Name: super-resolution imaging of bacterial secreted proteins using genetic code expansion
Uploaded: 2023-02-10T13:23:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion at JoVE.com

Эта работа была поддержана стартовыми фондами медицинского отделения Техасского университета в Галвестоне, штат Техас, и наградой Texas STAR для L.J.K. Мы благодарим профессора Эдварда Лемке (Европейская лаборатория молекулярной биологии, Гейдельберг, Германия) за плазмиду pEVOL-PylRS-AF. Изображения на рисунке 1 были созданы с помощью BioRender.

1. Плазмидная конструкция
<ol><li>Клонируйте ген, экспрессирующий POI, в экспрессионную плазмиду (например, pET28a-sseJ 10TAG), которая экспрессирует POI в E. coli BL21 (DE3). Этот шаг облегчает определение того, что мутанты функциональны.</li>
	<li>Для визуализации эффекторов, секретируемых <em...

<ol>
	<li>Marlovits, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+assembly+of+the+type+III+secretion+needle+complex.">Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex.</a> Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).</li><li>Kubori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+structure+of+the+Salmonella+typhimurium+type+III+protein+secretion+system.">Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system.</a> Science. 280 (5363), 602-605 (1998).</li><li>LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonellae+interactions+with+host+processes.">Salmonellae interactions with host processes.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).</li><li>Galan, J. E., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-injection+machines+in+bacteria.">Protein-injection machines in bacteria.</a> Cell. 172 (6), 1306-1318 (2018).</li><li>Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+by+phospho-OmpR+of+ssrA/B+gene+expression+in+Salmonella+pathogenicity+island+2.">Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2.</a> Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).</li><li>Walthers, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+response+regulator+SsrB+relieves+H-NS+silencing+by+displacing+H-NS+bound+in+polymerization+mode+and+directly+activates+transcription.">Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).</li><li>Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+DNA+biosensor+tracks+OmpR-dependent+acidification+of+Salmonella+during+macrophage+infection.">A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection.</a> PLoS Biology. 13 (4), e1002116 (2015).</li><li>Liew, A. T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell,+super-resolution+imaging+reveals+an+acid+pH-dependent+conformational+switch+in+SsrB+regulates+SPI-2.">Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2.</a> eLife. 8, e45311 (2019).</li><li>Knuff, K., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+the+SIF+is+happening-the+role+of+intracellular+Salmonella-induced+filaments.">What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335 (2017).</li><li>Drecktrah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+behavior+of+Salmonella-induced+membrane+tubules+in+epithelial+cells.">Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells.</a> Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).</li><li>Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+induces+the+formation+of+filamentous+structures+containing+lysosomal+membrane+glycoproteins+in+epithelial+cells.">Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).</li><li>Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+code+expansion+enables+visualization+of+Salmonella+type+three+secretion+system+components+and+secreted+effectors.">Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors.</a> elife. 10, e67789 (2021).</li><li>Singh, M. K., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+bacterial+pathogens+and+visualization+of+their+secreted+effectors.">Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors.</a> FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050 (2020).</li><li>Akeda, Y., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+release+and+unfolding+of+substrates+in+type+III+secretion.">Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion.</a> Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).</li><li>Su, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+as+tools+to+aid+protein+production.">Fluorescent proteins as tools to aid protein production.</a> Microbial Cell Factories. 4 (1), 12 (2005).</li><li>Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+development+of+photoactivatable+fluorescent+proteins+for+single-molecule-based+superresolution+imaging.">Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).</li><li>Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+specific+mislocalization+of+red+fluorescent+proteins+in+live+Escherichia+coli.">Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).</li><li>Gahlmann, A., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+bacterial+cell+biology+with+single-molecule+tracking+and+super-resolution+imaging.">Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging.</a> Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).</li><li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).</li><li>Gautier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+protein+tag+for+multiprotein+labeling+in+living+cells.">An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells.</a> Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).