóbada P. SseJ foi liberado no citoplasma da célula hospedeira sem sinais fluorescentes intracelulares ou inespecíficos, demonstrando que o sinal fluorescente era específico para SseJ.Imagem de superresolução de ECG marcada com SseJ em células HeLa é apresentada nesta figura. Uma imagem de campo brilhante de uma célula HeLa sob observação é mostrada aqui. A imagem de campo largo limitado por difração de SseJ secretado rotulado com TCO e Janelia Fluor 646 e a imagem dSTORM correspondente dos SIFs decorados com SseJ são apresentados aqui.A inserção mostra uma visão ampliada de um SseJ super resolvido na região da caixa. As soluções de estoque da NCAA foram preparadas em NaOH. Não se esqueça de neutralizá-lo antes ou depois da adição à mídia.Depois de marcar a proteína de interesse, lave a célula extensivamente, para que o sinal de fundo seja mínimo. Seguindo nosso procedimento de ECG, agora, podemos rotular qualquer fator de virulência em bactérias e acompanhar sua atividade usando nossas técnicas de imagem.

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Estudos genéticos de proteínas de reparo do DNA Humano Utilizando Levedura como um sistema modelo

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Biologia

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

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Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Usando sintéticos matrizes genéticas

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

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DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

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