Name: preclinical drug testing in scalable 3d engineered muscle tissues
Uploaded: 2023-04-07T13:10:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues at JoVE.com

Эта работа была частично поддержана финансированием Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (U01 FD006676-01, присужденное Институту наук о здоровье и окружающей среде) и финансированием Национальных институтов здравоохранения (HL151094 доктору Гейссе). Мы благодарим д-ра Алека С. Т. Смита за помощь в подготовке этой рукописи.

<ol>
	<li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4, 150 (2013).</li><li>Mudera, V., Smith, A. S. T., Brady, M. A., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cell+density+on+the+maturation+and+contractile+ability+of+muscle+derived+cells+in+a+3D+tissue-engineered+skeletal+muscle+model+and+determination+of+the+cellular+and+mechanical+stimuli+required+for+the+synthesis+of+a+postural+phenotype.">The effect of cell density on the maturation and contractile ability of muscle derived cells in a 3D tissue-engineered skeletal muscle model and determination of the cellular and mechanical stimuli required for the synthesis of a postural phenotype.</a> Journal of Cellular Physiology. 225 (3), 646-653 (2010).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy.">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Human Gene Therapy. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li><li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue.">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).</li><li>Fleming, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+skeletal+muscle+capable+of+functional+regeneration.">Bioengineered human skeletal muscle capable of functional regeneration.</a> BMC Biology. 18 (1), 145 (2020).</li><li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs.">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 4, 04885 (2015).</li><li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+3D+in+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+at+the+single+fiber+scale.">Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale.</a> PLOS One. 15 (5), 0232081 (2020).</li><li>Afshar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+96-well+culture+platform+enables+longitudinal+analyses+of+engineered+human+skeletal+muscle+microtissue+strength.">A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength.</a> Scientific Reports. 10, 6918 (2020).</li><li>Sakar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+optogenetic+control+of+engineered+3D+skeletal+muscle+bioactuators.">Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).</li><li>Vila, O. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+human+neuromuscular+function+through+optogenetics.">Quantification of human neuromuscular function through optogenetics.</a> Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).</li><li>Khodabukus, A., Baar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+electrical+stimulation+emphasizing+excitability+for+the+development+and+testing+of+engineered+skeletal+muscle.">Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (5), 349-357 (2011).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-screening+platform+based+on+the+contractility+of+tissue-engineered+muscle.">Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle.</a> Muscle &amp; Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).</li><li>Bielawski, K. S., Leonard, A., Bhandari, S., Murry, C. E., Sniadecki, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+force+and+frequency+analysis+of+engineered+human+heart+tissue+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells+using+magnetic+sensing.">Real-time force and frequency analysis of engineered human heart tissue derived from induced pluripotent stem cells using magnetic sensing.</a> Tissue Enineering Part C Methods. 22 (10), 932-940 (2016).</li><li>Smith, A. S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+real-time+monitoring+of+engineered+skeletal+muscle+function+using+magnetic+sensing.">High-throughput, real-time monitoring of engineered skeletal muscle function using magnetic sensing.</a> bioRxiv. , 492879 (2022).</li><li>Scheraga, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thrombin-fibrinogen+interaction.">The thrombin-fibrinogen interaction.</a> Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).