</li><li>Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+fluorescence+complementation+platform+for+visualizing+Salmonella+effector+proteins+reveals+distinctly+different+intracellular+niches+in+different+cell+types.">Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types.</a> ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).</li><li>Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell-based+optimization+of+the+biarsenical-binding+tetracysteine+motif+for+improved+fluorescence+and+affinity.">Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity.</a> Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li><li>Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pearling+transition+provides+evidence+of+force-driven+endosomal+tubulation+during+Salmonella+infection.">The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection.</a> mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).</li><li>Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SifA,+a+type+III+secreted+effector+of+Salmonella+typhimurium,+directs+Salmonella-induced+filament+(Sif)+formation+along+microtubules.">SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules.</a> Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).</li><li>Lang, K., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+incorporation+of+unnatural+amino+acids+and+bioorthogonal+labeling+of+proteins.">Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins.</a> Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).</li><li>Davis, L., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+proteins:+applications+of+genetic+code+expansion+in+cell+biology.">Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).</li><li>Chin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+p-azido-L-phenylalanine+to+the+genetic+code+of+Escherichia+coli.">Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).</li><li>Kipper, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+noncanonical+amino+acids+for+protein+labeling+in+a+genomically+recoded+Escherichia+coli.">Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).</li><li>Uttamapinant, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+code+expansion+enables+live-cell+and+super-resolution+imaging+of+site-specifically+labeled+cellular+proteins.">Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins.</a> Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).</li><li>Plass, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+for+Diels-Alder+reactions+in+living+cells.">Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).</li><li>Lang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+encoding+of+bicyclononynes+and+trans-cyclooctenes+for+site-specific+protein+labeling+in+vitro+and+in+live+mammalian+cells+via+rapid+fluorogenic+Diels-Alder+reactions.">Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-exploration+of+the+codon+context+effect+on+amber+codon-guided+incorporation+of+noncanonical+amino+acids+in+Escherichia+coli+by+the+blue-white+screening+assay.">Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay.</a> ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).</li><li>Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+tabulated+from+the+international+DNA+sequence+databases:+status+for+the+year+2000.">Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 292 (2000).</li><li>Spahn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+super-resolution+imaging+of+bacterial+regulatory+proteins:+the+nucleoid+and+the+cell+membrane+in+single,+fixed+E.+coli+cells.">Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).</li><li>Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy.">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li><li>Xu, J., Ma, H., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy+(STORM).">Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM).</a> Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).</li><li>Meineke, B., Heimg&#228;rtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Els&#228;sser, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+incorporation+of+two+ncAAs+for+two-color+bioorthogonal+labeling+and+crosslinking+of+proteins+on+live+mammalian+cells.">Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells.</a> Cell Reports. 31 (12), 107811 (2020).</li><li>Bessa-Neto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+labeling+of+transmembrane+proteins+with+non-canonical+amino+acids+unveils+masked+epitopes+in+live+neurons.">Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons.</a> Nature Communications. 12 (1), 6715 (2021).</li><li>Beliu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+labeling+with+tetrazine-dyes+for+super-resolution+microscopy.">Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy.</a> Communication Biology. 2, 261 (2019).</li><li>Arsi&#263;, A., Hagemann, C., Stajkovi&#263;, N., Schubert, T., Niki&#263;-Spiegel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+genetically+encoded+tags+for+fluorescent+protein+labeling+in+living+neurons.">Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons.</a> Nature Communications. 13 (1), 314 (2022).</li></ol>

Подход, описанный в настоящем описании, был использован для отслеживания точного местоположения эффекторных белков, введенных в клетку-хозяина бактериальным T3SS после инфицирования. T3SS используются внутриклеточными патогенами, такими как сальмонелла, шигелла и иерсиния</em...

