3.6K Views
•
10:57 min
•
August 24th, 2022
DOI :
August 24th, 2022
•1:06
Gene Targeting of Embryonic Stem Cells (ESCs)
4:16
PCR Genotyping of Targeted ESCs
7:02
Preparation of Eight-Cell Stage Embryo and Microinjection of ESCs
9:49
Results: Screening of Targeted ESC Clones
10:10
Conclusion
0:04
Introduction
Transcript
Genom att producera genetiskt modifierade möss och analysera deras fenotyp kan vi förstå specifika genfunktioner i detalj, in vivo. Många viktiga fynd har upptäckts med hjälp av genmodifierade djurmodeller. Metoden vi beskriver här gör det möjligt för långt DNA att implantera stamceller med acceptabel effektivitet för utan läkemedelsval.
Tekniken är fördelaktig inte bara för grundläggande life science, utan resultaten kommer också att implementeras inom tillämpad vetenskap som medicinsk vetenskap och husdjursvetenskap. Demonstrerar proceduren kommer att vara Dr.Chihiro Emori, en biträdande professor, och Dr.Manabu Ozawa, en docent från mitt laboratorium. Efter beredning av musembryonal fibroblast, förbered den gelatinbelagda cellodlingsskålen som beskrivs i manuskriptet och inkubera den i två timmar i en fuktig inkubator.
Ta bort gelatinlösningen, tvätta skålen två gånger med PBS och förvara den vid rumstemperatur tills den används. Tina mitotiskt inaktiverad frusen MEF-fond med ett vattenbad härdat vid 37 grader Celsius i en minut. En dag före ESC-sådd, placera MEF på en gelatinbelagd 60-millimetersskål.
Tina ett fryst ESC-lagerrör som visats tidigare och placera en gånger 10 till den femte ESC: n på en 60-millimeters skål som innehåller försådd MEF. Tillsätt sedan fyra milliliter ESC-odlingsmedium och inkubera skålen tills ESC når 50 till 70% sammanflöde. Efter tvättning av den odlade ESC med fyra milliliter PBS, smälta dem med 800 mikroliter 0,25% trypsin EDTA-lösning i fem minuter vid 37 grader Celsius.
När trypsin har inaktiverats med en milliliter ESCM, tillsätt en milliliter färsk ESCM till cellerna, överför mediet till ett rör och pelletera cellerna genom centrifugering vid 280 G i fem minuter. Efter att ha återsuspenderat cellerna i en milliliter färsk ESCM, räkna cellkoncentrationen med hjälp av en cellräknare med trypanblå färgning. Efter att ha överfört en gång 10 till den femte ESC till ett nytt 1,5-milliliterrör och tvättat dem tre gånger med PBS genom centrifugering, suspendera ESC-pelleten i 12 mikroliter Cas9 RNP DNA-blandning och blanda väl genom mild pipettering för att undvika bubblande.
Servera sedan den upphängda ESC för elektroporering. Därefter odlar du de elektroporerade ESC: erna i en 60-millimeters skål som innehåller fyra milliliter ECSM med mitotiskt inaktiverad MEF och fortsätter att byta medium dagligen. Tre till fem dagar efter elektroporeringen, tvätta ESC: erna med fyra milliliter PBS och smält dem sedan med 800 mikroliter 0,25% trypsin EDTA och odling i en fuktig inkubator.
Tillsätt sedan två milliliter ESCM för att stoppa trypsinsmältningen. När cellblandningen har pelleterats, suspendera pelleten i en milliliter färsk ESCM och räkna cellkoncentrationen med hjälp av en cellräknare med trypanblå färgning. Passera ESC: erna vid en gång 10 till de tredje cellerna per 60 millimeter skål som innehåller ESCM och matare MEF.
Se till att byta medium tills kolonin tar upp. Fem till sju dagar efter den första passagen, när ESCM har sugits upp från ESC-odlingsskålen, tillsätt fyra milliliter PBS. Använd en 20-mikroliter pipett, plocka upp enstaka ESC-kolonier med fem mikroliter PBS under ett stereomikroskop.
Placera de enskilda kolonierna i en brunn av en rundbotten 96-brunnsplatta innehållande 15 mikroliter 0,25% trypsin EDTA-lösning. Efter inkubation av 96-brunnsplattan, stoppa trypsinsmältningen genom att tillsätta 80 mikroliter ESCM och dissociera ESC-kolonier i enskilda celler genom pipettering. För PCR-genotypning, överför 40 mikroliter ESC-suspension till en gelatinbelagd, matarfri 96-brunnsplatta som innehåller 50 mikroliter ESCM per brunn.
