Name: super-resolution imaging of bacterial secreted proteins using genetic code expansion
Uploaded: 2023-02-10T13:23:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion at JoVE.com

Bu çalışma, Teksas Üniversitesi Tıp Fakültesi, Galveston, TX'den başlangıç fonları ve L.J.K.'ya Texas STAR ödülü ile desteklendi. Prof. Edward Lemke'ye (Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarı, Heidelberg, Almanya) plazmid pEVOL-PylRS-AF için teşekkür ederiz. Şekil 1'deki görüntüler BioRender kullanılarak oluşturulmuştur.

1. Plazmid konstrüksiyonu
<ol><li>POI'yi ifade eden geni, E. coli BL21'deki (DE3) POI'yi ifade eden bir ekspresyon plazmidine (örneğin, pET28a-sseJ 10TAG) klonlayın. Bu adım, mutantların işlevsel olduğunu belirlemeyi kolaylaştırır.</li>
	<li>Konakçı hücrelerde Salmonella salgılanan efektörlerin görselleştirilmesi için, önceki raporlarda açıklandığı gibi, yerel promotörünün kontrolü altında hedef POI SseJ'yi ifade eden bir ekspresyon plazmidi (pWS...

<ol>
	<li>Marlovits, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+assembly+of+the+type+III+secretion+needle+complex.">Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex.</a> Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).</li><li>Kubori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+structure+of+the+Salmonella+typhimurium+type+III+protein+secretion+system.">Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system.</a> Science. 280 (5363), 602-605 (1998).</li><li>LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonellae+interactions+with+host+processes.">Salmonellae interactions with host processes.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).</li><li>Galan, J. E., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-injection+machines+in+bacteria.">Protein-injection machines in bacteria.</a> Cell. 172 (6), 1306-1318 (2018).</li><li>Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+by+phospho-OmpR+of+ssrA/B+gene+expression+in+Salmonella+pathogenicity+island+2.">Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2.</a> Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).</li><li>Walthers, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+response+regulator+SsrB+relieves+H-NS+silencing+by+displacing+H-NS+bound+in+polymerization+mode+and+directly+activates+transcription.">Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).</li><li>Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+DNA+biosensor+tracks+OmpR-dependent+acidification+of+Salmonella+during+macrophage+infection.">A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection.</a> PLoS Biology. 13 (4), e1002116 (2015).</li><li>Liew, A. T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell,+super-resolution+imaging+reveals+an+acid+pH-dependent+conformational+switch+in+SsrB+regulates+SPI-2.">Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2.</a> eLife. 8, e45311 (2019).</li><li>Knuff, K., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+the+SIF+is+happening-the+role+of+intracellular+Salmonella-induced+filaments.">What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335 (2017).</li><li>Drecktrah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+behavior+of+Salmonella-induced+membrane+tubules+in+epithelial+cells.">Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells.</a> Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).</li><li>Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+induces+the+formation+of+filamentous+structures+containing+lysosomal+membrane+glycoproteins+in+epithelial+cells.">Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).</li><li>Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+code+expansion+enables+visualization+of+Salmonella+type+three+secretion+system+components+and+secreted+effectors.">Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors.</a> elife. 10, e67789 (2021).</li><li>Singh, M. K., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+bacterial+pathogens+and+visualization+of+their+secreted+effectors.">Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors.</a> FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050 (2020).</li><li>Akeda, Y., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+release+and+unfolding+of+substrates+in+type+III+secretion.">Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion.</a> Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).</li><li>Su, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+as+tools+to+aid+protein+production.">Fluorescent proteins as tools to aid protein production.</a> Microbial Cell Factories. 4 (1), 12 (2005).</li><li>Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+development+of+photoactivatable+fluorescent+proteins+for+single-molecule-based+superresolution+imaging.">Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).</li><li>Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+specific+mislocalization+of+red+fluorescent+proteins+in+live+Escherichia+coli.">Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli.</a> Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).</li><li>Gahlmann, A., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+bacterial+cell+biology+with+single-molecule+tracking+and+super-resolution+imaging.">Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging.</a> Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).</li><li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).