Бактериальные инфекции долгое время считались серьезной опасностью для здоровья человека. Патогены используют высокоразвитые, чрезвычайно мощные и сложные защитные системы, а также различные факторы бактериальной вирулентности (называемые эффекторными белками) для уклонения от иммунных реакций хозяина и установления инфекций 1,2. Однако молекулярные механизмы, лежащие в основе этих систем, и роль отдельных эффекторных белков до сих пор в значительной степени неизвестны из-за отсутствия подходящих подходов для непосредственного отслеживания важнейших белковых компонентов и эффекторов в клетках-хозяевах во время патогенеза.
Одним из типичных примеров является Salmonella enterica serovar Typhimurium, который вызывает острый гастроэнтерит. Сальмонелла Typhimurium использует системы секреции третьего типа (T3SS) для инъекции различных эффекторных белков непосредственно в клетки-хозяева. Как только сальмонелла попадает в клетку-хозяина, она находится в кислом мембраносвязанном компартменте, называемом сальмонеллосодержащей вакуолью (SCV)3,4. Кислотный рН SCV активирует T3SS, кодируемый островком патогенности сальмонеллы 2 (SPI-2), и перемещает залп из 20 или более эффекторных белков через вакуолярную мембрану в цитозоль хозяина 5,6,7,8. Внутри хозяина эти сложные коктейли эффекторных белков координируют сигнальные пути клетки-хозяина, что приводит к образованию высокодинамичных, сложных трубчатых мембранных структур, простирающихся от SCV вдоль микротрубочек, называемых сальмонелла-индуцированными филаментами (SIF), которые позволяют сальмонеллам выживать и реплицироваться в клетках-хозяевах9,10,11.
Методы визуализации, отслеживания и мониторинга локализации бактериальных эффекторов, а также изучения их трафика и взаимодействия внутри клеток-хозяев дают критическое представление о механизмах, лежащих в основе бактериального патогенеза. Маркировка и локализация секретируемых сальмонеллой эффекторных белков T3SS внутри клеток-хозяев оказалась технологической проблемой12,13; Тем не менее, разработка генетически кодируемых флуоресцентных белков изменила нашу способность изучать и визуализировать белки в живых системах. Однако размер флуоресцентных белков (~25-30 кДа)15 часто сопоставим или даже больше, чем размер интересующего белка (POI; например, 13,65 кДа для SsaP, 37,4 кДа для SifA). Фактически, флуоресцентная белковая маркировка эффекторов часто блокирует секрецию меченого эффектора и заклинивает T3SS14.
Кроме того, флуоресцентные белки менее стабильны и испускают небольшое количество фотонов перед фотообесцвечиванием, что ограничивает их использование в микроскопических методах сверхвысокого разрешения16,17,18, особенно в фотоактивационной локализационной микроскопии (PALM), STORM и микроскопии с истощением стимулированного излучения (STED). В то время как фотофизические свойства органических флуоресцентных красителей превосходят свойства флуоресцентных белков, методы/методы, такие как CLIP/SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH/FlAsH 22,23 и HA-Tags24,25, требуют дополнительного белкового или пептидного придатка, который может нарушить структурно-функциональную функцию интересующего эффекторного белка, препятствуя посттрансляционной модификации или транспортировке. Альтернативный метод, который сводит к минимуму необходимую модификацию белка, включает включение ncAA в POI во время трансляции через GCE. ncAA либо флуоресцентны, либо могут быть сделаны флуоресцентными с помощью клик-химии 12,13,26,27,28.
Используя GCE, ncAA с крошечными функциональными биоортогональными группами (такими как азид, циклопропен или циклооктинная группа) могут быть введены практически в любое место в целевом белке. В этой стратегии нативный кодон заменяется редким кодоном, таким как янтарный (TAG) стоп-кодон в определенной позиции в гене POI. Модифицированный белок впоследствии экспрессируется в клетках вместе с ортогональной парой аминоацил-тРНК-синтетаза/тРНК. Активный сайт тРНК-синтетазы предназначен для получения только одного конкретного ncAA, который затем ковалентно присоединяется к 3'-концу тРНК, распознающему янтарный кодон. ncAA просто вводится в питательную среду, но он должен быть поглощен клеткой и достичь цитозоля, где аминоацил-тРНК-синтетаза (aaRS) может связать его с ортогональной тРНК; затем он включается в POI в указанном месте (см. рис. 1)12. Таким образом, GCE позволяет сайт-специфическое включение множества биоортогональных реакционноспособных групп, таких как кетон, азид, алкин, циклооктин, трансциклоктен, тетразин, норбонен, α, β-ненасыщенный амид и бицикло [6.1.0]-нонин в POI, потенциально преодолевая ограничения традиционных методов маркировки белков 12,26,27,28.
Последние тенденции в методах визуализации сверхвысокого разрешения открыли новые возможности для исследования биологических структур на молекулярном уровне. В частности, STORM, одномолекулярный метод сверхвысокого разрешения, основанный на локализации, стал бесценным инструментом для визуализации клеточных структур с длиной волны до ~ 20-30 нм и способен исследовать биологические процессы по одной молекуле за раз, тем самым открывая роли внутриклеточных молекул, которые еще неизвестны в традиционных исследованиях, усредненных по ансамблю13 . Для одномолекулярных методов и методов сверхвысокого разрешения требуется небольшая метка с яркими, фотостабильными органическими флуорофорами для наилучшего разрешения. Недавно мы продемонстрировали, что GCE можно использовать для включения подходящих зондов для получения изображений сверхвысокого разрешения12.