För att göra det frysta ESC-beståndet, överför de återstående 60 mikroliter ESC-suspensionen till en brunn av en gelatinbelagd 24-brunnsplatta som innehåller 500 mikroliter ESCM och matare MEF. Lagra enskilda ESC-kloner odlade i 24-brunnsplattan tills de når 60 till 80% sammanflöde och återvinn enskilda ESC-kloner genom trypsinisering, som visats tidigare. Efter att ha erhållit cellpelleten genom centrifugering, återsuspendera i 500 mikroliter cellfrysningsmedium för att frysa cellerna vid minus 80 grader Celsius.
För PCR-genotypning, odla ESC-kloner som visats tidigare och ta bort ESCM från varje brunn genom aspiration innan du tvättar den med 100 mikroliter PBS två gånger. Efter aspirering av PBS, tillsätt 100 mikroliter lysbuffert innehållande proteinas K och blanda väl. Överför nu ESC-lysatet till ett nytt 1,5-millilitersrör och förvara det i en värmekammare vid 65 grader Celsius i minst en timme.
När det genomiska DNA:t har lösts upp i 20 mikroliter DNas-fritt vatten, bestäm renheten och koncentrationen av DNA med hjälp av en spektrofotometer. Efter att ha utfört genomisk PCR med locusspecifika primeruppsättningar för att förstärka målregionen, kontrollera sekvensen och välj ESC-klonerna med önskade knock-in-sekvenser. Efter att ha parat de hormonbehandlade honorna med ICR-hanarna och samlat äggledaren, placera de uppsamlade äggledarna i FHM-droppar och återhämta embryona i tvåcelligt eller fyrcelligt stadium genom att spola äggledaren med FHM med hjälp av en spolnål som sätts in i infundibulum.
Tvätta de uppsamlade embryona genom att flytta dem till flera färska FHM-droppar med en munpipett. Odla embryona i 50 mikroliter KSOM-droppar på en 35-millimeters cellodlingsskål täckt med mineralolja som visats tidigare under en dag tills åttacells- eller morulastadiet har uppnåtts. Förbered glaspipetter för att hålla embryona och ESC-injektion med hjälp av en avdragare och mikroforge.
Efter att ha integrerat en hållpipett innehållande FHM i en kapillärhållare ansluten till en mikroinjektor, ställ in den på vänster sida av mikromanipulatorn. Anslut en injektionspipett till en annan mikroinjektor och ställ in den på höger sida. Rikta in de två pipetterna rakt i mikroskopets synfält.
Gör fem mikroliter droppar av 12% polyvinylpyrrolidon och fem-mikroliter droppar FHM på samma lock på en 60-millimeter skål, sida vid sida. Täck dropparna med mineralolja. Överför embryona i fem mikroliter FHM-droppe och tillsätt en till fem mikroliter av ESC-suspensionen till den embryoinnehållande FHM-droppen.
När injektionspipetten har tvättats med polyvinylpyrrolidon, flytta injektionspipetten till droppen som innehåller embryon och ESC. Välj tre individuella ESC-dubbletter som just har avslutat sin celldelning i injektionspipetten. Håll med hjälp av hållpipetten ett åttacells- eller morulastegsembryo som har slutfört komprimering genom aspiration och gör ett hål i zona pellucida med en piezoelektrisk puls.
Utvisa den sexcelliga ESC inuti zona pellucida och dra pipetten ur embryona. Tvätta de ESC-injicerade embryona med flera KSOM-droppar försiktigt med hjälp av en munpipett och inkubera dem i en ny 50-mikroliter KSOM-droppe täckt med mineralolja, som visats tidigare, tills embryona utvecklades till blastocyststadiet. En PCR-amplicon av storlek som är specifik för knock-in-målet erhålls och 9 av 22 kloner visade ett knock-in-specifikt band.
Dessa resultat är effektiva och reproducerbara för gen-knock-in utan några läkemedelsval. Att plocka upp den optimala storleken på ESC-kolonier är ganska viktigt för denna procedur. Undvik att välja kolonier som är för stora eller för små.
CRISPR Cas9-medierad direkt genomredigering med hjälp av en zygot skulle vara tillämplig för att göra enkla genutslagsmöss. Detta CRISPR Cas9-medierade ESC-geninriktningsprotokoll underlättar produktionen av olika genetiskt modifierade möss för framtida analys inom life science.
Här presenterar vi ett protokoll för att utveckla genmodifierade musmodeller med embryonala stamceller, speciellt för stora DNA-knock-in (KI). Detta protokoll är inställt med hjälp av CRISPR/Cas9-genomredigering, vilket resulterar i signifikant förbättrad KI-effektivitet jämfört med den konventionella homologa rekombinationsmedierade linjäriserade DNA-inriktningsmetoden.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved