Name: super-resolution imaging of bacterial secreted proteins using genetic code expansion
Uploaded: 2023-02-10T13:23:00
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Este trabajo fue apoyado por fondos iniciales de la rama médica de la Universidad de Texas, Galveston, TX, y un premio Texas STAR a L.J.K. Agradecemos al Prof. Edward Lemke (Laboratorio Europeo de Biología Molecular, Heidelberg, Alemania) por el plásmido pEVOL-PylRS-AF. Las imágenes de la Figura 1 se crearon con BioRender.

1. Construcción de plásmidos
<ol><li>Clone el gen que expresa el POI en un plásmido de expresión (por ejemplo, pET28a-sseJ 10TAG) que expresa el POI en E. coli BL21 (DE3). Este paso facilita la determinación de que los mutantes son funcionales.</li>
	<li>Para la visualización de efectores secretados por Salmonella en células huésped, construir un plásmido de expresión (pWSK29-sseJ-HA) que exprese el objetivo POI SseJ bajo el control de su promotor nativo, c...

<ol>
	<li>Marlovits, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+assembly+of+the+type+III+secretion+needle+complex.">Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex.</a> Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).</li><li>Kubori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+structure+of+the+Salmonella+typhimurium+type+III+protein+secretion+system.">Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system.</a> Science. 280 (5363), 602-605 (1998).</li><li>LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. 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El enfoque descrito en este documento se utilizó para rastrear la ubicación precisa de las proteínas efectoras inyectadas en la célula huésped por el T3SS bacteriano después de la infección. Los T3SS son empleados por patógenos intracelulares como Salmonella, Shigella y Yersinia para transportar componentes de virulencia al huésped. El desarrollo de tecnologías de imagen de superresolución ha permitido visualizar factores de virulencia a una resolución antes inimaginable<sup class="...