Двумя лучшими вариантами мечения белков в клетках являются бицикло [6.1.0] нонинлизин (BCN) и транс-циклооктен-лизин (TCO; показан на рисунке 1), которые могут быть генетически кодированы с использованием варианта пары тРНК/синтетаза (здесь называемой тРНК Pyl/PylRS AF), гдеPyl представляет собой пирролизин, а AF представляет собой рационально разработанный двойной мутант (Y306A, Y384F), полученный из Methanosarcina mazei, который естественным образом кодирует пирролизин12. 29,30,31. В ходе реакции циклоприсоединения Дильса-Альдера с обратным электронным спросом (SPIEDAC) эти аминокислоты хемоселективно реагируют с конъюгатами тетразина (рис. 1)12,30,31. Такие реакции циклоприсоединения исключительно быстры и совместимы с живыми клетками; Они также могут быть флюорогенными, если соответствующий флуорофор функционализирован с тетразиновым фрагментом12,26,32. В данной работе представлен оптимизированный протокол мониторинга динамики бактериальных эффекторов, доставляемых в клетки-хозяева с помощью GCE, с последующей субклеточной локализацией секретируемых белков в клетках HeLa с использованием dSTORM. Результаты показывают, что включение ncAA через GCE с последующей реакцией щелчка с флуорогенными тетразинсодержащими красителями представляет собой универсальный метод селективной маркировки, визуализации секретируемых белков и последующей субклеточной локализации в организме хозяина. Однако все компоненты и процедуры, описанные здесь, могут быть скорректированы или заменены таким образом, чтобы система GCE могла быть адаптирована для исследования других биологических вопросов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine SDS running buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A661-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulphate</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP212R-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>ThermiFischer Scientific</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Agar</td>
			<td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDP-FL-tetrazine</td>
			<td>Lumiprobe (USA)</td>
			<td>2.14E+02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>444203</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en &#8211; L - Lysine (TCO*A)</td>
			<td>SiChem GmbH</td>
			<td>SC-8008</td>
			<td>Size: 500 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (Hoechst33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeNovix DS-11+ Spectrophotometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM*</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>* Used for maintaining HeLa Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM**</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>**Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain BL21 (DE3)</td>
			<td>Novagen (Madison, WI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 897-BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>30123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>97203</td>
			<td>Pack of 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7141-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BF229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-C1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocloric acid</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image processing and analysis:&#160; http://rsbweb.nih.gov/ij</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>Coomassie-based stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janelia Fluoro 646-tetrazine</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;Manager (v. 1.4.2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pulser cuvette</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2086</td>
			<td>0.2 cm electrode gap, pkg. of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon N-STORM</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks</td>
			<td>ThermiFischer Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnipur Casamino Acid</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>2240</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehhyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (100x)</td>
			<td>GenDEPOT&#160;</td>
			<td>CA005-010</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL-PylRS-AF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For plasmid construction and map see following references 
			1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 
			2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Mini-prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: elife. 2021, 10, e67789.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pWSK29-sseJ-HA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: elife. 2021, 10, e67789.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>540025</td>
			<td>Protein grade, 10% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sulphate</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>424220250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>539131</td>
			<td>100x Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-HA primary antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. enterica. serovar Typhimurium 14028s</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036-50G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM), 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-C1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator Model 100</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>24932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system)</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThunderSTORM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://zitmen.github.io/thunderstorm/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (1x), 0.25%&#160;&#160;</td>
			<td>GenDEPOT&#160;</td>
			<td>CA014-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-well tissue culture chamber slides</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>94.6190.802</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of bacterial secreted proteins using genetic code expansion