</li><li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle.">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li><li>Carvalho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxorubicin:+the+good,+the+bad+and+the+ugly+effect.">Doxorubicin: the good, the bad and the ugly effect.</a> Current Medicinal Chemistry. 16 (25), 3267-3285 (2009).</li><li>Ahmad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+dysfunction+associated+with+a+nucleotide+polymerase+inhibitor+for+treatment+of+hepatitis+C.">Cardiac dysfunction associated with a nucleotide polymerase inhibitor for treatment of hepatitis C.</a> Hepatology. 62 (2), 409-416 (2015).</li><li>Gill, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+cover:+Investigative+nonclinical+cardiovascular+safety+and+toxicology+studies+with+BMS-986094,+an+NS5b+RNA-dependent+RNA+polymerase+inhibitor.">From the cover: Investigative nonclinical cardiovascular safety and toxicology studies with BMS-986094, an NS5b RNA-dependent RNA polymerase inhibitor.</a> Toxicological Sciences. 155 (2), 348-362 (2017).</li><li>Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,3-Butanedione+monoxime+(BDM)+as+a+myosin+inhibitor.">2,3-Butanedione monoxime (BDM) as a myosin inhibitor.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 23 (4), 305-308 (2002).</li><li>Fryer, M. W., Gage, P. W., Neering, I. R., Dulhunty, A. F., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paralysis+of+skeletal+muscle+by+butanedione+monoxime,+a+chemical+phosphatase.">Paralysis of skeletal muscle by butanedione monoxime, a chemical phosphatase.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European Journal of Physiology. 411 (1), 76-79 (1988).</li><li>Fleming, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+tissue+engineered+skeletal+muscle+in+vitro+is+dependent+on+the+inclusion+of+basement+membrane+proteins.">Functional regeneration of tissue engineered skeletal muscle in vitro is dependent on the inclusion of basement membrane proteins.</a> Cytoskeleton. 76 (6), 371-382 (2019).</li><li>Capel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+3D+printed+molds+for+human+tissue+engineered+skeletal+muscle.">Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).</li><li>Tsui, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+electroconductive+decellularized+extracellular+matrix+hydrogels+for+engineering+human+cardiac+microphysiological+systems.">Tunable electroconductive decellularized extracellular matrix hydrogels for engineering human cardiac microphysiological systems.</a> Biomaterials. 272, 120764 (2021).</li><li>Tsui, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conductive+silk-polypyrrole+composite+scaffolds+with+bioinspired+nanotopographic+cues+for+cardiac+tissue+engineering.">Conductive silk-polypyrrole composite scaffolds with bioinspired nanotopographic cues for cardiac tissue engineering.</a> Journal of Materials Chemistry B. 6 (44), 7185-7196 (2018).</li><li>Gabella, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+cells,+nerves,+fibroblasts+and+vessels+in+the+detrusor+of+the+rat+urinary+bladder.">Muscle cells, nerves, fibroblasts and vessels in the detrusor of the rat urinary bladder.</a> Journal of Smooth Muscle Research. 55, 34-67 (2019).</li><li>Christov, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+satellite+cells+and+endothelial+cells:+close+neighbors+and+privileged+partners.">Muscle satellite cells and endothelial cells: close neighbors and privileged partners.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (4), 1397-1409 (2007).</li><li>Bersini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+environment+for+the+study+of+fibrosis:+A+3D+human+muscle+model+with+endothelium+specificity+and+endomysium.">Engineering an environment for the study of fibrosis: A 3D human muscle model with endothelium specificity and endomysium.</a> Cell Reports. 25 (13), 3858-3868 (2018).</li><li>Gilbert-Honick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+functional+and+histological+regeneration+of+vascularized+skeletal+muscle.">Engineering functional and histological regeneration of vascularized skeletal muscle.</a> Biomaterials. 164, 70-79 (2018).</li><li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering.">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li></ol>