</li><li>Gautier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+engineered+protein+tag+for+multiprotein+labeling+in+living+cells.">An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells.</a> Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).</li><li>Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+fluorescence+complementation+platform+for+visualizing+Salmonella+effector+proteins+reveals+distinctly+different+intracellular+niches+in+different+cell+types.">Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types.</a> ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).</li><li>Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell-based+optimization+of+the+biarsenical-binding+tetracysteine+motif+for+improved+fluorescence+and+affinity.">Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity.</a> Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+Synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li><li>Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pearling+transition+provides+evidence+of+force-driven+endosomal+tubulation+during+Salmonella+infection.">The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection.</a> mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).</li><li>Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SifA,+a+type+III+secreted+effector+of+Salmonella+typhimurium,+directs+Salmonella-induced+filament+(Sif)+formation+along+microtubules.">SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules.</a> Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).</li><li>Lang, K., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+incorporation+of+unnatural+amino+acids+and+bioorthogonal+labeling+of+proteins.">Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins.</a> Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).</li><li>Davis, L., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+proteins:+applications+of+genetic+code+expansion+in+cell+biology.">Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).</li><li>Chin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+p-azido-L-phenylalanine+to+the+genetic+code+of+Escherichia+coli.">Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).</li><li>Kipper, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+noncanonical+amino+acids+for+protein+labeling+in+a+genomically+recoded+Escherichia+coli.">Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).</li><li>Uttamapinant, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+code+expansion+enables+live-cell+and+super-resolution+imaging+of+site-specifically+labeled+cellular+proteins.">Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins.</a> Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).</li><li>Plass, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+for+Diels-Alder+reactions+in+living+cells.">Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).</li><li>Lang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+encoding+of+bicyclononynes+and+trans-cyclooctenes+for+site-specific+protein+labeling+in+vitro+and+in+live+mammalian+cells+via+rapid+fluorogenic+Diels-Alder+reactions.">Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-exploration+of+the+codon+context+effect+on+amber+codon-guided+incorporation+of+noncanonical+amino+acids+in+Escherichia+coli+by+the+blue-white+screening+assay.">Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay.</a> ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).</li><li>Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon+usage+tabulated+from+the+international+DNA+sequence+databases:+status+for+the+year+2000.">Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 292 (2000).</li><li>Spahn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+super-resolution+imaging+of+bacterial+regulatory+proteins:+the+nucleoid+and+the+cell+membrane+in+single,+fixed+E.+coli+cells.">Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).</li><li>Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy.">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li><li>Xu, J., Ma, H., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy+(STORM).">Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM).</a> Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).</li><li>Meineke, B., Heimg&#228;rtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Els&#228;sser, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+incorporation+of+two+ncAAs+for+two-color+bioorthogonal+labeling+and+crosslinking+of+proteins+on+live+mammalian+cells.">Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells.</a> Cell Reports. 31 (12), 107811 (2020).</li><li>Bessa-Neto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+labeling+of+transmembrane+proteins+with+non-canonical+amino+acids+unveils+masked+epitopes+in+live+neurons.">Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons.</a> Nature Communications. 12 (1), 6715 (2021).</li><li>Beliu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+labeling+with+tetrazine-dyes+for+super-resolution+microscopy.">Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy.</a> Communication Biology. 2, 261 (2019).</li><li>Arsi&#263;, A., Hagemann, C., Stajkovi&#263;, N., Schubert, T., Niki&#263;-Spiegel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+genetically+encoded+tags+for+fluorescent+protein+labeling+in+living+neurons.">Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons.</a> Nature Communications. 13 (1), 314 (2022).</li></ol>