Las infecciones bacterianas se han considerado durante mucho tiempo como un grave peligro para la salud humana. Los patógenos utilizan sistemas de defensa altamente evolucionados, extremadamente poderosos e intrincados, así como una variedad de factores de virulencia bacteriana (denominados proteínas efectoras) para evadir las respuestas inmunes del huésped y establecer infecciones 1,2. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes a estos sistemas y el papel de las proteínas efectoras individuales aún se desconocen en gran medida debido a la escasez de enfoques adecuados para seguir directamente los componentes cruciales de las proteínas y los efectores en las células huésped durante la patogénesis.
Un ejemplo típico es Salmonella enterica serovar Typhimurium, que causa gastroenteritis aguda. Salmonella Typhimurium utiliza sistemas de secreción de tipo tres (T3SS) para inyectar una variedad de proteínas efectoras directamente en las células huésped. Tan pronto como la Salmonella entra en la célula huésped, reside en un compartimento ácido unido a la membrana, denominado vacuola que contiene Salmonella (SCV)3,4. El pH ácido del SCV activa la isla de patogenicidad de Salmonella 2 (SPI-2) codificada T3SS y transloca una descarga de 20 o más proteínas efectoras a través de la membrana vacuolar en el citosol del huésped 5,6,7,8. Dentro del huésped, estos complejos cócteles de proteínas efectoras manipulan coordinadamente las vías de señalización de la célula huésped, lo que resulta en la formación de estructuras de membrana tubular altamente dinámicas y complejas que se extienden desde el SCV a lo largo de los microtúbulos, denominados filamentos inducidos por Salmonella (SIF), que permiten que la Salmonella sobreviva y se replique dentro de las células huésped9,10,11.
Los métodos para visualizar, rastrear y monitorear las localizaciones efectoras bacterianas, y examinar su tráfico e interacciones dentro de las células huésped, proporcionan información crítica sobre los mecanismos que sustentan la patogénesis bacteriana. El etiquetado y localización de proteínas efectoras T3SS secretadas por Salmonella dentro de las células huésped ha demostrado ser un desafío tecnológico12,13; No obstante, el desarrollo de proteínas fluorescentes codificadas genéticamente ha transformado nuestra capacidad para estudiar y visualizar proteínas dentro de los sistemas vivos. Sin embargo, el tamaño de las proteínas fluorescentes (~25-30 kDa)15 es a menudo comparable o incluso mayor que el de la proteína de interés (POI; por ejemplo, 13,65 kDa para SsaP, 37,4 kDa para SifA). De hecho, el etiquetado de proteínas fluorescentes de los efectores a menudo bloquea la secreción del efector marcado y bloquea el T3SS14.
Además, las proteínas fluorescentes son menos estables y emiten un bajo número de fotones antes del fotoblanqueo, limitando su uso en técnicas microscópicas de superresolución16,17,18, particularmente en microscopía de localización de fotoactivación (PALM), STORM y microscopía de agotamiento de emisión estimulada (STED). Si bien las propiedades fotofísicas de los colorantes fluorescentes orgánicos son superiores a las de las proteínas fluorescentes, los métodos / técnicas como CLIP / SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH / FlAsH 22,23 y HA-Tags 24,25 requieren un apéndice adicional de proteína o péptido que puede perjudicar la función estructural de la proteína efectora de interés al interferir con la modificación o el tráfico postraduccional. Un método alternativo que minimiza la modificación de proteínas necesaria implica la incorporación de ncAA en un POI durante la traducción a través de GCE. Los ncAA son fluorescentes o pueden hacerse fluorescentes a través de la química de clic 12,13,26,27,28.
Usando GCE, los ncAA con grupos bioortogonales diminutos y funcionales (como un grupo azida, ciclopropeno o ciclooctino) se pueden introducir en casi cualquier ubicación en una proteína diana. En esta estrategia, un codón nativo se intercambia con un codón raro como un codón de parada ámbar (TAG) en una posición específica en el gen del POI. La proteína modificada se expresa posteriormente en las células junto con un par ortogonal aminoacil-ARNt sintetasa/ARNt. El sitio activo de la ARNt sintetasa está diseñado para recibir solo un ncAA particular, que luego se une covalentemente al extremo 3 'del ARNt que reconoce el codón ámbar. El ncAA simplemente se introduce en el medio de crecimiento, pero debe ser absorbido por la célula y llegar al citosol donde la aminoacil-ARNt sintetasa (aaRS) puede unirlo al ARNt ortogonal; a continuación, se incorpora al POI en la ubicación especificada (véase la figura 1)12. Por lo tanto, GCE permite la incorporación específica del sitio de una plétora de grupos reactivos bioortogonales como cetona, azida, alquino, ciclooctino, transcicloocteno, tetrazina, norboneno, α, amida β-insaturada y biciclo [6.1.0]-nonino en un POI, superando potencialmente las limitaciones de los métodos convencionales de etiquetado de proteínas 12,26,27,28.
Las recientes tendencias emergentes en las técnicas de imagen de superresolución han abierto nuevas vías para investigar estructuras biológicas a nivel molecular. En particular, STORM, una técnica de superresolución basada en la localización de una sola molécula, se ha convertido en una herramienta invaluable para visualizar estructuras celulares hasta ~ 20-30 nm y es capaz de investigar procesos biológicos una molécula a la vez, descubriendo así los roles de las moléculas intracelulares que aún se desconocen en los estudios tradicionales promediados por conjuntos13 . Las técnicas de molécula única y súper resolución requieren una pequeña etiqueta con fluoróforos orgánicos brillantes y fotoestables para obtener la mejor resolución. Recientemente hemos demostrado que la GCE se puede utilizar para incorporar sondas adecuadas para imágenes de superresolución12.
