Name: super-resolution imaging of bacterial secreted proteins using genetic code expansion
Uploaded: 2023-02-10T13:23:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion at JoVE.com

Detta arbete stöddes av startfonder från University of Texas Medical branch, Galveston, TX och ett Texas STAR-pris till JK. Vi tackar professor Edward Lemke (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Tyskland) för plasmiden pEVOL-PylRS-AF. Bilderna i figur 1 skapades med BioRender.

1. Plasmidkonstruktion
<ol><li>Klona genen som uttrycker POI till en expressionsplasmid (t.ex. pET28a-sseJ 10TAG) som uttrycker POI i E. coli BL21 (DE3). Detta steg underlättar för att bestämma att mutanterna är funktionella.</li>
	<li>För visualisering av Salmonella-utsöndrade effektorer i värdceller, konstruera en expressionsplasmid (pWSK29-sseJ-HA) som uttrycker mål-POI SseJ under kontroll av dess ursprungliga promotor, som beskrivits i tidigare rapporter<...

<ol>
	<li>Marlovits, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+assembly+of+the+type+III+secretion+needle+complex.">Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex.</a> Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).</li><li>Kubori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+structure+of+the+Salmonella+typhimurium+type+III+protein+secretion+system.">Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system.</a> Science. 280 (5363), 602-605 (1998).</li><li>LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonellae+interactions+with+host+processes.">Salmonellae interactions with host processes.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).</li><li>Galan, J. E., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-injection+machines+in+bacteria.">Protein-injection machines in bacteria.</a> Cell. 172 (6), 1306-1318 (2018).</li><li>Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+by+phospho-OmpR+of+ssrA/B+gene+expression+in+Salmonella+pathogenicity+island+2.">Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2.</a> Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).</li><li>Walthers, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+response+regulator+SsrB+relieves+H-NS+silencing+by+displacing+H-NS+bound+in+polymerization+mode+and+directly+activates+transcription.">Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).</li><li>Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+DNA+biosensor+tracks+OmpR-dependent+acidification+of+Salmonella+during+macrophage+infection.">A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection.</a> PLoS Biology. 13 (4), e1002116 (2015).</li><li>Liew, A. T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell,+super-resolution+imaging+reveals+an+acid+pH-dependent+conformational+switch+in+SsrB+regulates+SPI-2.">Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2.</a> eLife. 8, e45311 (2019).</li><li>Knuff, K., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+the+SIF+is+happening-the+role+of+intracellular+Salmonella-induced+filaments.">What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335 (2017).</li><li>Drecktrah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+behavior+of+Salmonella-induced+membrane+tubules+in+epithelial+cells.">Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells.</a> Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).</li><li>Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+induces+the+formation+of+filamentous+structures+containing+lysosomal+membrane+glycoproteins+in+epithelial+cells.">Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).</li><li>Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+code+expansion+enables+visualization+of+Salmonella+type+three+secretion+system+components+and+secreted+effectors.">Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors.</a> elife. 10, e67789 (2021).</li><li>Singh, M. K., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+bacterial+pathogens+and+visualization+of+their+secreted+effectors.">Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors.</a> FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050 (2020).</li><li>Akeda, Y., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+release+and+unfolding+of+substrates+in+type+III+secretion.">Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion.</a> Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).</li><li>Su, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+as+tools+to+aid+protein+production.">Fluorescent proteins as tools to aid protein production.</a> Microbial Cell Factories. 4 (1), 12 (2005).</li><li>Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+development+of+photoactivatable+fluorescent+proteins+for+single-molecule-based+superresolution+imaging.">Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).</li><li>Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+specific+mislocalization+of+red+fluorescent+proteins+in+live+Escherichia+coli.">Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).</li><li>Gahlmann, A., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+bacterial+cell+biology+with+single-molecule+tracking+and+super-resolution+imaging.">Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging.</a> Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).</li><li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).</li><li>Gautier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+protein+tag+for+multiprotein+labeling+in+living+cells.">An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells.</a> Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).