Системы секреции третьего типа (T3SS) позволяют грамотрицательным бактериям вводить батарею эффекторных белков непосредственно в цитозоль эукариотических клеток-хозяев. При входе введенные эффекторные белки совместно модулируют эукариотические сигнальные пути и перепрограммируют клеточные функции, обеспечивая проникновение и выживание бактерий. Мониторинг и локализация этих секретируемых эффекторных белков в контексте инфекций обеспечивает след для определения динамического интерфейса взаимодействий хозяина и патогена. Однако маркировка и визуализация бактериальных белков в клетках-хозяевах без нарушения их структуры/функции технически сложны. 
Построение флуоресцентных слитых белков не решает эту проблему, потому что слитые белки заклинивают секреторный аппарат и, таким образом, не секретируются. Чтобы преодолеть эти препятствия, мы недавно применили метод сайт-специфической флуоресцентной маркировки эффекторов, секретируемых бактериями, а также других трудно маркируемых белков с использованием расширения генетического кода (GCE). В этой статье представлен полный пошаговый протокол маркировки эффекторов, секретируемых сальмонеллой , с использованием сайта GCE, за которым следуют указания по визуализации субклеточной локализации секретируемых белков в клетках HeLa с использованием прямой стохастической оптической реконструирующей микроскопии (dSTORM) 
Недавние результаты свидетельствуют о том, что включение неканонических аминокислот (ncAA) через GCE с последующей биоортогональной маркировкой тетразинсодержащими красителями является жизнеспособным методом селективного мечения и визуализации бактериальных секретируемых белков и последующего анализа изображений в организме хозяина. Цель этой статьи — предоставить простой и понятный протокол, который может быть использован исследователями, заинтересованными в проведении визуализации сверхвысокого разрешения с использованием GCE для изучения различных биологических процессов в бактериях и вирусах, а также взаимодействия хозяина и патогена.