Все авторы являются сотрудниками и акционерами Curi Bio Inc., компании, которая занимается коммерциализацией оборудования Mantarray и связанного с ним программного обеспечения.

В этом исследовании описываются методы создания 3D-инженерных тканей сердца и скелетных мышц в наборе для литья расходных материалов на 24 лунки. Следуя этим методам, можно последовательно достичь полного массива из 24 тканей без сбоев литья для последующего скрининга лекарств. Критическими соображениями для достижения такого результата являются обеспечение того, чтобы во время литья все этапы выполнялись на льду для предотвращения преждевременной полимеризации гидрогелей, удаление реагента диссоциации клеток перед отливкой ткани, тщательное смешивание суспензии клетки и гидрогеля для каждой ткани, замена наконечников пипеток между тканями и использование термоинактивированного FBS (если он вообще используется). Кроме того, важно следить за тем, чтобы стойка решетки не перемещалась после начала отливки и аккуратно переносилась после образования гидрогелей.
Основные модификации включают использование различных типов клеток для достижения сердечной и скелетной ЕМТ и легирование гидрогелей переменными концентрациями белков базальной мембраны для стимулирования клеточного созревания и стабильности тканей. Благотворное влияние такого допинга должно проверяться в каждом конкретном случае, но было показано, что при определенных обстоятельствах он улучшает функциональные результаты и долговечность тканей14,16,22. Также следует отметить, что перечисленные плотности клеток являются ориентировочными и, возможно, должны быть оптимизированы для различных клеточных линий. Альтернативные гидрогелевые композиции также могут рассматриваться как средство для модификации структурных и функциональных свойств достигнутых ЭМТ23,24,25. Нативное мышечное микроокружение также содержит поддерживающие типы клеток, способствующие васкуляризации, иннервации и отложению матрикса для поддержки миоцитов по форме и функции26,27. В то время как система, описанная здесь, в настоящее время включает фибробласты в 3D-ткани сердца, дополнительные типы клеток могут создать более физиологически значимую модель для изучения безопасности и эффективности терапевтических соединений in vitro. Ранее ряд поддерживающих типов клеток был успешно интегрирован в 3D-инженерные ткани, представляя собой захватывающий шаблон для будущих исследований с использованием платформы сократимости магнитного зондирования28,29,30.
Поиск и устранение неисправностей для этого протокола сосредоточено на образовании ненадежных или непоследовательных тканей в процессе литья. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать образования пузырьков в гидрогелях во время их отливки, в то же время способствуя равномерному распределению клеток во время смешивания. Эксперименты по оптимизации, вероятно, потребуются для каждого нового типа клеток, чтобы определить идеальную плотность клеток, соотношение клеток и состав матрицы.
Основным ограничением для этого метода является значительное количество клеток, необходимых для создания полной пластины из 24 ЕМТ. Для данных, представленных здесь, было использовано 15 миллионов кардиомиоцитов и 18 миллионов скелетных миобластов на одну пластину. Некоторые исследователи могут не иметь доступа к таким большим пулам клеточного материала, что может препятствовать их способности использовать эту платформу в полной мере. Если конечные пользователи не имеют доступа к аппаратному обеспечению магнитного зондирования, измерения прогибов после необходимо выполнять оптически, что значительно снижает пропускную способность и предотвращает одновременную регистрацию мышечных сокращений в нескольких лунках. Тем не менее, аппаратное обеспечение Mantarray преодолевает эти ограничения, предлагая первую коммерческую систему, способную к непрерывному, неинвазивному анализу сокращения ЕМТ одновременно в нескольких конструкциях.
Магнитное зондирование в 24 скважинах облегчает лонгитюдные исследования функционального развития ЕМТ в режиме реального времени и позволяет точно измерять острые реакции на химические, экологические или генетические манипуляции. В то время как магнитное зондирование имеет ряд преимуществ, таких как одновременное измерение в нескольких тканях, и не требует сложного анализа данных, оптические методы обнаружения позволяют одновременно измерять физиологические показатели, такие как поток кальция или картирование напряжения. Тем не менее, наборы данных, такие как те, которые проиллюстрированы в разделе результатов, демонстрируют широту применения этой технологии в области разработки лекарств. Учитывая, что немногие анализы на рынке предлагают средства для прямой оценки сократительного выхода в сконструированных мышцах, эти методы обладают потенциалом для революции в процессе доклинических разработок.

Модели индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) все чаще становятся ключевыми игроками в доклиническом конвейере терапевтических открытий и разработок, а также в фундаментальных биологических исследованиях и моделировании заболеваний 1,2,3,4,5. Сократительные ткани, такие как сердечные и скелетные мышцы, полученные из ИПСК, обладают большим потенциалом для улучшения прогностической силы исследований человека in vitro, поскольку прямая оценка сократительной силы и кинетики мышц является количественным показателем для изучения общей функции тканей 4,6,7,8. Как правило, измерения сократительной силы были получены либо косвенно путем оптического отслеживания отклонения подложки 9,10, либо непосредственно путем прикрепления клеток/тканей к преобразователюсилы 4,11,12. Эти методы, хотя и точны, по своей сути имеют низкую пропускную способность и, как правило, требуют высококвалифицированных операторов для сбора и анализа данных.
Предыдущая работа показала, что зондирование магнитным полем обходит эти препятствия и обеспечивает альтернативный метод оценки сконструированной мышечной функции одновременно в нескольких тканевых конструкциях13. Платформа 3D-сократимости Mantarray (магнитометрический анализатор для eNgineered Tissue ARRAY) основана на этой технологии с использованием устройства, способного измерять сократительную способность сконструированных мышечных тканей в высокой степени параллельно, что использует сложность 3D-клеточных моделей с более высокой пропускной способностьюскрининга 14. Платформа позволяет проводить количественный мониторинг сократительной функции в тканях сердца и скелетных мышц без меток в режиме реального времени в стандартном инкубаторе клеточных культур или за его пределами, устраняя необходимость в оптической сократительной визуализации и анализе. Эта технология облегчает прямое сравнение здоровых и больных клеточных линий и позволяет измерять влияние препарата на сократительные ткани, устанавливая количественные данные о безопасности и эффективности новых и существующих терапевтических соединений in vitro.
Сконструированные 3D-мышечные ткани могут быть изготовлены между двумя стойками с высокой воспроизводимостью с использованием расходной литейной пластины Mantarray с 24 лунками (рис. 1). Один столб жесткий, а другой стойки гибкий и содержит небольшой магнит. Когда тканевая конструкция сжимается, она вытесняет гибкий стержень и встроенный магнит. Пластина EMT расположена внутри прибора, а последующее смещение измеряется с помощью массива магнитных датчиков на печатной плате под держателем пластины. Измеренные изменения магнитного поля преобразуются в абсолютную сократительную силу с помощью математического алгоритма. Прибор использует быструю частоту дискретизации данных, чтобы обеспечить сбор подробной информации о функциональной способности и зрелости исследуемого типа (ов) клеток, включая частоту сокращения, скорость и время распада. Эти функциональные измерения могут быть получены во всех 24 скважинах одновременно с магнитной чувствительной платформой или индивидуально и последовательно с использованием традиционных оптических методов.
В этом исследовании описывается высоковоспроизводимый метод инженерии 3D-скелетных мышц и сердечных микротканей в гидрогеле на основе фибрина. Во время короткой 80-минутной реакции тромбин катализирует превращение фибриногена в фибрин, обеспечивая каркас для развития мышечных клеток во взвешенной культуре15. Стромальные клетки помогают реконструировать матрикс, и ткани становятся сократительными, поскольку мышечные клетки образуют синцитий внутри гидрогеля. Сократительная способность этих тканей была проанализирована с использованием подхода магнитного зондирования как до, так и после воздействия соединения, что подтвердило правильность использования этого метода в исследованиях лекарственных препаратов «доза-реакция». Первичные человеческие миобласты из биопсии здорового донора были получены коммерчески и культивированы в 2D в соответствии с протоколами поставщика. Клетки были расширены с использованием среды для роста скелетных мышц через три прохода, чтобы получить достаточное количество клеток для изготовления 3D-тканей. Стромальные клетки и кардиомиоциты, полученные из hiPSC, культивировали в соответствии с протоколом поставщика в течение 3 дней, чтобы обеспечить восстановление после криоконсервации перед введением клеток в ткани. Приведены репрезентативные результаты, иллюстрирующие типы наборов данных, которые могут быть собраны с помощью платформы магнитного зондирования. Также рассматриваются распространенные ошибки, связанные с генерацией инженерных тканей с использованием этих методов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainer&#160;</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dish</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>150466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Steriflip filter</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL filter flask</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>S2GVU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-aminocaproic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight Maintenance Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CM-002A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight Plating Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CM-020A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Pace EM stimulator&#160;</td>
			<td>IonOptix&#160;</td>
			<td>EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit</td>
			<td></td>
			<td>Primary - DIFF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>Primary - MAINT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10566-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dystrophin antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab154168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Must be heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen (Bovine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>354400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11550043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS-27A Fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Skeletal Muscle Myoblasts&#160;</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>CC-2580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock 10 mL syringe</td>
			<td>BH Supplies</td>
			<td>BH10LL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray Instrument</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>MANTA-24-B1</td>
			<td>System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray Plate Kits</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>MA-24-SKM-5</td>
			<td>Pack of 5 kits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantarray stimulation lid&#160;</td>
			<td>Curi Bio</td>
			<td>EM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (ECM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>C-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Microscope</td>
			<td>Nikon Ti2E</td>
			<td>MEA54000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan Myosin Heavy Chain antibody&#160;</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>MF-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethyleneimine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>Y-27632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Growth Medium (SkGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 24-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>M8812&#160;</td>
			<td>Other manufacturer&#39;s plates will not fit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard 6-well plates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stromal medium (DMEM + 20% FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Filter Flask</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>159910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T225 Filter Flask</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>159934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A1217702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (1x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preclinical drug testing in scalable 3d engineered muscle tissues