</li><li>Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+fluorescence+complementation+platform+for+visualizing+Salmonella+effector+proteins+reveals+distinctly+different+intracellular+niches+in+different+cell+types.">Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types.</a> ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).</li><li>Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell-based+optimization+of+the+biarsenical-binding+tetracysteine+motif+for+improved+fluorescence+and+affinity.">Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity.</a> Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li><li>Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pearling+transition+provides+evidence+of+force-driven+endosomal+tubulation+during+Salmonella+infection.">The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection.</a> mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).</li><li>Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SifA,+a+type+III+secreted+effector+of+Salmonella+typhimurium,+directs+Salmonella-induced+filament+(Sif)+formation+along+microtubules.">SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules.</a> Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).</li><li>Lang, K., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+incorporation+of+unnatural+amino+acids+and+bioorthogonal+labeling+of+proteins.">Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins.</a> Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).</li><li>Davis, L., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+proteins:+applications+of+genetic+code+expansion+in+cell+biology.">Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).</li><li>Chin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+p-azido-L-phenylalanine+to+the+genetic+code+of+Escherichia+coli.">Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).</li><li>Kipper, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+noncanonical+amino+acids+for+protein+labeling+in+a+genomically+recoded+Escherichia+coli.">Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).</li><li>Uttamapinant, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+code+expansion+enables+live-cell+and+super-resolution+imaging+of+site-specifically+labeled+cellular+proteins.">Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins.</a> Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).</li><li>Plass, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+for+Diels-Alder+reactions+in+living+cells.">Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).</li><li>Lang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+encoding+of+bicyclononynes+and+trans-cyclooctenes+for+site-specific+protein+labeling+in+vitro+and+in+live+mammalian+cells+via+rapid+fluorogenic+Diels-Alder+reactions.">Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-exploration+of+the+codon+context+effect+on+amber+codon-guided+incorporation+of+noncanonical+amino+acids+in+Escherichia+coli+by+the+blue-white+screening+assay.">Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay.</a> ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).</li><li>Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+tabulated+from+the+international+DNA+sequence+databases:+status+for+the+year+2000.">Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 292 (2000).</li><li>Spahn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+super-resolution+imaging+of+bacterial+regulatory+proteins:+the+nucleoid+and+the+cell+membrane+in+single,+fixed+E.+coli+cells.">Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).</li><li>Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy.">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li><li>Xu, J., Ma, H., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy+(STORM).">Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM).</a> Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).</li><li>Meineke, B., Heimg&#228;rtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Els&#228;sser, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+incorporation+of+two+ncAAs+for+two-color+bioorthogonal+labeling+and+crosslinking+of+proteins+on+live+mammalian+cells.">Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells.</a> Cell Reports. 31 (12), 107811 (2020).</li><li>Bessa-Neto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+labeling+of+transmembrane+proteins+with+non-canonical+amino+acids+unveils+masked+epitopes+in+live+neurons.">Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons.</a> Nature Communications. 12 (1), 6715 (2021).</li><li>Beliu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+labeling+with+tetrazine-dyes+for+super-resolution+microscopy.">Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy.</a> Communication Biology. 2, 261 (2019).</li><li>Arsi&#263;, A., Hagemann, C., Stajkovi&#263;, N., Schubert, T., Niki&#263;-Spiegel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+genetically+encoded+tags+for+fluorescent+protein+labeling+in+living+neurons.">Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons.</a> Nature Communications. 13 (1), 314 (2022).</li></ol>

Tillvägagångssättet som beskrivs här användes för att spåra den exakta platsen för effektorproteiner som injicerades i värdcellen av bakteriella T3SS efter infektion. T3SS används av intracellulära patogener såsom Salmonella, Shigella och Yersinia för att transportera virulenskomponenter in i värden. Utvecklingen av superupplösningsbildteknik har gjort det möjligt att visualisera virulensfaktorer med en tidigare ofattbar upplösning12,13,24<sup...