Burada açıklanan yaklaşım, enfeksiyondan sonra bakteriyel T3SS tarafından konakçı hücreye enjekte edilen efektör proteinlerin kesin yerini izlemek için kullanılmıştır. T3SS'ler, virülans bileşenlerini konakçıya taşımak için Salmonella, Shigella ve Yersinia gibi hücre içi patojenler tarafından kullanılır. Süper çözünürlüklü görüntüleme teknolojilerinin geliştirilmesi, virülans faktörlerini daha önce hayal bile edilemeyen bir çözünürlükte görselleşti...

Bakteriyel enfeksiyonlar uzun zamandır insan sağlığı için ciddi bir tehlike olarak kabul edilmektedir. Patojenler, konakçı bağışıklık tepkilerinden kaçınmak ve enfeksiyonları oluşturmak için oldukça gelişmiş, son derece güçlü ve karmaşık savunma sistemlerinin yanı sıra çeşitli bakteriyel virülans faktörlerini (efektör proteinler olarak adlandırılır) kullanırlar 1,2. Bununla birlikte, bu sistemlerin altında yatan moleküler mekanizmalar ve bireysel efektör proteinlerin rolü, patogenez sırasında konakçı hücrelerdeki önemli protein bileşenlerini ve efektörlerini doğrudan takip etmek için uygun yaklaşımların yetersizliği nedeniyle hala büyük ölçüde bilinmemektedir.
Tipik bir örnek, akut gastroenterite neden olan Salmonella enterica serovar Typhimurium'dur. Salmonella Typhimurium, çeşitli efektör proteinleri doğrudan konakçı hücrelere enjekte etmek için tip üç sekresyon sistemlerini (T3SS) kullanır. Salmonella konakçı hücreye girer girmez, Salmonella içeren vakuol (SCV) 3,4 olarak adlandırılan asidik membrana bağlı bir bölmede bulunur. SCV'nin asit pH'ı, Salmonella patojenite adası 2 (SPI-2) kodlu T3SS'yi aktive eder ve vakuolar membran boyunca 20 veya daha fazla efektör proteinden oluşan bir voleybolu konakçı sitosol 5,6,7,8'e dönüştürür. Konağın içinde, efektör proteinlerin bu karmaşık kokteylleri, konakçı hücre sinyal yollarını koordine bir şekilde manipüle eder, bu da SCV'den mikrotübüller boyunca uzanan ve Salmonella'nın konakçı hücreler içinde hayatta kalmasını ve çoğalmasını sağlayan Salmonella kaynaklı filamentler (SIF'ler) olarak adlandırılan son derece dinamik, karmaşık boru şeklindeki membran yapılarının oluşmasına neden olur9,10,11.
Bakteriyel efektör lokalizasyonlarını görselleştirmek, izlemek ve izlemek ve konakçı hücreler içindeki kaçakçılığını ve etkileşimlerini incelemek için kullanılan yöntemler, bakteriyel patogenezi destekleyen mekanizmalar hakkında kritik bilgiler sağlar. Salmonella salgılanan T3SS efektör proteinlerinin konakçı hücreler içinde etiketlenmesi ve lokalizasyonunun teknolojik bir zorluk olduğu kanıtlanmıştır12,13; Bununla birlikte, genetik olarak kodlanmış floresan proteinlerinin gelişimi, canlı sistemler içindeki proteinleri inceleme ve görselleştirme yeteneğimizi dönüştürmüştür. Bununla birlikte, floresan proteinlerinin boyutu (~25-30 kDa)15 genellikle ilgilenilen proteininkiyle karşılaştırılabilir veya hatta ondan daha büyüktür (POI; örneğin, SsaP için 13.65 kDa, SifA için 37.4 kDa). Aslında, efektörlerin floresan protein etiketlemesi genellikle etiketli efektörün salgılanmasını bloke eder ve T3SS14'ü sıkıştırır.
Ayrıca, floresan proteinler daha az kararlıdır ve fotobeyazlatmadan önce düşük sayıda foton yayar, bu da süper çözünürlüklü mikroskobik tekniklerdekullanımlarını sınırlar 16,17,18, özellikle fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobu (PALM), STORM ve uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu. Organik floresan boyaların fotofiziksel özellikleri floresan proteinlerinkinden daha üstün olsa da, CLIP / SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH / FlAsH 22,23 ve HA-Tags24,25 gibi yöntemler / teknikler, çeviri sonrası modifikasyona veya kaçakçılığa müdahale ederek ilgili efektör proteinin yapısını-işlevini bozabilecek ek bir protein veya peptit eki gerektirir. Gerekli protein modifikasyonunu en aza indiren alternatif bir yöntem, GCE yoluyla çeviri sırasında ncAA'ların bir POI'ye dahil edilmesini içerir. ncAA'lar ya floresandır ya da tıklama kimyası 12,13,26,27,28 ile floresan yapılabilir.
GCE kullanarak, küçük, işlevsel, biyo-ortogonal gruplara (azid, siklopropen veya siklooktin grubu gibi) sahip ncAA'lar, bir hedef proteinin hemen hemen her yerine sokulabilir. Bu stratejide, doğal bir kodon, POI'nin geninde belirli bir konumda amber (TAG) durdurma kodonu gibi nadir bir kodon ile değiştirilir. Modifiye protein daha sonra ortogonal aminoasil-tRNA sentetaz / tRNA çifti ile birlikte hücrelerde eksprese edilir. tRNA sentetaz aktif bölgesi, yalnızca belirli bir ncAA'yı alacak şekilde tasarlanmıştır, bu daha sonra kehribar kodonu tanıyan tRNA'nın 3' ucuna kovalent olarak bağlanır. ncAA basitçe büyüme ortamına sokulur, ancak hücre tarafından alınmalı ve aminoasil-tRNA sentetazın (aaRS) ortogonal tRNA'ya bağlayabileceği sitozole ulaşmalıdır; daha sonra belirtilen konumdaki İÇN'ye dahil edilir (bkz. Şekil 1)12. Böylece, GCE, keton, azid, alkin, siklooktin, transsiklookten, tetrazin, norbonen, α, β-doymamış amid ve bicyclo [6.1.0]-nonyne gibi biyo-ortogonal reaktif grupların bolluğunun bir POI'ye bölgeye özgü olarak dahil edilmesini sağlarve potansiyel olarak geleneksel protein etiketleme yöntemlerinin sınırlamalarının üstesinden gelir 12,26,27,28.
Süper çözünürlüklü görüntüleme tekniklerinde son zamanlarda ortaya çıkan eğilimler, biyolojik yapıları moleküler düzeyde araştırmak için yeni yollar açmıştır. Özellikle, tek moleküllü, lokalizasyon tabanlı, süper çözünürlüklü bir teknik olan STORM, ~ 20-30 nm'ye kadar hücresel yapıları görselleştirmek için paha biçilmez bir araç haline gelmiştir ve biyolojik süreçleri bir seferde bir molekül araştırabilmekte ve böylece geleneksel topluluk ortalamalı çalışmalarda henüz bilinmeyen hücre içi moleküllerin rollerini keşfedebilmektedir13 . Tek moleküllü ve süper çözünürlüklü teknikler, en iyi çözünürlük için parlak, fotoğraflanabilir organik floroforlara sahip küçük bir etiket gerektirir. Yakın zamanda GCE'nin süper çözünürlüklü görüntüleme12 için uygun probları dahil etmek için kullanılabileceğini gösterdik.