Точное моделирование здоровых и болезненных состояний in vitro имеет жизненно важное значение для разработки новых стратегий лечения и терапии. При заболеваниях сердца и скелетных мышц сократительная сила и кинетика являются ключевыми показателями для оценки мышечной функции. Новые и усовершенствованные методы создания инженерных мышечных тканей (ЕМТ) из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток сделали моделирование заболеваний in vitro более надежным для сократительных тканей; Однако воспроизводимое изготовление тканей из взвешенных клеточных культур и измерение их сократимости является сложной задачей. Такие методы часто страдают от высокой частоты отказов и требуют сложных контрольно-измерительных приборов и настраиваемых процедур анализа данных. Новая платформа и устройство, использующее 3D EMT в сочетании с анализом сократимости без меток, с высокой степенью параллельности и автоматизации, обходят многие из этих препятствий. Платформа позволяет легко и воспроизводимо изготавливать 3D-ЕМТ с использованием практически любого источника ячеек. Затем сократительная способность тканей измеряется с помощью прибора, который одновременно измеряет 24 ткани без необходимости сложных процедур анализа программного обеспечения. Прибор может надежно измерять изменения силы микроньютонов, что позволяет проводить дозозависимый скрининг соединений для измерения влияния лекарственного средства или терапевтического средства на сократительный выход. Сконструированные ткани, изготовленные с помощью этого устройства, полностью функциональны, генерируя подергивания и столбнячные сокращения при электрической стимуляции, и могут быть проанализированы в продольном направлении в культуре в течение недель или месяцев. Здесь мы показываем данные ЕМТ сердечной мышцы при остром и хроническом дозировании известных токсикантов, включая препарат (BMS-986094), который был взят из клинических испытаний после смерти пациентов из-за непредвиденной кардиотоксичности. Также представлена измененная функция скелетных мышц в сконструированных тканях в ответ на лечение ингибитором миозина. Эта платформа позволяет исследователю интегрировать сложные, богатые информацией биоинженерные модельные системы в свой рабочий процесс по открытию лекарств с минимальным дополнительным обучением или навыками.

Watch this Scientific Journal Video about Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues at JoVE.com

Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues

Этот протокол предоставляет методы создания 3D-инженерных тканей сердца и скелетных мышц и описывает их использование в доклинических методах скрининга лекарств. Описанные методы используют магнитно-сенсорную систему для облегчения одновременной оценки 24 тканей параллельно.

Доклиническое тестирование лекарств в масштабируемых 3D-инженерных мышечных тканях

Accurately modeling healthy and disease conditions in vitro is vital for the development of new treatment strategies and therapeutics. For cardiac and ...