Dos de las mejores opciones para el etiquetado de proteínas en las células son la biciclo [6.1.0] noninelisina (BCN) y la transcicloocteno-lisina (TCO; que se muestra en la Figura 1), que pueden codificarse genéticamente utilizando una variante del par ARNt / sintetasa (aquí denominado ARNt Pyl / PylRS AF), dondePyl representa pirrolisina, y AF representa un doble mutante diseñado racionalmente (Y306A, Y384F) derivado de Methanosarcina mazei que codifica naturalmente pirrolisina12, 29,30,31. A través de la reacción de cicloadición de Diels-Alder (SPIEDAC) de demanda inversa de electrones promovida por cepa, estos aminoácidos reaccionan quimioselectivamente con conjugados de tetrazina (Figura 1)12,30,31. Tales reacciones de cicloadición son excepcionalmente rápidas y compatibles con las células vivas; También pueden ser fluorogénicos, si un fluoróforo apropiado se funcionaliza con la fracción tetrazina12,26,32. Este documento presenta un protocolo optimizado para monitorear la dinámica de los efectores bacterianos administrados en las células huésped utilizando GCE, seguido de la localización subcelular de proteínas secretadas en células HeLa utilizando dSTORM. Los resultados indican que la incorporación de un ncAA a través de GCE, seguida de una reacción de clic con colorantes fluorogénicos portadores de tetrazina, representa un método versátil para el marcado selectivo, la visualización de proteínas secretadas y la posterior localización subcelular en el huésped. Sin embargo, todos los componentes y procedimientos detallados aquí pueden ajustarse o sustituirse para que el sistema de GCE pueda adaptarse para investigar otras cuestiones biológicas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine SDS running buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A661-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulphate</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP212R-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>ThermiFischer Scientific</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Agar</td>
			<td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDP-FL-tetrazine</td>
			<td>Lumiprobe (USA)</td>
			<td>2.14E+02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>444203</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en &#8211; L - Lysine (TCO*A)</td>
			<td>SiChem GmbH</td>
			<td>SC-8008</td>
			<td>Size: 500 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (Hoechst33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeNovix DS-11+ Spectrophotometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM*</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>* Used for maintaining HeLa Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM**</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>**Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain BL21 (DE3)</td>
			<td>Novagen (Madison, WI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 897-BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>30123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>97203</td>
			<td>Pack of 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7141-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BF229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-C1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocloric acid</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image processing and analysis:&#160; http://rsbweb.nih.gov/ij</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>Coomassie-based stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janelia Fluoro 646-tetrazine</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;Manager (v. 1.4.2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pulser cuvette</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2086</td>
			<td>0.2 cm electrode gap, pkg. of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon N-STORM</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks</td>
			<td>ThermiFischer Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnipur Casamino Acid</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>2240</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehhyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (100x)</td>
			<td>GenDEPOT&#160;</td>
			<td>CA005-010</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL-PylRS-AF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For plasmid construction and map see following references 
			1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 
			2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Mini-prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: elife. 2021, 10, e67789.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pWSK29-sseJ-HA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: elife. 2021, 10, e67789.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>540025</td>
			<td>Protein grade, 10% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sulphate</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>424220250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>539131</td>
			<td>100x Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-HA primary antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. enterica. serovar Typhimurium 14028s</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036-50G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM), 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-C1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator Model 100</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>24932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system)</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThunderSTORM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://zitmen.github.io/thunderstorm/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (1x), 0.25%&#160;&#160;</td>
			<td>GenDEPOT&#160;</td>
			<td>CA014-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-well tissue culture chamber slides</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>94.6190.802</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of bacterial secreted proteins using genetic code expansion