Bakteriella infektioner har länge betraktats som en allvarlig fara för människors hälsa. Patogener använder högt utvecklade, extremt kraftfulla och invecklade försvarssystem, liksom en mängd olika bakteriella virulensfaktorer (kallade effektorproteiner) för att undvika värdimmunsvar och etablera infektioner 1,2. De molekylära mekanismerna bakom dessa system och rollen för enskilda effektorproteiner är dock fortfarande till stor del okända på grund av bristen på lämpliga metoder för att direkt följa de avgörande proteinkomponenterna och effektorerna i värdceller under patogenes.
Ett typiskt exempel är Salmonella enterica serovar Typhimurium, som orsakar akut gastroenterit. Salmonella Typhimurium använder typ tre sekretionssystem (T3SS) för att injicera en mängd olika effektorproteiner direkt i värdceller. Så snart Salmonella kommer in i värdcellen finns den i ett surt membranbundet fack, kallat Salmonella-innehållande vakuol (SCV)3,4. SCV: s sura pH aktiverar Salmonella pathogenicity island 2 (SPI-2)-kodad T3SS och translokerar en volley av 20 eller fler effektorproteiner över det vakuolära membranet till värdcytosolen 5,6,7,8. Inuti värden manipulerar dessa komplexa cocktails av effektorproteiner koordinerat värdcellens signalvägar, vilket resulterar i bildandet av mycket dynamiska, komplexa rörformiga membranstrukturer utsträckta från SCV längs mikrotubuli, benämnda Salmonella-inducerade filament (SIF), som gör det möjligt för Salmonella att överleva och replikera inom värdcellerna9,10,11.
Metoder för att visualisera, spåra och övervaka lokaliseringar av bakteriella effektorer och undersöka deras handel och interaktioner inuti värdceller ger kritisk inblick i mekanismerna som ligger till grund för bakteriell patogenes. Märkning och lokalisering av Salmonella-utsöndrade T3SS-effektorproteiner inuti värdceller har visat sig vara en teknisk utmaning12,13; Ändå har utvecklingen av genetiskt kodade fluorescerande proteiner förändrat vår förmåga att studera och visualisera proteiner inom levande system. Storleken på fluorescerande proteiner (~ 25-30 kDa)15 är emellertid ofta jämförbar med eller till och med större än den för proteinet av intresse (POI; t.ex. 13,65 kDa för SsaP, 37,4 kDa för SifA). Faktum är att fluorescerande proteinmärkning av effektorer ofta blockerar utsöndringen av den märkta effektorn och fastnar T3SS14.
Dessutom är fluorescerande proteiner mindre stabila och avger ett lågt antal fotoner före fotoblekning, vilket begränsar deras användning i superupplösningsmikroskopiska tekniker16,17,18, särskilt i fotoaktiveringslokaliseringsmikroskopi (PALM), STORM och stimulerad emissionsutarmning (STED) mikroskopi. Medan de fotofysiska egenskaperna hos organiska fluorescerande färgämnen är överlägsna de hos fluorescerande proteiner, kräver metoder/tekniker som CLIP/SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH/FlAsH 22,23 och HA-Tags 24,25 ytterligare ett protein- eller peptidbihang som kan försämra strukturfunktionen hos effektorproteinet av intresse genom att störa posttranslationell modifiering eller handel. En alternativ metod som minimerar nödvändig proteinmodifiering innefattar införlivande av ncAA i en POI under översättning genom GCE. NCAAs är antingen fluorescerande eller kan göras fluorescerande via klickkemi 12,13,26,27,28.
Med hjälp av GCE kan ncAA med små, funktionella, bioortogonala grupper (såsom en azid-, cyklopropen- eller cyklooktyngrupp) introduceras på nästan vilken plats som helst i ett målprotein. I denna strategi byts ett naturligt kodon ut mot ett sällsynt kodon, såsom ett bärnsten (TAG) stoppkodon vid en angiven position i POI-genen. Det modifierade proteinet uttrycks därefter i celler tillsammans med ett ortogonalt aminoacyl-tRNA-syntetas/tRNA-par. Det aktiva stället för tRNA-syntetas är utformat för att endast ta emot en viss ncAA, som sedan är kovalent fäst vid 3'-änden av tRNA som känner igen bärnstenskodonet. NCAA införs helt enkelt i tillväxtmediet, men det måste tas upp av cellen och nå cytosolen där aminoacyl-tRNA-syntetas (aaRS) kan länka det till det ortogonala tRNA; Den införlivas sedan i intressepunkten på den angivna platsen (se figur 1)12. Således möjliggör GCE platsspecifik införlivande av en uppsjö av bio-ortogonala reaktiva grupper såsom keton, azid, alkyn, cyklooktyn, transcyklookten, tetrazin, norbonen, α, β-omättad amid och bicyklo [6.1.0]-nonyn i en POI, vilket potentiellt kan övervinna begränsningarna för konventionella proteinmärkningsmetoder 12,26,27,28.
De senaste framväxande trenderna inom superupplösningsavbildningstekniker har öppnat nya vägar för att undersöka biologiska strukturer på molekylär nivå. I synnerhet har STORM, en enmolekylär, lokaliseringsbaserad, superupplösningsteknik, blivit ett ovärderligt verktyg för att visualisera cellulära strukturer ner till ~ 20-30 nm och kan undersöka biologiska processer en molekyl i taget och därigenom upptäcka rollerna för intracellulära molekyler som ännu är okända i traditionella ensemble-genomsnittliga studier13 . Enmolekyl- och superupplösningstekniker kräver en liten tagg med ljusa, fotostabila organiska fluoroforer för bästa upplösning. Vi visade nyligen att GCE kan användas för att införliva lämpliga prober för superupplösningsavbildning12.