В этом протокольном документе описывается основанный на GCE метод сайт-специфической флуоресцентной маркировки и визуализации эффекторов, секретируемых сальмонеллой , как показано на рисунке 1. Химическая структура несущей ncAA трансциклооктеново?...

Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion at JoVE.com

Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion

В этой статье представлен простой и понятный протокол для маркировки эффекторов, секретируемых сальмонеллой , с использованием расширения генетического кода (GCE) и визуализации субклеточной локализации секретируемых белков в клетках HeLa с использованием прямой стохастической оптической реконструкционной микроскопии (dSTORM)

Визуализация белков, секретируемых бактериями, со сверхвысоким разрешением с использованием расширения генетического кода

Type three secretion systems (T3SSs) enable gram-negative bacteria to inject a battery of effector proteins directly into the cytosol of eukaryotic host ...

Расширение генетического кода, или GCE, преодолевает ограничения других стратегий маркировки. Это позволяет нам размещать специально меченые белки, и у нас есть яркие органические флуорофоры, которые позволяют их визуализировать, поэтому мы можем избежать стратегий, которые производят, скажем, флуоресцентные слияния белков, которые могут нарушить функцию белка. Этот метод может быть применен к любой другой системе.Например, мы использовали его для маркировки белка Zika CO, и это позволяет нам предоставлять и производить меченый вирус Зика, который мы затем можем наблюдать, заражая клетки-хозяева. Для начала переведите 100 микролитров первичной культуры в пять миллилитров среды LB, содержащей 35 микрограммов на миллилитр левомицетина и 100 микрограммов на миллилитр ампициллина. Инкубируйте при 37 градусах Цельсия с встряхиванием при 250 об/мин, пока оптическая плотность при 600 нанометрах не достигнет 0,6.Замените среду LB модифицированной N-минимальной средой, дополненной одним миллимолярным TCO, неканонической аминокислотой. И выращивайте бактерии при температуре 34 градуса по Цельсию в течение 30 минут. Добавьте 0,2% арабинозы, 25 миллиграммов на миллилитр хлорамфеникола и 100 миллиграммов на миллилитр ампициллина и выращивайте клетки еще шесть часов, встряхивая при 250 об/мин.Через шесть часов промойте бактерии четыре раза с интервалом в 30 минут свежими средами MgM без неканонических аминокислот или ncAA. Центрифугируйте бактерии, повторно суспендируйте в буфере PBS и инкубируйте в течение одного часа при четырех градусах Цельсия в темноте, чтобы удалить излишки ncAA. Через час центрифугируйте бактерии при температуре 3 000 г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия и храните их для дальнейшего использования.Для контрольного эксперимента повторите тот же эксперимент, экспрессируя белки, несущие ncAA, в отсутствие ncAA. Повторно суспендировать клетки сальмонеллы, экспрессирующие SseJ, инкорпорированные с TCO в отсутствие или присутствие TCO в PBS. Отрегулируйте оптическую плотность на 600 нанометрах до четырех в PBS и инкубируйте клетки с 20-микромолярным тетразеном Janelia Fluor 646 или 20-микромолярным тетразином BDPFL при 37 градусах Цельсия в темноте и встряхивайте в течение одного-двух часов при 250 об/мин.Гранулируйте ячейки и промойте три-четыре раза PBS, содержащим 5% DMSO и 0,2% Pluronic F-127. Повторно суспендируйте гранулы в PBS, содержащем 5% ДМСО. После инкубации в течение ночи при четырех градусах Цельсия в темноте еще раз дважды промыть PBS.Немедленно визуализируйте клетки с помощью конфокального микроскопа или зафиксируйте их 1,5% параформальдегидом в PBS в течение 30-45 минут при комнатной температуре в темноте. Культивируйте и поддерживайте клетки HeLa при температуре 37 градусов по Цельсию, 5% углекислого газа и влажности 95% в DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% FBS в дополнение к пенициллину стрептомицину. Культивируют бактерии за день до заражения и инокулируют одну колонию сальмонеллы дикого типа, содержащую плазмиду pEVOL, содержащую ортогональную пару тРНК-синтетазы, и плазмиду pWSK29, содержащую ген SseJ, в пять миллиметров антибиотика, содержащего стандартный бульон LB, в течение ночи при 37 градусах Цельсия с встряхиванием при 250 об / мин.