Name: phage-mediated genetic manipulation of the lyme disease spirochete borrelia burgdorferi
Uploaded: 2022-09-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi at JoVE.com

يود المؤلف أن يشكر شونا ريد ود. سكوت صامويلز وباتريك سيكور على مناقشتهم المفيدة وفاريون (بام) تشونوييراونغ على مساعدتهم التقنية. تم دعم هذا العمل من قبل قسم العلوم الطبية الحيوية ومنح أبحاث أعضاء هيئة التدريس إلى كريستيان إتش إيجرز من كلية العلوم الصحية بجامعة كوينيبياك.

تمت مراجعة جميع التجارب التي تستخدم الحمض النووي المؤتلف والكائنات الحية BSL-2 والموافقة عليها من قبل لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية بجامعة كوينيبياك.
1. إعداد ثقافة B. burgdorferi لإنتاج φBB-1
<ol><li>تحضير وسط Barbour-Stoenner-Kelly المكمل بمصل أرنب طبيعي معطل بالحرارة بنسبة 6.6?...

يمكن أن يمثل استخدام النقل طريقة واحدة للتغلب على الأقل على بعض الحواجز البيولوجية والتقنية المرتبطة بالتحويل الكهربائي ل B. burgdorferi1،4،13،37. في العديد من الأنظمة ، يمكن للبكتيريا نقل الحمض النووي المضيف (غير التكهني...