Två av de bästa valen för proteinmärkning i celler är bicyklisk [6.1.0] nonynelysin (BCN) och transcyklookten-lysin (TCO; visas i figur 1), som kan kodas genetiskt med hjälp av en variant av tRNA / syntetasparet (här benämnt tRNA Pyl / PylRS AF), därPyl representerar pyrrolysin, ochAF representerar en rationellt utformad dubbelmutant (Y306A, Y384F) härledd från Methanosarcina mazei som naturligt kodar för pyrrolysin12, 29,30,31. Genom den stamfrämjade inversa elektronbehovsreaktionen Diels-Alder cycloaddition (SPIEDAC) reagerar dessa aminosyror kemoselektivt med tetrazinkonjugat (figur 1) 12,30,31. Sådana cykloadditionsreaktioner är exceptionellt snabba och kompatibla med levande celler; De kan också vara fluorogena om en lämplig fluorofor funktionaliseras med tetrazindelen12,26,32. Detta dokument presenterar ett optimerat protokoll för övervakning av dynamiken hos bakteriella effektorer som levereras till värdceller med GCE, följt av subcellulär lokalisering av utsöndrade proteiner i HeLa-celler med dSTORM. Resultaten indikerar att inkorporering av en ncAA via GCE, följt av en klickreaktion med fluorogena tetrazinbärande färgämnen, representerar en mångsidig metod för selektiv märkning, visualisering av utsöndrade proteiner och efterföljande subcellulär lokalisering i värden. Alla komponenter och procedurer som beskrivs här kan dock justeras eller ersättas så att GCE-systemet kan anpassas för att undersöka andra biologiska frågor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine SDS running buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A661-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulphate</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP212R-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>ThermiFischer Scientific</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Agar</td>
			<td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDP-FL-tetrazine</td>
			<td>Lumiprobe (USA)</td>
			<td>2.14E+02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>444203</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en &#8211; L - Lysine (TCO*A)</td>
			<td>SiChem GmbH</td>
			<td>SC-8008</td>
			<td>Size: 500 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (Hoechst33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeNovix DS-11+ Spectrophotometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM*</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>* Used for maintaining HeLa Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM**</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>**Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain BL21 (DE3)</td>
			<td>Novagen (Madison, WI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 897-BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>30123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>97203</td>
			<td>Pack of 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7141-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BF229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-C1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocloric acid</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image processing and analysis:&#160; http://rsbweb.nih.gov/ij</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>Coomassie-based stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janelia Fluoro 646-tetrazine</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;Manager (v. 1.4.2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pulser cuvette</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2086</td>
			<td>0.2 cm electrode gap, pkg. of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon N-STORM</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks</td>
			<td>ThermiFischer Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnipur Casamino Acid</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>2240</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehhyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (100x)</td>
			<td>GenDEPOT&#160;</td>
			<td>CA005-010</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL-PylRS-AF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For plasmid construction and map see following references 
			1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 
			2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Mini-prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: elife. 2021, 10, e67789.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pWSK29-sseJ-HA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: elife. 2021, 10, e67789.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>540025</td>
			<td>Protein grade, 10% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sulphate</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>424220250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>539131</td>
			<td>100x Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-HA primary antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. enterica. serovar Typhimurium 14028s</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036-50G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM), 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-C1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator Model 100</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>24932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system)</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThunderSTORM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://zitmen.github.io/thunderstorm/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (1x), 0.25%&#160;&#160;</td>
			<td>GenDEPOT&#160;</td>
			<td>CA014-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-well tissue culture chamber slides</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>94.6190.802</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of bacterial secreted proteins using genetic code expansion