Hücrelerde protein etiketleme için en iyi seçeneklerden ikisi, bisiklo [6.1.0] nonynelysine (BCN) ve trans-siklookten-lizindir (TCO; Şekil 1'de gösterilmiştir), burada Pyl pirolizin temsil eder ve AF, doğal olarak pirolizin 12'yi kodlayan Methanosarcina labirentinden türetilen rasyonel olarak tasarlanmış bir çift mutantı (Y306A, Y384F) temsil eder. 29,30,31. Suş destekli ters elektron talebi Diels-Alder sikloekleme (SPIEDAC) reaksiyonu sayesinde, bu amino asitler tetrazin konjugatları ile kemoselektif olarak reaksiyona girer (Şekil 1)12,30,31. Bu tür sikloekleme reaksiyonları son derece hızlıdır ve canlı hücrelerle uyumludur; Ayrıca, tetrazin moiety 12,26,32 ile uygun bir florofor işlevselleştirilirse, florojenik olabilirler. Bu yazıda, GCE kullanılarak konakçı hücrelere verilen bakteriyel efektörlerin dinamiklerini izlemek için optimize edilmiş bir protokol ve ardından dSTORM kullanılarak HeLa hücrelerinde salgılanan proteinlerin hücre altı lokalizasyonu sunulmaktadır. Sonuçlar, GCE yoluyla bir ncAA'nın dahil edilmesinin, ardından florojenik tetrazin taşıyan boyalarla bir tıklama reaksiyonunun, seçici etiketleme, salgılanan proteinlerin görselleştirilmesi ve ardından konakçıda hücre altı lokalizasyonu için çok yönlü bir yöntemi temsil ettiğini göstermektedir. Bununla birlikte, burada ayrıntılı olarak açıklanan tüm bileşenler ve prosedürler, GCE sisteminin diğer biyolojik soruları araştırmak için uyarlanabilmesi için ayarlanabilir veya değiştirilebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine SDS running buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A661-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulphate</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP212R-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin Sodium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>ThermiFischer Scientific</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabinose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3256</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto-Agar</td>
			<td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDP-FL-tetrazine</td>
			<td>Lumiprobe (USA)</td>
			<td>2.14E+02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>444203</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en &#8211; L - Lysine (TCO*A)</td>
			<td>SiChem GmbH</td>
			<td>SC-8008</td>
			<td>Size: 500 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (Hoechst33342)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeNovix DS-11+ Spectrophotometer</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM*</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>* Used for maintaining HeLa Cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM**</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>**Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain BL21 (DE3)</td>
			<td>Novagen (Madison, WI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon Ultra 897-BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td>30123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 &#181;m)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>97203</td>
			<td>Pack of 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7141-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BF229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-C1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocloric acid</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Image processing and analysis:&#160; http://rsbweb.nih.gov/ij</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntantBlue</td>
			<td>Expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>Coomassie-based stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Janelia Fluoro 646-tetrazine</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;Manager (v. 1.4.2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671</td>
			<td>250 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pulser cuvette</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2086</td>
			<td>0.2 cm electrode gap, pkg. of 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon N-STORM</td>
			<td>Nikon Instruments Inc.</td>
			<td></td>
			<td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks</td>
			<td>ThermiFischer Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnipur Casamino Acid</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>2240</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehhyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution (100x)</td>
			<td>GenDEPOT&#160;</td>
			<td>CA005-010</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEVOL-PylRS-AF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For plasmid construction and map see following references 
			1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 
			2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Mini-prep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: elife. 2021, 10, e67789.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pWSK29-sseJ-HA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: elife. 2021, 10, e67789.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>540025</td>
			<td>Protein grade, 10% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium sulphate</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>424220250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>539131</td>
			<td>100x Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-HA primary antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. enterica. serovar Typhimurium 14028s</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036-50G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate (100 mM), 100x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-C1</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator Model 100</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>24932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system)</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td>https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThunderSTORM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://zitmen.github.io/thunderstorm/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (1x), 0.25%&#160;&#160;</td>
			<td>GenDEPOT&#160;</td>
			<td>CA014-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-well tissue culture chamber slides</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>94.6190.802</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of bacterial secreted proteins using genetic code expansion