أضاف تطوير أدوات للتلاعب الجيني للبكتيريا اللولبية Borrelia burgdorferi قيمة لا حصر لها لفهم طبيعة مرض لايم1،2،3،4. يحتوي B. burgdorferi على جينوم معقد بشكل غير عادي يتكون من كروموسوم خطي صغير وبلازميدات خطية ودائرية 5,6. أدى فقدان البلازميد التلقائي ، وإعادة الترتيب داخل الجينات (حركة الجينات من بلازميد إلى آخر داخل نفس الكائن الحي) ، ونقل الجينات الأفقي (HGT ، حركة الحمض النووي بين كائنين) إلى ظهور كمية مذهلة من عدم التجانس الجيني بين B. burgdorferi (على سبيل المثال ، انظر Schutzer et al.7). الأنماط الجينية الناتجة (أو "السلالات") كلها أعضاء في نفس النوع ولكن لها اختلافات وراثية تؤثر على قدرتها على الانتقال إلى وإصابة مضيفات الثدييات المختلفة8،9،10،11. وفي هذا التقرير، سيستخدم مصطلح "سلالة" للإشارة إلى B. burgdorferi ذات الخلفية الجينية المشتقة طبيعيا؛ سيتم استخدام مصطلح "استنساخ" للإشارة إلى سلالة تم تعديلها وراثيا لغرض معين أو نتيجة للتلاعب التجريبي.
يتضمن صندوق الأدوات الجزيئية المتاح للاستخدام في B. burgdorferi علامات قابلة للاختيار ، ومراسلين جينيين ، ونواقل مكوكية ، وطفرات transposon ، ومروجين محرضان ، وعلامات قابلة للاختيار المضاد (للمراجعة ، انظر Drektrah and Samuels12). يتطلب الاستخدام الفعال لهذه المنهجيات الإدخال الاصطناعي للحمض النووي غير المتجانس (الأجنبي) في سلالة B. burgdorferi ذات الأهمية. في B. burgdorferi ، يتم إدخال الحمض النووي غير المتجانس بشكل حصري تقريبا عن طريق التثقيب الكهربائي ، وهي طريقة تستخدم نبضة من الكهرباء لجعل الغشاء البكتيري قابلا للنفاذ بشكل عابر لقطع صغيرة من الحمض النووي يتم إدخالها في الوسائط1. يتم قتل غالبية الخلايا (المقدرة ب ≥99.5٪) بواسطة النبض ، لكن الخلايا المتبقية لديها تردد عال للاحتفاظ بالحمض النووي غير المتجانس13. على الرغم من أنها تعتبر من بين أكثر الطرق كفاءة لإدخال الحمض النووي في البكتيريا ، إلا أن تواتر التثقيب الكهربائي في B. burgdorferi منخفض جدا (يتراوح من محول واحد في 5 × 104 إلى 5 × 106 خلايا)13. يبدو أن الحواجز التي تحول دون تحقيق ترددات أعلى للتحويل هي حواجز تقنية وبيولوجية على حد سواء. تشمل العوائق التقنية أمام التثقيب الكهربائي الناجح ل B. burgdorferi كلا من كمية الحمض النووي (>10 ميكروغرام) الضرورية ومتطلبات اللولبيات لتكون في مرحلة النمو الصحيحة تماما (منتصف السجل ، بين 2 × 10 7 خلايا · مل − 1 و 7 × 107 خلايا · مل − 1) عند تحضير الخلايا الكهربائيةالمختصة 12,13. ومع ذلك ، قد يكون التغلب على هذه الحواجز التقنية أسهل من التغلب على الحواجز البيولوجية.
يدرك باحثو مرض لايم أنه يمكن تقسيم استنساخ B. burgdorferi إلى فئتين عريضتين فيما يتعلق بقدرتها على التلاعب بها وراثيا13,14. غالبا ما تتحول العزلات عالية المرور والمتكيفة في المختبر بسهولة ولكنها عادة ما تفقد البلازميدات الضرورية للعدوى ، وتتصرف بطريقة شاذة من الناحية الفسيولوجية ، ولا يمكنها إصابة مضيف الثدييات أو الاستمرار داخل ناقل القراد12,13. في حين أن هذه الحيوانات المستنسخة كانت مفيدة لتشريح البيولوجيا الجزيئية لل spirochete داخل المختبر ، إلا أنها ذات قيمة قليلة لدراسة spirochete في السياق البيولوجي للدورة enzootic. من ناحية أخرى ، تتصرف العزلات المعدية ذات المرور المنخفض بطريقة فسيولوجية تعكس حالة معدية ويمكن أن تكمل الدورة المعدية ولكنها عادة ما تكون متمردة على إدخال الحمض النووي غير المتجانس ، وبالتالي يصعب التلاعب بها للدراسة12,13. ترتبط صعوبة تحويل عزلات الممر المنخفض بعاملين مختلفين على الأقل: (أ) غالبا ما تتجمع العزلات ذات الممر المنخفض بإحكام معا ، لا سيما في ظل الظروف عالية الكثافة المطلوبة للتثقيب الكهربائي ، وبالتالي تمنع العديد من الخلايا من التطبيق الكامل للشحنة الكهربائية أو الوصول إلى الحمض النووي في الوسائط13,15 ؛ و (ii) يشفر B. burgdorferi نظامين مختلفين على الأقل لتعديل التقييد (R-M) اللذين قد يضعان في عزلات الممر العالي14,16. تطورت أنظمة R-M للسماح للبكتيريا بالتعرف على الحمض النوويالأجنبي 17 والقضاء عليه. في الواقع ، أظهرت العديد من الدراسات في B. burgdorferi أن كفاءات التحول تزداد عندما يكون مصدر الحمض النووي هو B. burgdorferi بدلا من Escherichia coli13,16. لسوء الحظ ، فإن الحصول على التركيز العالي المطلوب من الحمض النووي للتثقيب الكهربائي من B. burgdorferi هو احتمال مكلف ويستغرق وقتا طويلا. مصدر قلق محتمل آخر عند التوصيل الكهربائي واختيار العزلات ذات المرور المنخفض هو أن العملية يبدو أنها تفضل المحولات التي فقدت البلازميد المرتبط بالفوعة الحرجة ، lp2514،18،19 ؛ وبالتالي ، فإن فعل التلاعب الجيني بعزلات B. burgdorferi ذات الممر المنخفض عن طريق التثقيب الكهربائي قد يختار الحيوانات المستنسخة غير المناسبة للتحليل ذي الصلة بيولوجيا ضمن الدورة الحيوانية20. بالنظر إلى هذه المشكلات ، فإن النظام الذي يمكن فيه تحويل الحمض النووي غير المتجانس كهربائيا إلى استنساخ B. burgdorferi عالي المرور ثم نقله إلى عزلات معدية منخفضة المرور بطريقة أخرى غير التثقيب الكهربائي يمكن أن يكون إضافة مرحب بها إلى المجموعة المتزايدة من الأدوات الجزيئية المتاحة للاستخدام في مرض لايم spirochete.
بالإضافة إلى التحول (امتصاص الحمض النووي العاري) ، هناك آليتان أخريان تأخذ من خلالهما البكتيريا بانتظام الحمض النووي غير المتجانس: الاقتران ، وهو تبادل الحمض النووي بين البكتيريا في اتصال جسدي مباشر مع بعضها البعض ، والنقل ، وهو تبادل الحمض النووي بوساطة البكتيريا21. في الواقع ، تم استخدام قدرة البكتيريا على التوسط HGT كأداة تجريبية لتشريح العمليات الجزيئية داخل عدد من الأنظمة البكتيرية22،23،24. B. burgdorferi ليست مؤهلة بشكل طبيعي لامتصاص الحمض النووي العاري ، وهناك القليل من الأدلة على أن B. burgdorferi يشفر الجهاز اللازم لتعزيز الاقتران الناجح. ومع ذلك ، فقد وصفت التقارير السابقة التحديد والتوصيف الأولي ل φBB-1 ، وهي بكتيريا معتدلة من B. burgdorferi25،26،27،28. φBB-1 حزم عائلة من 30 كيلو بايت البلازميدات الموجودة داخل B. burgdorferi25 ؛ تم تعيين أفراد هذه العائلة CP32S. تمشيا مع دور φBB-1 في المشاركة في HGT بين سلالات B. burgdorferi ، أبلغ Stevenson et al. عن وجود cp32 متطابق في سلالتين مع cp32s متباينة ، مما يشير إلى مشاركة حديثة لهذا cp32 بين هاتين السلالتين ، على الأرجح عن طريق النقل29. هناك أيضا دليل على إعادة تركيب كبيرة عبر HGT بين cp32s في جينوم مستقر نسبيا30،31،32،33. أخيرا ، تم إثبات قدرة φBB-1 على تحويل كل من cp32s والحمض النووي المتجه للمكوك غير المتجانس بين خلايا نفس السلالة وبين خلايا سلالتين مختلفتين سابقا27,28. بالنظر إلى هذه النتائج ، تم اقتراح φBB-1 كأداة أخرى يتم تطويرها لتشريح البيولوجيا الجزيئية ل B. burgdorferi.
الهدف من هذا التقرير هو تفصيل طريقة لتحفيز وتنقية العاثية φBB-1 من B. burgdorferi ، بالإضافة إلى توفير بروتوكول لإجراء اختبار نقل بين استنساخ B. burgdorferi واختيار وفحص المحولات المحتملة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L filter units (PES, 0.22 &#181;m pore size)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2GPU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1450-0810</td>
			<td>holds 4 mL with low void volume (for induction)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.75&#34; Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8A</td>
			<td>autoclave prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1500-1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose LE</td>
			<td>Dot Scientific inc.</td>
			<td>AGLE-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Neopeptone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>DF0119-17-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto TC Yeastolate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>255772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (serum replacement grade)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>700-104P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (for molecular biology)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1145-1</td>
			<td>CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder)</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>C5900-01</td>
			<td>cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythromycin</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>E57000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin reagent solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (Dextrose Anhydrous)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP350-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GS (0.22 &#181;M pore size)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGSM33SS</td>
			<td>to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP25312</td>
			<td>CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-D-glucosamine</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>100068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides (primers for PCR)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPrep (total genomic extraction kit)</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (100 mm &#215; 15 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hausser counting chamber</td>
			<td>Hausser scientific</td>
			<td>HS-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hausser counting chamber cover glass</td>
			<td>Hausser scientific</td>
			<td>HS-5051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP233-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS)</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>31119-3</td>
			<td>heat inactivate as per manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro UV transparent cuvettes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9750-9150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8674-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronic Genesys 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S6501-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1804-500G</td>
			<td>sodium citrate for BSK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phage-mediated genetic manipulation of the lyme disease spirochete borrelia burgdorferi