Typ tre sekretionssystem (T3SS) gör det möjligt för gramnegativa bakterier att injicera ett batteri av effektorproteiner direkt i cytosolen hos eukaryota värdceller. Vid inträde modulerar de injicerade effektorproteinerna tillsammans eukaryota signalvägar och omprogrammerar cellulära funktioner, vilket möjliggör bakterieinträde och överlevnad. Övervakning och lokalisering av dessa utsöndrade effektorproteiner i samband med infektioner ger ett fotavtryck för att definiera det dynamiska gränssnittet för värd-patogeninteraktioner. Att märka och avbilda bakterieproteiner i värdceller utan att störa deras struktur / funktion är dock tekniskt utmanande. 
Att konstruera fluorescerande fusionsproteiner löser inte detta problem, eftersom fusionsproteinerna fastnar i sekretionsapparaten och därmed inte utsöndras. För att övervinna dessa hinder använde vi nyligen en metod för platsspecifik fluorescerande märkning av bakteriella utsöndrade effektorer, liksom andra svårmärkta proteiner, med hjälp av genetisk kodexpansion (GCE). Detta dokument ger ett komplett steg-för-steg-protokoll för att märka Salmonella-utsöndrade effektorer med GCE-platsspecifikt, följt av anvisningar för avbildning av den subcellulära lokaliseringen av utsöndrade proteiner i HeLa-celler med hjälp av direkt stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM)
Nya fynd tyder på att införlivandet av icke-kanoniska aminosyror (ncAA) via GCE, följt av bio-ortogonal märkning med tetrazininnehållande färgämnen, är en livskraftig teknik för selektiv märkning och visualisering av bakteriella utsöndrade proteiner och efterföljande bildanalys i värden. Målet med denna artikel är att tillhandahålla ett enkelt och tydligt protokoll som kan användas av utredare som är intresserade av att genomföra superupplösningsavbildning med GCE för att studera olika biologiska processer i bakterier och virus samt värd-patogeninteraktioner.

Detta protokollpapper beskriver en GCE-baserad metod för platsspecifik fluorescerande märkning och visualisering av Salmonella-utsöndrade effektorer, som visas i figur 1. Den kemiska strukturen hos ncAA-bärande transcyklookten bioortogonal grupp (TCO) och det fluorescerande färgämnet visas i figur 1A. SseJ-märkning uppnåddes genom genetisk inkorporering av bioortogonala ncAAs vid ett bärnstensstoppkodon (se <str...

Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion at JoVE.com

Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion

Denna artikel ger ett enkelt och tydligt protokoll för att märka Salmonella-utsöndrade effektorer med hjälp av genetisk kodutvidgning (GCE) platsspecifikt och avbilda den subcellulära lokaliseringen av utsöndrade proteiner i HeLa-celler med hjälp av direkt stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM)

Superupplösningsavbildning av bakteriella utsöndrade proteiner med hjälp av genetisk kodexpansion

Type three secretion systems (T3SSs) enable gram-negative bacteria to inject a battery of effector proteins directly into the cytosol of eukaryotic host ...

Genetisk kodutvidgning, eller GCE, övervinner begränsningar av andra märkningsstrategier. Det gör det möjligt för oss att placera specifikt märkta proteiner, och vi har ljusa organiska fluoroforer som möjliggör deras visualisering, så att vi kan undvika strategier som gör till exempel fluorescerande proteinfusioner, vilket kan störa proteinfunktionen. Denna metod kan tillämpas på något annat system.Till exempel har vi använt det för att märka Zika CO-protein, och det gör det möjligt för oss att tillhandahålla och producera märkt Zika-virus som vi sedan kan observera infekterande värdceller. Börja med att överföra 100 mikroliter primärkultur till fem milliliter LB-medium innehållande 35 mikrogram per milliliter kloramfenikol och 100 mikrogram per milliliter ampicillin. Inkubera vid 37 grader Celsius med skakning vid 250 rpm tills den optiska densiteten vid 600 nanometer når 0,6.Byt ut LB-mediet med det modifierade N-minimala mediet kompletterat med en millimolär TCO, en icke-kanonisk aminosyra. Och odla bakterierna vid 34 grader Celsius i 30 minuter. Tillsätt 0,2% arabinos, 25 milligram per milliliter kloramfenikol och 100 milligram per milliliter ampicillin och odla cellerna i ytterligare sex timmar, skaka vid 250 varv / min.Efter sex timmar, tvätta bakterierna fyra gånger under ett intervall på 30 minuter med färskt MgM-media utan icke-kanoniska aminosyror eller, ncAA. Centrifugera bakterierna, återsuspendera i PBS-buffert och inkubera i en timme vid fyra grader Celsius i mörkret för att avlägsna överskott av ncAA. Efter en timme centrifugerar bakterierna vid 3 000 G i 15 minuter vid fyra grader Celsius och lagrar dem för vidare användning.För ett kontrollexperiment, upprepa samma experiment genom att uttrycka ncAA-bärande proteiner i frånvaro av ncAA. Återsuspendera salmonellaceller som uttrycker SseJ som ingår i TCO i frånvaro eller närvaro av TCO i PBS. Justera den optiska densiteten vid 600 nanometer till fyra i PBS och inkubera cellerna med 20 mikromolar Janelia Fluor 646 tetrazen eller 20 mikromolar BDPFL-tetrazin vid 37 grader Celsius i mörkret och skaka i en till två timmar vid 250 varv / min.Pellet cellerna och tvätta tre till fyra gånger med PBS innehållande 5% DMSO och 0,2% Pluronic F-127. Återsuspendera pelleten i PBS som innehåller 5% DMSO. Efter inkubation över natten vid fyra grader Celsius i mörkret, tvätta två gånger igen med PBS.Avbilda cellerna omedelbart med ett konfokalmikroskop, eller fixa dem med 1,5% paraformaldehyd i PBS i 30 till 45 minuter vid rumstemperatur i mörkret. Odla och bibehålla HeLa-celler vid 37 grader Celsius, 5% koldioxid och 95% luftfuktighet i hög glukos DMEM kompletterat med 10% FBS förutom penicillinstreptomycin. Odla bakterier en dag före infektion och inokulera en enda koloni av vildtyp salmonella som innehåller pEVOL plasmid innehållande ortogonalt tRNA-syntetaspar och pWSK29 plasmid innehållande SseJ-gen i fem millimeter antibiotika innehållande