Tip üç sekresyon sistemleri (T3SS'ler), gram-negatif bakterilerin bir efektör protein bataryasını doğrudan ökaryotik konakçı hücrelerin sitozolüne enjekte etmesini sağlar. Girişte, enjekte edilen efektör proteinler ökaryotik sinyal yollarını işbirliği içinde modüle eder ve hücresel fonksiyonları yeniden programlayarak bakteri girişini ve hayatta kalmasını sağlar. Bu salgılanan efektör proteinlerin enfeksiyonlar bağlamında izlenmesi ve lokalize edilmesi, konakçı-patojen etkileşimlerinin dinamik arayüzünü tanımlamak için bir ayak izi sağlar. Bununla birlikte, konakçı hücrelerdeki bakteri proteinlerinin yapılarını/işlevlerini bozmadan etiketlenmesi ve görüntülenmesi teknik olarak zordur. 
Floresan füzyon proteinlerinin oluşturulması bu sorunu çözmez, çünkü füzyon proteinleri salgı aparatını sıkıştırır ve böylece salgılanmaz. Bu engellerin üstesinden gelmek için, yakın zamanda genetik kod genişlemesi (GCE) kullanarak, bakteriyel salgılanan efektörlerin ve diğer etiketlenmesi zor proteinlerin bölgeye özgü floresan etiketlemesi için bir yöntem kullandık. Bu makale, GCE bölgesini kullanarak Salmonella salgılanan efektörlerini etiketlemek için eksiksiz bir adım adım protokol ve ardından doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (dSTORM) kullanarak HeLa hücrelerinde salgılanan proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu görüntülemek için talimatlar sunmaktadır 
Son bulgular, kanonik olmayan amino asitlerin (ncAA'lar) GCE yoluyla dahil edilmesinin, ardından tetrazin içeren boyalarla biyo-ortogonal etiketlemenin, bakteriyel salgılanan proteinlerin seçici etiketlenmesi ve görselleştirilmesi ve konakçıda müteakip görüntü analizi için uygun bir teknik olduğunu göstermektedir. Bu makalenin amacı, bakteri ve virüslerdeki çeşitli biyolojik süreçleri ve konakçı-patojen etkileşimlerini incelemek için GCE kullanarak süper çözünürlüklü görüntüleme yapmakla ilgilenen araştırmacılar tarafından kullanılabilecek basit ve net bir protokol sağlamaktır.