Восстановите разбавленный клеточный запас со скоростью 100 000 клеток на миллилитр и засейте 50 000 клеток HeLA на лунку в 500 микролитров DMEM, содержащего 10% питательной среды FBS, в восьмилуночном горном горке. Храните предметное стекло в инкубаторе в течение 24 часов при температуре 37 градусов по Цельсию, 5% углекислого газа и 95% влажности. Для бактериальной инфекции субкультуру сальмонеллы дикого типа, содержащую плазмиду pEVOL и плазмиду pWSK29, содержащую ген SseJ, путем разбавления 100 микролитров ночной бактериальной культуры в три миллилитра среды LB, содержащей 35 микрограммов на миллилитр хлорамфеникола и 100 микрограммов на миллилитр ампициллина.Инкубировать при 37 градусах Цельсия при встряхивании при 250 об/мин в течение пяти-семи часов. Чтобы инициировать инфекцию клеток HeLa, после извлечения клеток HeLa из инкубатора промойте клетки предварительно подогретым DPBS и добавьте в каждую лунку по 500 микролитров свежего DMEM, содержащего 10% FBS. Поместите горку камеры обратно в инкубатор с углекислым газом, пока не начнется заражение.После пяти-семи часов инкубации разбавьте культуру сальмонеллы так, чтобы оптическая плотность на 600 нанометрах составляла 0,2 в одном миллилитре питательной среды DMEM, и добавьте необходимое количество инокулята сальмонеллы в каждую лунку предметного стекла камеры, чтобы кратность инфекции составляла 100. После инкубации инфицированных клеток в инкубаторе с углекислым газом в течение 30 минут трижды промойте клетки предварительно подогретым DPBS для удаления внеклеточной сальмонеллы. Установите этот момент времени на ноль часов после заражения и добавьте 500 микролитров полной среды, содержащей 100 микрограммов на миллилитр гентамицина в течение одного часа.После инкубации снова трижды промойте клетки DPBS, как показано ранее, и добавьте 500 микролитров полной среды с добавлением 0,2% арабинозы, 10 микрограммов на миллилитр гентамицина в каждую лунку предметного стекла камеры. В контрольном эксперименте выполняйте аналогичные инфекции клеток HeLa без TCO. После инкубации предметного стекла камеры в течение 10 часов в инкубаторе углекислого газа замените всю среду свежей полной средой без совокупной стоимости владения и промойте клетки HeLa четыре раза с интервалом в 30 минут каждая предварительно подогретым DPBS.Затем промойте клетки свежей полной средой без совокупной стоимости владения. Через 12 часов после заражения аспирируйте среду из клеток и промойте клетку предварительно подогретым DPBS два или три раза. В одну группу лунок добавляют 500 микролитров смеси раствора красителя один, а в другую группу лунок того же горного стекла камеры добавляют 500 микролитров смеси раствора красителя два.Поместите камеру обратно в инкубатор с углекислым газом на один и от 1/2 до двух часов. Через 13,5-14 часов после заражения дважды промойте клетки HeLa предварительно подогретым DPBS и добавьте 500 микролитров свежего DMEM с добавлением FBS. После инкубации в течение 30 минут снова промойте клетки предварительно подогретым DPBS, как показано ранее, а затем промойте свежим DMEM четыре раза с интервалом в 30 минут.Через 16 часов после заражения зафиксируйте клетки HeLa параформальдегидом, добавив 200 микролитров 4% параформальдегида в каждую лунку и инкубируя в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте. Аспирируйте параформальдегид. Трижды промойте PBS и храните клетки в PBS при четырех градусах Цельсия в темноте.Поднесите клетки к микроскопу и поместите камеру визуализации на столик микроскопа в держателе образца. Затем замените среду в лунке на 0,4 миллилитра свежеприготовленного буфера для визуализации GLOX BME. Уменьшите мощность лазера примерно до одного милливатта, чтобы идентифицировать интересующую ячейку HeLa, и отрегулируйте фокальную плоскость и угол лазерного луча, освещая образец низкой плотностью лазера 647 нанометров.Отрегулируйте угол освещения HILO. Захватите эталонное изображение целевой структуры с ограниченной дробью и переключите флуорофоры в темное состояние, повернув лазер на максимальную мощность. Установите коэффициент усиления предварительного усилителя на три и активируйте передачу кадров.Затем установите усиление ЭМ на 200 для более высокой чувствительности при измерениях dSTORM. Отрегулируйте мощность лазера до подходящего уровня, при котором мигающие события разделены в пространстве и времени. Установите время экспозиции на 30 миллисекунд и начните съемку.