standard LB-buljong över natten vid 37 grader Celsius med skakning vid 250 rpm.Reparera ett utspätt celllager vid 100 000 celler per milliliter och frö 50 000 HeLA-celler per brunn i 500 mikroliter DMEM innehållande 10% FBS-tillväxtmedium i en åtta brunnskammare. Håll kammarbilden i en inkubator i 24 timmar vid 37 grader Celsius, 5% koldioxid och 95% luftfuktighet. För bakterieinfektionen, subkultur vildtyp salmonella som innehåller pEVOL plasmid och pWSK29 plasmid innehållande SseJ gen genom att späda 100 mikroliter över natten bakteriekultur i tre milliliter LB medium innehållande 35 mikrogram per milliliter kloramfenikol och 100 mikrogram per milliliter ampicillin.Inkubera vid 37 grader Celsius med skakning vid 250 rpm i fem till sju timmar. För att initiera HeLa-cellinfektionen, efter att ha tagit ut HeLa-cellerna från inkubatorn, tvätta cellerna med förvärmd DPBS och tillsätt 500 mikroliter färsk DMEM innehållande 10% FBS till varje brunn. Placera kammaren glida tillbaka i koldioxidinkubatorn tills infektionen börjar.Efter fem till sju timmars inkubation, späd salmonellakulturen så att den optiska densiteten vid 600 nanometer är 0,2 i en milliliter DMEM-tillväxtmedium och tillsätt de erforderliga mängderna av salmonellainokulatet till varje brunn i kammarglaset, så att infektionsmultipliciteten är 100. Efter inkubation av de infekterade cellerna i en koldioxidinkubator i 30 minuter, tvätta cellerna tre gånger med förvärmd DPBS för att avlägsna extracellulär salmonella. Ställ in denna tidpunkt på noll timmar efter infektion och tillsätt 500 mikroliter komplett medium innehållande 100 mikrogram per milliliter gentamicin i en timme.Efter inkubation, tvätta cellerna tre gånger med DPBS som visats tidigare och tillsätt 500 mikroliter av hela mediet kompletterat med 0,2% arabinos, 10 mikrogram per milliliter gentamicin till varje brunn i kammarglaset. I ett kontrollexperiment, utför liknande infektioner av HeLa-celler utan TCO. Efter inkubation av kammarglaset i 10 timmar i koldioxidinkubatorn, ersätt hela mediet med färskt komplett medium utan TCO och tvätta HeLa-cellerna fyra gånger under ett intervall på 30 minuter vardera med förvärmd DPBS.Tvätta sedan cellerna med färskt komplett medium utan TCO. Efter 12 timmar efter infektion, aspirera av mediet från cellerna och tvätta cellen med förvärmd DPBS två eller tre gånger. I en grupp av brunnarna tillsätt 500 mikroliter av färglösningsblandningen en, och i en annan grupp av brunnarna i samma kammarglas tillsätt 500 mikroliter av färglösningsblandningen två.Placera kammaren glider tillbaka in i koldioxidinkubatorn i en och 1/2 till två timmar. Efter 13,5 till 14 timmar efter infektion, skölj HeLa-cellerna två gånger med förvärmd DPBS och tillsätt 500 mikroliter färsk DMEM kompletterad med FBS. Efter inkubation i 30 minuter, tvätta cellerna igen med förvärmd DPBS som visats tidigare och tvätta sedan med färsk DMEM fyra gånger under ett intervall på 30 minuter.Vid 16 timmar efter infektion, fixera HeLa-cellerna med paraformaldehyd genom att tillsätta 200 mikroliter 4% paraformaldehyd till varje brunn och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur i mörkret. Aspirera av paraformaldehyden. Skölj tre gånger med PBS och förvara cellerna i PBS vid fyra grader Celsius i mörkret.Ta cellerna till mikroskopet och placera bildkammaren på mikroskopsteget i provhållaren. Byt sedan mediet i brunnen med 0,4 ml av den nytillverkade GLOX BME-bildbufferten. Minska lasereffekten till cirka en milliwatt för att identifiera en HeLa-cell av intresse och justera fokalplanet och laserstrålvinkeln medan du belyser provet med låga 647 nanometer laserdensiteter.Justera HILO-belysningsvinkeln. Fånga en referens till fraktionsbegränsad bild av målstrukturen och växla fluoroforerna till mörkt tillstånd genom att vrida lasern till sin maximala effekt. Ställ in förförstärkarens förstärkning på tre och aktivera ramöverföringen.Ställ sedan in EM-förstärkningen på 200 för högre känslighet i dSTORM-mätningar. Justera laserstyrkan till en lämplig nivå där blinkande händelser separeras i rum och tid. Ställ in exponeringstiden på 30 millisekunder och påbörja förvärvet.Skaffa 10 000 till 30 000 ramar. Upprepa liknande förvärv med olika avkastningar. För bildrekonstruktion av dSTORM, öppna bild J och importera rådata.