Bu protokol belgesinde, Şekil 1'de gösterildiği gibi, bölgeye özgü floresan etiketleme ve Salmonella salgılanan efektörlerin görselleştirilmesi için GCE tabanlı bir yöntem açıklanmaktadır. ncAA taşıyan trans-siklookten biyoortogonal grubunun (TCO) kimyasal yapısı ve floresan boya Şekil 1A'da gösterilmiştir. SseJ etiketlemesi, GCE teknolojisi ile ortogonal aminoasil-tRNA sentetaz / tRNA çi...

Watch this Scientific Journal Video about Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion at JoVE.com

Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion

Bu makale, genetik kod genişlemesi (GCE) bölgesini kullanarak Salmonella salgılanan efektörlerini spesifik olarak etiketlemek ve doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (dSTORM) kullanarak HeLa hücrelerinde salgılanan proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu görüntülemek için basit ve açık bir protokol sunmaktadır

Genetik Kod Genişlemesi Kullanılarak Bakteriyel Salgılanan Proteinlerin Süper Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Type three secretion systems (T3SSs) enable gram-negative bacteria to inject a battery of effector proteins directly into the cytosol of eukaryotic host ...

Genetik kod genişlemesi veya GCE, diğer etiketleme stratejilerinin sınırlamalarının üstesinden gelir. Özel olarak etiketlenmiş proteinleri yerleştirmemizi sağlar ve görselleştirmelerini sağlayan parlak organik floroforlarımız vardır, böylece protein fonksiyonunu bozabilecek floresan protein füzyonları yapan stratejilerden kaçınabiliriz. Bu yöntem başka herhangi bir sisteme uygulanabilir.Örneğin, Zika CO proteinini etiketlemek için kullandık ve bu, daha sonra konakçı hücreleri enfekte ettiğini gözlemleyebileceğimiz etiketli Zika virüsü sağlamamızı ve üretmemizi sağlıyor. Başlamak için, 100 mikrolitre birincil kültürü, mililitre kloramfenikol başına 35 mikrogram ve mililitre ampisilin başına 100 mikrogram içeren beş mililitre LB ortamına aktarın. 600 nanometredeki optik yoğunluk 0.6'ya ulaşana kadar 250 RPM'de çalkalayarak 37 santigrat derecede inkübe edin.LB ortamını, kanonik olmayan bir amino asit olan bir milimolar TCO ile desteklenmiş modifiye N-minimal ortam ile değiştirin. Ve bakterileri 30 dakika boyunca 34 santigrat derecede büyütün. % 0.2 arabinoz, mililitre kloramfenikol başına 25 miligram ve mililitre ampisilin başına 100 miligram ekleyin ve hücreleri 250 RPM'de sallayarak altı saat daha büyütün.Altı saat sonra, bakterileri kanonik olmayan amino asitler veya ncAA içermeyen taze MgM ortamı ile 30 dakikalık bir aralıkta dört kez yıkayın. Bakterileri santrifüj edin, PBS tamponunda tekrar askıya alın ve fazla ncAA'ları gidermek için karanlıkta dört santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin. Bir saat sonra, bakterileri dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 3.000 G'de santrifüj edin ve daha fazla kullanım için saklayın.Bir kontrol deneyi için, ncAA yokluğunda ncAA taşıyan proteinleri eksprese ederek aynı deneyi tekrarlayın. PBS'de TCO'nun yokluğunda veya varlığında TCO ile birleştirilen SseJ'yi eksprese eden salmonella hücrelerini yeniden askıya alın. PBS'de optik yoğunluğu 600 nanometrede dörde ayarlayın ve hücreleri karanlıkta 37 santigrat derecede 20 mikromolar Janelia Fluor 646 tetrazen veya 20 mikromolar BDPFL tetrazin ile inkübe edin ve 250 RPM'de bir ila iki saat çalkalayın.Hücreleri pelet haline getirin ve% 5 DMSO ve% 0.2 Pluronic F-127 içeren PBS ile üç ila dört kez yıkayın. Peletin %5 DMSO içeren PBS'de tekrar askıya alınması. Karanlıkta gece boyunca dört santigrat derecede inkübe ettikten sonra, PBS ile iki kez daha yıkayın.Konfokal mikroskop kullanarak hücreleri hemen görüntüleyin veya karanlıkta oda sıcaklığında 30 ila 45 dakika boyunca PBS'de% 1.5 paraformaldehit ile sabitleyin. HeLa hücrelerini 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksit ve% 95 nemde, penisilin streptomisin'e ek olarak% 10 FBS ile desteklenmiş yüksek glikozlu DMEM'de kültürleyin ve koruyun. Enfeksiyondan bir gün önce bakterileri kültürleyin ve ortogonal tRNA sentetaz çifti içeren pEVOL