Наша платформа использует 3D-инженерные мышечные ткани и магнитное сенсорное оборудование для одновременного измерения сократительной способности в 24 лунках. Это обеспечивает более высокопроизводительный метод оценки новых терапевтических средств in vitro с использованием мышечных тканей человека. Наш метод литья улучшает консистенцию и воспроизводимость при изготовлении 3D-инженерных мышечных тканей.Мы разработали расходную 24-луночную литейную пластину, оснащенную магнитным чувствительным оборудованием для измерения и анализа сократимости на нашей платформе. Этот метод может дать ценную информацию о моделировании заболеваний in vitro, открытии лекарств и генной терапии для любого мышечного заболевания, которое влияет на сократительную способность. В настоящее время мы включаем двигательные нейроны в наши 3D-конструкции, чтобы создать модель нервно-мышечного соединения.Для начала поместите предварительно охлажденный набор для отливки тканей на холодный блок или лед внутри колпака для клеточной культуры. Положите литейную пластину плашмя на лед. Добавьте тромбин в базовую среду, чтобы получить раствор тромбина, и переместите пострешетку с литейной пластины на новую стерильную 24-луночную пластину.Налейте пипеткой 50 микролитров раствора тромбина в каждую предварительно охлажденную лунку литейной пластины и поместите решетку обратно на набор. Отложите кастинговый набор на лед. Затем добавьте 500 миллилитров среды RPMI, 10 миллилитров B27 и 2,5 грамма аминокапроновой кислоты или ACA, чтобы приготовить сердечную среду EMT.Выньте среду EMT, которая будет использоваться для отливки тканей, и добавьте в нее 10 микромолярных ингибиторов ROCK. Подготовьте скелетную среду EMT, добавив 50 миллилитров среды F10 и 0,25 грамма аминокапроновой кислоты или ACA для первичных миобластов. Используйте 0,1 грамма ACA для миобластов, полученных из IPSC.Затем стерильно фильтруют литейную среду, содержащую ACA. Нагрейте реагент для диссоциации клеточной культуры и равный объем среды EMT до 37 градусов Цельсия. Эта нагретая среда EMT будет использоваться для разбавления реагента диссоциации.Промойте клетки PBS и добавьте подогретый реагент диссоциации, чтобы поднять клетки. Инкубируйте при температуре 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут или до тех пор, пока клетки не поднимутся, и проверяйте культуры каждые две-три минуты, постукивая по стенке тарелки. Как только клетки поднимутся, перенесите их в коническую трубку объемом 50 миллилитров.Тритурат с помощью пипетки P-1000 для обеспечения одноклеточной суспензии. Промойте тарелку и колбу дополнительной средой EMT, чтобы собрать оставшиеся клетки и добавить их в коническую трубку. Опять же, тритуируйте клетки, чтобы обеспечить одноклеточную суспензию.Добавьте среду EMT, чтобы остановить процесс диссоциации, а затем возьмите образцы клеточных суспензий для подсчета клеток. Выполняйте подсчет клеток с помощью автоматического счетчика клеток или гемоцитометра трипанового синего цвета. Вращайте клетки при 200 г в течение четырех минут, аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в пяти миллилитрах базовой среды EMT, чтобы удалить остаточный реагент диссоциации.После повторного центрифугирования в течение четырех минут аспирируйте надосадочную жидкость и приготовьте клеточные суспензии с соответствующей плотностью. Рассчитайте объемы каждого клеточного раствора, необходимые для составления нужного количества тканей, и нанесите рассчитанные объемы клеток пипеткой в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Добавьте 10 микролитров фибриногена на ЕМТ в клеточную суспензию и поместите ее на лед.Убедитесь, что каждая ЕМТ имеет 90 микролитров клеточной суспензии, 10 микролитров фибриногена и 50 микролитров раствора тромбина в окончательной тканевой конструкции. В колпаке для культивирования клеток снимите крышку набора для литья тканей и поместите литейную пластину с решеткой, лежащей плашмя на льду. Смешайте клеточную смесь фибриногена и наберите 100 микролитров пипеткой Р-200.Добавьте 100 микролитров смеси в лунки, приготовленные с 50 микролитрами раствора тромбина, и тритурируйте пять раз, чтобы хорошо перемешать. Не проталкивайте пипетку дальше первой упора и не снимайте наконечник после растирания, чтобы избежать образования пузырьков. Смешайте клеточную суспензию в конической трубке перед отливкой каждой ткани.Держите решетку и пластину для литья одновременно указательным и большим пальцами одной руки, чтобы избежать движения решетки, или оставьте пластину плоской на льду и качните ведро со льдом, чтобы заглянуть в литейную пластину. Повторите то же самое со свежим наконечником P-200 для каждой ткани, пока все ткани не будут отлиты. Аккуратно перенесите семенной набор в инкубатор и выдерживайте при 37 градусах Цельсия в течение 80 минут.