Los sistemas de secreción de tipo tres (T3SS) permiten a las bacterias gramnegativas inyectar una batería de proteínas efectoras directamente en el citosol de las células huésped eucariotas. Al ingresar, las proteínas efectoras inyectadas modulan cooperativamente las vías de señalización eucariotas y reprograman las funciones celulares, lo que permite la entrada y supervivencia bacteriana. El monitoreo y la localización de estas proteínas efectoras secretadas en el contexto de las infecciones proporciona una huella para definir la interfaz dinámica de las interacciones huésped-patógeno. Sin embargo, etiquetar e imaginar proteínas bacterianas en células huésped sin interrumpir su estructura / función es técnicamente desafiante. 
La construcción de proteínas de fusión fluorescentes no resuelve este problema, porque las proteínas de fusión atascan el aparato secretor y, por lo tanto, no se secretan. Para superar estos obstáculos, recientemente empleamos un método para el marcado fluorescente específico del sitio de efectores secretados por bacterias, así como otras proteínas difíciles de etiquetar, utilizando la expansión del código genético (GCE). Este documento proporciona un protocolo completo paso a paso para etiquetar efectores secretados por Salmonella utilizando el sitio GCE específicamente, seguido de instrucciones para obtener imágenes de la localización subcelular de proteínas secretadas en células HeLa utilizando microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM) 
Hallazgos recientes sugieren que la incorporación de aminoácidos no canónicos (ncAAs) a través de GCE, seguida de un marcado bio-ortogonal con colorantes que contienen tetrazina, es una técnica viable para el marcado selectivo y la visualización de proteínas secretadas bacterianas y el posterior análisis de imágenes en el huésped. El objetivo de este artículo es proporcionar un protocolo sencillo y claro que pueda ser empleado por investigadores interesados en realizar imágenes de súper resolución utilizando GCE para estudiar diversos procesos biológicos en bacterias y virus, así como las interacciones huésped-patógeno.