plazmidini ve SseJ geni içeren pWSK29 plazmidini barındıran tek bir vahşi tip salmonella kolonisini, 250 RPM'de çalkalama ile gece boyunca 37 santigrat derecede standart LB suyu içeren beş milimetre antibiyotik içinde aşılayın.Sekiz kuyucuklu bir slaytta% 10 FBS büyüme ortamı içeren 500 mikrolitre DMEM'de mililitre başına seyreltilmiş bir hücre stoğunu onarın ve kuyu başına 50.000 HeLA hücresini tohumlayın. Oda slaytını 24 saat boyunca bir inkübatörde 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit ve% 95 nemde tutun. Bakteriyel enfeksiyon için, 100 mikrolitre gecelik bakteri kültürünü, mililitre kloramfenikol başına 35 mikrogram ve mililitre ampisilin başına 100 mikrogram içeren üç mililitre LB ortamına seyrelterek, pEVOL plazmidi ve SseJ geni içeren pWSK29 plazmidini barındıran alt kültür vahşi tip salmonella.Beş ila yedi saat boyunca 250 RPM'de çalkalayarak 37 santigrat derecede inkübe edin. HeLa hücre enfeksiyonunu başlatmak için, HeLa hücrelerini inkübatörden çıkardıktan sonra, hücreleri önceden ısıtılmış DPBS ile yıkayın ve her bir kuyucuğa% 10 FBS içeren 500 mikrolitre taze DMEM ekleyin. Enfeksiyon başlayana kadar odayı karbondioksit inkübatörüne geri kaydırın.Beş ila yedi saatlik inkübasyondan sonra, salmonella kültürünü, 600 nanometredeki optik yoğunluk bir mililitre DMEM büyüme ortamında 0.2 olacak şekilde seyreltin ve oda slaytının her bir kuyucuğuna gerekli miktarda salmonella inokulum ekleyin, böylece enfeksiyonun çokluğu 100 olur. Enfekte olmuş hücreleri bir karbondioksit inkübatöründe 30 dakika boyunca inkübe ettikten sonra, hücre dışı salmonella'yı çıkarmak için hücreleri önceden ısıtılmış DPBS ile üç kez yıkayın. Bu zaman noktasını enfeksiyondan sıfır saat sonrasına ayarlayın ve bir saat boyunca mililitre gentamisin başına 100 mikrogram içeren 500 mikrolitre tam ortam ekleyin.İnkübasyondan sonra, yine, hücreleri daha önce gösterildiği gibi DPBS ile üç kez yıkayın ve oda slaytının her bir kuyucuğuna% 0.2 arabinoz, mililitre başına 10 mikrogram gentamisin ile desteklenmiş tam ortamın 500 mikrolitresini ekleyin. Bir kontrol deneyinde, TCO olmadan HeLa hücrelerinin benzer enfeksiyonlarını gerçekleştirin. Oda slaytını karbondioksit inkübatöründe 10 saat inkübe ettikten sonra, tüm ortamı TCO içermeyen taze tam ortamla değiştirin ve HeLa hücrelerini her biri önceden ısıtılmış DPBS ile 30 dakikalık bir aralıkta dört kez yıkayın.Daha sonra hücreleri TCO olmadan taze tam ortamla yıkayın. Enfeksiyondan 12 saat sonra, ortamı hücrelerden aspire edin ve hücreyi önceden ısıtılmış DPBS ile iki veya üç kez yıkayın. Kuyucukların bir grubunda, 500 mikrolitre boya çözeltisi karışımı bir tane ekleyin ve aynı oda slaydının kuyucuklarının başka bir grubunda, boya çözeltisi karışımı iki 500 mikrolitre ekleyin.Oda slaytlarını bir ve 1/2 ila iki saat boyunca karbondioksit inkübatörüne geri yerleştirin. Enfeksiyondan 13.5 ila 14 saat sonra, HeLa hücrelerini önceden ısıtılmış DPBS ile iki kez durulayın ve FBS ile desteklenmiş 500 mikrolitre taze DMEM ekleyin. 30 dakika inkübe ettikten sonra, hücreleri daha önce gösterildiği gibi önceden ısıtılmış DPBS ile tekrar yıkayın ve ardından 30 dakikalık bir aralıkta dört kez taze DMEM ile yıkayın.Enfeksiyondan 16 saat sonra, her bir kuyucuğa 200 mikrolitre% 4 paraformaldehit ekleyerek ve karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ederek HeLa hücrelerini paraformaldehit ile sabitleyin. Paraformaldehiti aspire edin. PBS ile üç kez durulayın ve hücreleri karanlıkta dört santigrat derecede PBS'de saklayın.Hücreleri mikroskopa getirin ve görüntüleme odasını numune tutucudaki mikroskop aşamasına yerleştirin. Ardından, kuyucuktaki ortamı 0,4 mililitre taze yapılmış GLOX BME görüntüleme tamponu ile değiştirin. İlgilenilen bir HeLa hücresini tanımlamak için lazer gücünü yaklaşık bir miliwatt'a düşürün ve numuneyi düşük 647 nanometre lazer yoğunluklarıyla aydınlatırken odak düzlemini ve lazer ışını açısını ayarlayın.HILO aydınlatma açısını ayarlayın. Hedef yapının kesirli sınırlı görüntüsüne bir referans yakalayın ve lazeri maksimum gücüne döndürerek