Öppna plugin-programmet Thunderstorm och konfigurera kamerainställningen som motsvarar enheten. Gå till kör analys och ange lämpliga inställningar, till exempel bildfiltrering, lokaliseringsmetoder och subpixellokalisering av molekyler. Klicka på OK för att starta bildrekonstruktionen och påbörja efterbearbetningen av slutresultatanalysen.Salmonella som uttrycker SseJ som ingår i TCO behandlas med Janelia Fluor 646 tetrazin och avbildas med Janelia Fluor 646 fluorescens i frånvaro eller närvaro av TCO. Fluorescensen av SseJ detekteras endast när TCO är närvarande. HeLa-celler är infekterade med salmonella som hyser psseJ-HA i 16 timmar, fixerade och immunfärgade med anti HA-antikropp, LPS och DAPI.Som förväntat bildas SseJ-beroende salmonellainducerade filament, eller SIF, i de infekterade cellerna. I frånvaro av TCO undertrycks inte det gula kodonet, och SseJ-beroende SIF saknas i infekterade HeLa-celler. SseJ-beroende SIF observeras i närvaro av TCO, vilket tydligt indikerar att SseJ räddades genom uttrycket av SseJF10TCOHA med hjälp av genetisk kodutvidgning eller GCE.Märkningsspecificitet för utsöndrad SseJF10TCOHA i HeLa-celler genom SPIEDA-klickreaktioner med två alternativa färgämnesblandningar en och färgämnesblandning två visas här. Klickfärgämne Janelia Fluor 646 TZ användes vidare för att observera om det fanns någon bakgrundsmärkning i HeLa-celler infekterade med vildtyp Salmanella som bär SseJ HA i närvaro av TCO och P valvplasmid. SseJ släpptes ut i värdcellens cytoplasma utan några intracellulära eller icke-specifika fluorescerande signaler som visade att den fluorescerande signalen var specifik för SseJ.Superupplösningsavbildning av GCE märkt SseJ i HeLa-celler presenteras i denna figur. En ljusfältsbild av en HeLa-cell under observation visas här. Den diffraktionsbegränsade widefield-bilden av utsöndrad SseJ märkt med TCO och Janelia Fluor 646 och motsvarande dSTORM-bild av SseJ-dekorerade SIF presenteras här.Inlägget visar en förstorad vy av en superupplöst SseJ i det boxade området. NCAA-lagerlösningar bereddes i NaOH. Glöm inte att neutralisera det före eller efter tillsats till media.Efter märkning av protein av intresse, tvätta cellen i stor utsträckning, så att bakgrundssignalen är minimal. Efter vår GCE-procedur kan vi nu märka vilken virulensfaktor som helst i bakterier och följa dess aktivitet med hjälp av våra bildtekniker.

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Genetiska studier av människans proteiner DNA Repair använder jäst som modellsystem

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Kartläggning Bakteriella funktionella nätverk och vägar i<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Använda syntetiska genetiska Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Super-upplösning avbildning av de bakteriella Division Maskin

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Test Prover för Optimera STORM Super-resolution Mikroskopi

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Provberedning för single virion atomic force mikroskopi och superupplösning fluorescensavbildning

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Super-upplösning avbildning av Cytokinetic Z Ring i levande bakterier Använda Snabb 3D-Structured Illumination Mikroskopi (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Genetisk Barcoding med fluorescerande proteiner för Multiplexade Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Elektroporation, isolering och avbildning av Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Öppen källkod Single-partikelanalys för Super högupplösande mikroskopering med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Grundtillståndet utarmning super resolution Imaging i däggdjursceller

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...