تم إنجاز إدخال الحمض النووي الأجنبي في اللولبية Borrelia burgdorferi بشكل حصري تقريبا عن طريق التحويل باستخدام التثقيب الكهربائي. هذه العملية لها كفاءة أقل بشكل ملحوظ في مرض لايم spirochete مقارنة بالبكتيريا الأخرى سالبة الجرام ذات الخصائص الأفضل. يعتمد معدل نجاح التحول بشكل كبير على وجود كميات مركزة من الحمض النووي عالي الجودة من خلفيات محددة ويخضع لتباين كبير من سلالة إلى سلالة. يمكن أن تكون الوسائل البديلة لإدخال الحمض النووي الأجنبي (أي ناقلات المكوك ، ومراسلي الفلورسنت ، وعلامات مقاومة المضادات الحيوية) في B. burgdorferi إضافة مهمة إلى تسليح الأدوات المفيدة للتلاعب الجيني لمرض لايم spirochete. تم التعرف على البكتيريا جيدا كآليات طبيعية لحركة الحمض النووي بين البكتيريا في عملية تسمى النقل. في هذه الدراسة ، تم تطوير طريقة لاستخدام العاثية البورلية في كل مكان φBB-1 لتحويل الحمض النووي بين خلايا B. burgdorferi من نفس الخلفيات الجينية والمختلفة. يتضمن الحمض النووي المحول كلا من الحمض النووي المحول والحمض النووي غير المتجانس في شكل نواقل مكوكية صغيرة. يشير هذا العرض التوضيحي إلى استخدام محتمل للنقل بوساطة العاثيات كمكمل للتثقيب الكهربائي للتلاعب الجيني لمرض لايم spirochete. يصف هذا التقرير طرق تحريض وتنقية العاثية φBB-1 من B. burgdorferi ، واستخدام هذه العاثية في مقايسات النقل ، واختيار وفحص المحولات المحتملة.