floroforları karanlık duruma getirin. Ön amplifikatör kazancını üçe ayarlayın ve kare aktarımını etkinleştirin.Ardından dSTORM ölçümlerinde daha yüksek hassasiyet için EM kazancını 200 olarak ayarlayın. Lazer gücünü, yanıp sönen olayların uzay ve zamanda ayrıldığı uygun bir seviyeye ayarlayın. Pozlama süresini 30 milisaniyeye ayarlayın ve almaya başlayın.10.000 ila 30.000 kare elde edin. Benzer satın alma işlemini farklı yatırım getiri'lerinde tekrarlayın. dSTORM'un görüntülerin yeniden yapılandırılması için J görüntüsünü açın ve ham verileri içe aktarın.Thunderstorm eklentisini açın ve cihaza karşılık gelen kamera ayarını yapılandırın. Analizi çalıştırmaya gidin ve görüntü filtreleme, yerelleştirme yöntemleri ve moleküllerin alt piksel lokalizasyonu gibi uygun ayarları yapın. Görüntü yeniden yapılandırmasını başlatmak ve işlem sonrası son sonuç analizine başlamak için Tamam'ı tıklatın.TCO ile birleştirilen SseJ'yi eksprese eden Salmonella, Janelia Fluor 646 tetrazin ile muamele edilir ve TCO yokluğunda veya varlığında Janelia Fluor 646 floresan ile görüntülenir. SseJ'nin floresansı yalnızca TCO mevcut olduğunda algılanır. HeLa hücreleri, 16 saat boyunca psseJ-HA barındıran salmonella ile enfekte edilir, anti HA antikoru, LPS ve DAPI ile sabitlenir ve immün olarak boyanır.Beklendiği gibi, enfekte olmuş hücrelerde SseJ bağımlı salmonella kaynaklı filamentler veya SIF'ler oluşur. TCO yokluğunda, amber kodonu baskılanmaz ve enfekte HeLa hücrelerinde SseJ'ye bağımlı SIF'ler yoktur. SseJ'e bağımlı SIF'ler, SseJ'nin genetik kod genişlemesi veya GCE kullanılarak SseJF10TCOHA ekspresyonu ile kurtarıldığını açıkça gösteren TCO varlığında gözlenir.HeLa hücrelerinde salgılanan SseJF10TCOHA'nın iki alternatif boya karışımı bir ve iki boya karışımı kullanılarak SPIEDAC tıklama reaksiyonları yoluyla etiketlenmesi özgüllüğü burada gösterilmiştir. Click boya Janelia Fluor 646 TZ, TCO ve P vault plazmidi varlığında SseJ HA taşıyan vahşi tip Salmanella ile enfekte olmuş HeLa hücrelerinde herhangi bir arka plan etiketlemesi olup olmadığını gözlemlemek için daha fazla kullanıldı. SseJ, floresan sinyalinin SseJ'ye özgü olduğunu gösteren hücre içi veya spesifik olmayan floresan sinyalleri olmadan konakçı hücrenin sitoplazmasına salındı.HeLa hücrelerinde GCE işaretli SseJ'nin süper çözünürlüklü görüntülemesi bu şekilde sunulmuştur. Gözlem altındaki bir HeLa hücresinin parlak alan görüntüsü burada gösterilmektedir. TCO ve Janelia Fluor 646 ile etiketlenmiş salgılanan SseJ'in kırınım sınırlı geniş alan görüntüsü ve SseJ dekorlu SIF'lerin karşılık gelen dSTORM görüntüsü burada sunulmaktadır.Ek, kutulu bölgedeki süper çözümlenmiş bir SseJ'nin büyütülmüş bir görünümünü gösterir. NCAA stok çözümleri NaOH'da hazırlandı. Medyaya eklemeden önce veya sonra nötralize etmeyi unutmayın.İlgilenilen proteini etiketledikten sonra, hücreyi iyice yıkayın, böylece arka plan sinyali minimum olur. GCE prosedürümüzü takiben, artık bakterilerdeki herhangi bir virülans faktörünü etiketleyebilir ve görüntüleme tekniklerimizi kullanarak aktivitesini takip edebiliriz.

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

İnsan DNA Onarım Proteinler Genetik Araştırmalar Maya Model Sistemi olarak kullanma

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Biyoloji

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bakteriyel Bölümü Makine Super çözünürlüklü Görüntüleme

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Optimize STORM Süper Çözünürlük Mikroskopi Testi Örnekleri

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Hızlı 3D-Yapılandırılmış Aydınlatma mikroskopi ile Canlı Bakteri Cytokinetic Z Yüzük Süper çözünürlük Görüntüleme (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Multiplexed Uygulamaları için Floresan Proteinleri ile Genetik Barkodlama

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Elektroporasyon, Myofibers İzolasyon ve Görüntüleme

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Memeli hücrelerinde devlet tükenmesi süper kararlılık düşsel yer

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...