Este documento de protocolo describe un método basado en GCE para el etiquetado fluorescente específico del sitio y la visualización de efectores secretados por Salmonella , como se muestra en la Figura 1. La estructura química del grupo bioortogonal transcicloocteno (TCO) que contiene ncAA y el colorante fluorescente se muestran en la Figura 1A. El marcado de SseJ se logró mediante la incorporación genética de nc...

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Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion

Este artículo proporciona un protocolo sencillo y claro para etiquetar los efectores secretados por Salmonella utilizando el sitio específico de expansión del código genético (GCE) e imágenes de la localización subcelular de proteínas secretadas en células HeLa utilizando microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM)

Imágenes de superresolución de proteínas secretadas por bacterias mediante la expansión del código genético

Type three secretion systems (T3SSs) enable gram-negative bacteria to inject a battery of effector proteins directly into the cytosol of eukaryotic host ...

La expansión del código genético, o GCE, supera las limitaciones de otras estrategias de etiquetado. Nos permite ubicar proteínas específicamente etiquetadas, y tenemos fluoróforos orgánicos brillantes que permiten su visualización, por lo que podemos evitar estrategias que hacen, por ejemplo, fusiones de proteínas fluorescentes, que pueden interrumpir la función de las proteínas. Este método se puede aplicar a cualquier otro sistema.Por ejemplo, lo hemos utilizado para etiquetar la proteína CO del Zika, y eso nos permite proporcionar y producir el virus del Zika etiquetado que luego podemos observar infectando las células huésped. Para comenzar, transfiera 100 microlitros de cultivo primario a cinco mililitros de medio LB que contenga 35 microgramos por mililitro de cloranfenicol y 100 microgramos por mililitro de ampicilina. Incubar a 37 grados centígrados con agitación a 250 RPM hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance 0,6.Reemplace el medio LB con el medio N-mínimo modificado suplementado con un TCO milimolar, un aminoácido no canónico. Y cultive las bacterias a 34 grados centígrados durante 30 minutos. Agregue 0.2% de arabinosa, 25 miligramos por mililitro de cloranfenicol y 100 miligramos por mililitro de ampicilina, y haga crecer las células durante otras seis horas, agitando a 250 RPM.Después de seis horas, lave las bacterias cuatro veces en un intervalo de 30 minutos con medios frescos de MgM sin aminoácidos no canónicos o ncAA. Centrifugar las bacterias, volver a suspenderlas en tampón PBS e incubar durante una hora a cuatro grados centígrados en la oscuridad para eliminar el exceso de ncAA. Después de una hora, centrifugar las bacterias a 3, 000 G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados, y almacenarlas para su uso posterior.Para un experimento de control, repita el mismo experimento expresando proteínas portadoras de ncAA en ausencia de ncAA. Resuspender las células de salmonela que expresan SseJ incorporadas con TCO en ausencia o presencia de TCO en PBS. Ajustar la densidad óptica de 600 nanómetros a cuatro en PBS, e incubar las células con 20 tetracenos micromolares Janelia Fluor 646 o 20 micromolares BDPFL tetrazina a 37 grados Celsius en la oscuridad, y agitar durante una o dos horas a 250 RPM.Granular las células y lavar de tres a cuatro veces con PBS que contiene 5% DMSO y 0,2% Pluronic F-127. Vuelva a suspender el pellet en PBS que contenga 5% de DMSO. Después de incubar durante la noche a cuatro grados centígrados en la oscuridad, lavar dos veces más con PBS.Obtener imágenes de las células inmediatamente usando un microscopio confocal, o fijarlas con paraformaldehído al 1,5% en PBS durante 30 a 45 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Cultivar y mantener las células HeLa a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 95% de humedad en DMEM de alta glucosa suplementado con 10% FBS además de estreptomicina penicilina. Cultive bacterias un día antes de la infección e inocule una sola colonia de salmonela de tipo salvaje que alberga plásmido pEVOL que contiene par ortogonal de ARNt sintetasa y plásmido pWSK29 que contiene el gen SseJ en cinco milímetros de caldo LB estándar que contiene antibiótico durante la noche a 37 grados centígrados con agitación a 250 RPM.Reparar un stock celular diluido a 100, 000 células por mililitro y sembrar 50, 000 células HeLA por pocillo en 500 microlitros de DMEM que contiene 10% de medio de crecimiento FBS en un portaobjetos de cámara de ocho pocillos. Mantenga el portaobjetos de la cámara en una incubadora durante 24 horas a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 95% de humedad. Para la infección bacteriana, subcultive salmonela de tipo salvaje que alberga plásmido pEVOL y plásmido pWSK29 que contiene el gen SseJ diluyendo 100 microlitros de cultivo bacteriano durante la noche en tres mililitros de medio LB que contiene 35 microgramos por mililitro cloranfenicol y 100 microgramos por mililitro de ampicilina.Incubar a 37 grados centígrados con agitación a 250 RPM durante cinco a siete horas. Para iniciar la infección de células HeLa, después de sacar las células HeLa de la incubadora, lave las células con DPBS precalentado y agregue 500 microlitros de DMEM fresco que contiene 10% FBS a cada pocillo. Coloque la cámara deslizante de nuevo en la incubadora de dióxido de carbono hasta que comience la infección.Después de cinco a siete horas de incubación, diluya el cultivo de salmonela para que la densidad óptica a 600 nanómetros sea de 0.2 en un mililitro de medio de crecimiento DMEM, y agregue las cantidades requeridas del inóculo de salmonela a cada pocillo del portaobjetos de la cámara, de modo que la multiplicidad de infección sea 100. Después de incubar las células infectadas en una incubadora de dióxido de carbono durante 30 minutos, lave las células tres veces con DPBS precalentado para eliminar la salmonela extracelular. Establezca este punto de tiempo en cero horas después de la infección