Затем подготовьте свежую 24-луночную пластину с двумя миллилитрами на лунку среды EMT для сердечных тканей и инкубируйте пластину при 37 градусах Цельсия, чтобы нагреть среду. После 80-минутной инкубации аккуратно добавьте один миллилитр среды EMT к краю заливных лунок и выдерживайте еще 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Через 10 минут инкубации осторожно приподнимите столбовую решетку и перенесите ткани из литейной пластины в подготовленную 24-луночную пластину с подогретой средой.Наконец, верните пластины с тканями в инкубатор клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия. Неудачное производство ЕМТ может варьироваться от катастрофических отказов, таких как отслоение тканей от столбов, до более тонких структурных дефектов, таких как пузырьки воздуха и неравномерное осаждение тканей вокруг обоих постов. Конструкция EMT через день после отливки показана здесь.Ткани скелетных мышц переносили в среду дифференцировки, начиная с нулевого дня слияния клеток и гидрогелевого уплотнения. С седьмого по 28-й день одна и та же ЕМТ показала немного меньшую общую длину между двумя стойками и меньшую ширину при измерении через среднюю часть ЕМТ. Четыре пластины тканей отслеживались в течение 21 дня, сравнивая диаметр ЕМТ во время уплотнения.Временные точки показывают постоянный размер ЕМТ между пластинами. Максимальное уплотнение достигается на 21-й день, когда происходит стабилизация ремоделирования матрицы. Здесь изображена иммуногистохимия ЕМТ.ЕМТ фиксировали на 10-й день посева и вводили в парафин. Тонкие поперечные срезы окрашивали антителами против миозина, тяжелой цепи и дистрофина перед визуализацией. Эти графические изображения представляют собой среднюю абсолютную силу подергивания, измеренную сердечными и скелетными ЕМТ с течением времени.Здесь показано лечение острым и хроническим доксорубицином в искусственно сконструированных тканях сердца. Три различные концентрации дозы Dox доставлялись либо болюсно, либо непрерывно вводились в искусственные ткани сердца в течение 27 дней. Доза-реакция на BDM в сконструированных тканях скелетных мышц представлена на этом рисунке.Частота сердечных сокращений или частота подергивания прекращаются дозозависимым образом в тандеме с прекращением сократительной силы, что указывает на кардиотоксичность при воздействии этого соединения на ЕМТ. Самое важное, что нужно помнить при отливке тканей, - это всегда держать все холодным, включая клеточную суспензию и реагенты, а также держать пострешетку полностью неподвижной после начала отливки.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Производственные, характеристики и потенциальные возможности использования в 3D тканевой инженерии человека пищевода слизистой модели

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Инженерная 3D Шелковый коллагена на основе модели поляризованного нервной ткани

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

Спроектированный васкуляризированных лоскута

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Строительство Defined человека Engineered сердечной ткани для изучения механизмов сердечной терапии клеток

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

Комбинированный 3D Tissue Engineered<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; В Silico</em&gt; Lung Опухоль модель для прогнозирования эффективности наркотиков в конкретных мутационные Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Применения<em&gt; В Vivo</em&gt; Функциональное тестирование Крысы передней большеберцовой для оценки Tissue Engineered скелетной мускулатуре Ремонт

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing

Биомеханическое Характеристика мягких тканей человека с помощью отступов и испытания на растяжение

Regenerative medicine aims to engineer materials to replace or restore damaged or diseased organs. The mechanical properties of such materials should ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Автоматизированный анализ Сужение человеческого Engineered ткани сердца для скрининга сердца безопасности лекарственных средств

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Стандартизированные и масштабируемые анализ для изучения Перфированный 3D ангиогенной прорастания iPSC полученных эндотелиальных клеток в Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Расширенные 3D модели печени для тестирования генотоксичности in vitro после долгосрочного воздействия наноматериалов

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...