Приобретайте от 10 000 до 30 000 кадров. Повторите аналогичное приобретение с разной рентабельностью инвестиций. Для восстановления изображений dSTORM откройте изображение J и импортируйте необработанные данные.Откройте плагин Thunderstorm и настройте параметры камеры, соответствующие устройству. Перейдите к запуску анализа и установите соответствующие настройки, такие как фильтрация изображений, методы локализации и субпиксельная локализация молекул. Нажмите кнопку «ОК», чтобы начать реконструкцию изображения и начать анализ конечных результатов постобработки.Сальмонеллы, экспрессирующие SseJ, включенные в TCO, обрабатывают тетразином Janelia Fluor 646 и визуализируют флуоресценцией Janelia Fluor 646 в отсутствие или присутствие TCO. Флуоресценция SseJ обнаруживается только при наличии TCO. Клетки HeLa инфицируются сальмонеллой, содержащей psseJ-HA в течение 16 часов, фиксируются и иммуноокрашиваются антителами против HA, LPS и DAPI.Как и ожидалось, в инфицированных клетках образуются SseJ-зависимые филаменты, индуцированные сальмонеллой, или SIF. При отсутствии TCO янтарный кодон не подавляется, а SseJ-зависимые SIF отсутствуют в инфицированных клетках HeLa. SseJ-зависимые SIF наблюдаются в присутствии TCO, что ясно указывает на то, что SseJ был спасен экспрессией SseJF10TCOHA с использованием расширения генетического кода или GCE.Здесь показана специфичность маркировки секретируемого SseJF10TCOHA в клетках HeLa с помощью клик-реакций SPIEDAC с использованием двух альтернативных смесей красителей один и смеси красителей два. Клик-краситель Janelia Fluor 646 TZ был дополнительно использован для наблюдения за тем, есть ли какая-либо фоновая маркировка в клетках HeLa, инфицированных сальманеллой дикого типа, несущей SseJ HA, в присутствии плазмиды TCO и P. SseJ высвобождался в цитоплазму клетки-хозяина без внутриклеточных или неспецифических флуоресцентных сигналов, демонстрирующих, что флуоресцентный сигнал был специфичен для SseJ.На этом рисунке представлена визуализация со сверхвысоким разрешением меченого SseJ GCE в клетках HeLa. Здесь показано изображение наблюдаемой клетки HeLa в светлом поле. Здесь представлено дифракционное ограниченное широкопольное изображение секретируемого SseJ, меченного TCO и Janelia Fluor 646, и соответствующее изображение dSTORM украшенных SseJ SIF.На вставке показано увеличенное изображение SseJ со сверхразрешением в коробочной области. Биржевые решения NCAA были подготовлены в NaOH. Не забывайте нейтрализовать его до или после добавления в носитель.После мечения интересующего белка тщательно промойте клетку, чтобы фоновый сигнал был минимальным. Следуя нашей процедуре GCE, теперь мы можем маркировать любой фактор вирулентности бактерий и следить за его активностью, используя наши методы визуализации.

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Генетические исследования белков человека Ремонт ДНК Использование дрожжей в качестве модельной системы

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Сопоставление бактериальных функциональных сетей и путей в<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Использование синтетических генетических массивы

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Super-Resolution Imaging бактериального Машины отдела

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Опытные образцы для оптимизации STORM супер-разрешения микроскопии

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Подготовка образцов для одной микроскопии атомной силы Virion и флуоресценции супер-разрешения

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Супер-Resolution Imaging из Cytokinetic Z Кольцо в живых бактерий Использование быстрого 3D-Structured Illumination микроскопии (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Генетический штрих кода с флуоресцентных белков для мультиплексированных приложений

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

ДНК Электропорация, Изоляция и изображений из мышечных волокон

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

С открытым исходным кодом Анализ Одночастичного для супер-разрешение микроскопии с VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Основного состояния истощения суперразрешением изображений в клетках млекопитающих

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...