y agregue 500 microlitros de medio completo que contenga 100 microgramos por mililitro de gentamicina durante una hora.Después de la incubación, nuevamente, lave las células tres veces con DPBS como se mostró anteriormente y agregue 500 microlitros del medio completo suplementado con 0.2% de arabinosa, 10 microgramos por mililitro de gentamicina a cada pocillo del portaobjetos de la cámara. En un experimento de control, realizar infecciones similares de células HeLa sin TCO. Después de incubar el portaobjetos de la cámara durante 10 horas en la incubadora de dióxido de carbono, reemplace el medio completo con medio completo fresco sin TCO y lave las células HeLa cuatro veces durante un intervalo de 30 minutos cada una con DPBS precalentado.Luego lave las células con un medio fresco completo sin TCO. Después de 12 horas después de la infección, aspire el medio de las células y lave la celda con DPBS precalentado dos o tres veces. En un grupo de pocillos, agregue 500 microlitros de la mezcla de solución de colorante uno, y en otro grupo de los pocillos de la misma cámara portaobjetos, agregue 500 microlitros de la mezcla de solución de colorante dos.Coloque la cámara deslizándose de nuevo en la incubadora de dióxido de carbono durante una y 1/2 a dos horas. Después de 13.5 a 14 horas después de la infección, enjuague las células HeLa dos veces con DPBS precalentado y agregue 500 microlitros de DMEM fresco suplementado con FBS. Después de incubar durante 30 minutos, lave las células nuevamente con DPBS precalentado como se mostró anteriormente, y luego lave con DMEM fresco cuatro veces durante un intervalo de 30 minutos.A las 16 horas después de la infección, fijar las células HeLa con paraformaldehído añadiendo 200 microlitros de paraformaldehído al 4% a cada pocillo e incubando durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Aspirar fuera del paraformaldehído. Enjuague tres veces con PBS y guarde las células en PBS a cuatro grados centígrados en la oscuridad.Lleve las células al microscopio y coloque la cámara de imágenes en la etapa del microscopio en el soporte de la muestra. Luego cambie el medio en el pozo con 0.4 mililitros del tampón de imágenes GLOX BME recién hecho. Disminuya la potencia del láser a alrededor de un milivatio para identificar una célula HeLa de interés y ajuste el plano focal y el ángulo del rayo láser mientras ilumina la muestra con densidades láser bajas de 647 nanómetros.Ajuste el ángulo de iluminación HILO. Capture una referencia a la imagen limitada de fracción de la estructura objetivo y cambie los fluoróforos al estado oscuro girando el láser a su máxima potencia. Ajuste la ganancia del preamplificador a tres y active la transferencia de trama.A continuación, establezca la ganancia EM en 200 para una mayor sensibilidad en las mediciones de dSTORM. Ajuste la fuerza del láser a un nivel adecuado donde los eventos de parpadeo estén separados en el espacio y el tiempo. Establezca el tiempo de exposición en 30 milisegundos y comience la adquisición.Adquirir 10, 000 a 30, 000 marcos. Repita la adquisición similar con diferentes ROI. Para la reconstrucción de imágenes de dSTORM, abra la imagen J e importe los datos sin procesar.Abra el complemento Thunderstorm y configure la configuración de la cámara correspondiente al dispositivo. Vaya a ejecutar el análisis y establezca la configuración adecuada, como el filtrado de imágenes, los métodos de localización y la localización de subpíxeles de las moléculas. Haga clic en Aceptar para iniciar la reconstrucción de la imagen y comenzar el análisis de resultados finales posteriores al procesamiento.Las salmonelas que expresan SseJ incorporadas con TCO se tratan con tetrazina Janelia Fluor 646 y se visualizan con fluorescencia Janelia Fluor 646 en ausencia o presencia de TCO. La fluorescencia de SseJ se detecta solo cuando el TCO está presente. Las células HeLa están infectadas con salmonela que alberga psseJ-HA durante 16 horas, fijadas e inmunoteñidas con anticuerpos anti HA, LPS y DAPI.Como era de esperar, los filamentos inducidos por salmonela dependientes de SseJ, o SIF, se forman en las células infectadas. En ausencia de TCO, el codón ámbar no se suprime, y los SIF dependientes de SseJ están ausentes en las células HeLa infectadas. Los SIF dependientes de SseJ se observan en presencia de TCO, lo que indica claramente que SseJ fue rescatado por la expresión de SseJF10TCOHA utilizando la expansión del código genético, o GCE.Aquí se muestra la especificidad del etiquetado de SseJF10TCOHA secretada en células HeLa a través de reacciones de clic SPIEDAC utilizando dos mezclas de colorantes alternativas, una y dos mezclas de colorantes. El colorante de clic Janelia Fluor 646 TZ se utilizó además para observar si había algún etiquetado de fondo en las células HeLa infectadas con Salmanella de tipo salvaje portadoras de SseJ HA en presencia de plásmido de bóveda TCO y P. SseJ se liberó en el citoplasma de la célula huésped sin señales fluorescentes intracelulares o no específicas, lo que demuestra que la señal fluorescente era específica de SseJ.En esta figura se presentan imágenes de súper resolución de GCE etiquetadas con SseJ en células HeLa. Aquí se muestra una imagen de campo claro de una célula HeLa bajo observación. Aquí se presenta la imagen de campo amplio limitada por difracción de SseJ secretada etiquetada con TCO y Janelia Fluor 646 y la imagen dSTORM correspondiente de los SIF decorados con SseJ.El inserto muestra una vista ampliada de un SseJ súper resuelto en la región en caja. Las soluciones de stock de la NCAA se prepararon en NaOH. No olvide neutralizarlo antes o después de la adición a los medios.Después de etiquetar la proteína de interés, lave la celda extensamente, de modo que la señal de fondo sea mínima. Siguiendo nuestro procedimiento de GCE, ahora, podemos etiquetar cualquier factor de virulencia en bacterias y seguir su actividad utilizando nuestras técnicas de imagen.

Research

JoVE Journal

Biology

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Investigación

Biología

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