يمثل استخدام البكتيريا لنقل الحمض النووي بين سلالات B. burgdorferi القابلة للتحويل بسهولة أكبر أو الحيوانات المستنسخة المتمردة على التحول الكهربائي أداة أخرى للتحقيق الجزيئي المستمر لمحددات مرض لايم. يمكن تعديل مقايسة النقل الموصوفة هنا حسب الحاجة لتسهيل حركة الحمض النووي بين أي مستنسخا...

Watch this Scientific Journal Video about Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi at JoVE.com

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

إن قدرة البكتيريا على نقل الحمض النووي بين الخلايا البكتيرية تجعلها أدوات فعالة للتلاعب الجيني بمضيفيها البكتيريين. تظهر هنا منهجية لتحريض واستعادة واستخدام φBB-1 ، وهي بكتيريا من Borrelia burgdorferi ، لتحويل الحمض النووي غير المتجانس بين سلالات مختلفة من مرض لايم spirochete.

التلاعب الجيني بوساطة العاثيات لمرض لايم Spirochete Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This ...

هذا البروتوكول مهم لأنه يصف أداة مهمة أخرى لتشريح البيولوجيا الجزيئية لعامل مرض لايم Borrelia burgdorferi. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه باستخدام نقل العاثيات ، فإنه يوفر طريقة بديلة لإدخال الحمض النووي في Borrelia burgdorferi دون الحاجة إلى تطبيق نبضة كهربائية ، كما هو الحال في التثقيب الكهربائي. يمكن استخدام هذه الطريقة لتوفير مزيد من التبصر في الآليات الجزيئية التي يستخدمها Borrelia burgdorferi للاستمرار في دورته الحيوانية والتسبب في نهاية المطاف مرض لايم في البشر.للبدء ، قم بتلقيح 150 ميكرولتر من استنساخ Borrelia burgdorferi المناسب إلى 15 ملليلتر من BSK في أنابيب طرد مركزي مخروطية معقمة بإحكام لبروتوكول النقل. بعد ذلك ، استكمل الوسط بالتركيز المناسب للمضادات الحيوية أو مجموعة من المضادات الحيوية لاختيار وصيانة الحمض النووي غير المتجانس داخل استنساخ Borrelia burgdorferi واحتضان العينة عند 33 درجة مئوية. بعد أن نمت الثقافة ، قم بالطرد المركزي الحجم المناسب للثقافة عند 6،000 غرام لمدة 10 دقائق.بعد صب المادة الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في أربعة ملليلتر في BSK الطازج وانقل العينة إلى أصغر أنبوب معقم متاح لحمل العينة بأقل مساحة للرأس. بعد ذلك ، أضف الكمية المناسبة من العامل المحرض إلى التركيز الموصى به بناء على حجم مزرعة يبلغ أربعة ملليلتر للحث على إنتاج العاثيات ، وقم بتغطية الأنبوب بإحكام ، واخلطه جيدا. احتضان العينة عند 33 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى أربع ساعات.ثم انقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر. الطرد المركزي العينة في 6،000 غرام لمدة 10 دقائق. بعد صب المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 15 ملليلتر من BSK.استكمل الثقافة المحضرة بتركيز المضادات الحيوية المناسب الموصوف في المخطوطة ، مع احتضان العينة عند 33 درجة مئوية لمدة 72 إلى 96 ساعة. لتحضير محاليل لترسيب PEG ، قم بإعداد 500 ملليلتر من كلوريد الصوديوم الخماسي المولي ، و 500 ملليلتر من 40٪ PEG ، و 100 ملليلتر من وسط التعليق كما هو موضح في المخطوطة. للتعقيم ، الأوتوكلاف الحل ، تبرد قبل الاستخدام ، وتخزين درجة حرارة الغرفة أو أربع درجات مئوية.بالنسبة لهطول الأمطار PEG من العاثية من استنساخ Borrelia burgdorferi المانح ، بعد 72 إلى 96 ساعة من الحضانة ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 8،000 G لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. صب المادة الطافية في أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 ملليلتر وتخلص من حبيبات الخلية. أضف كلوريد الصوديوم خماسي المولي إلى التركيز النهائي لمولار واحد.بعد الخلط جيدا ، صخر برفق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. أجهزة الطرد المركزي العينات في 8،000 G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد صب المادة الطافية في أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 ملليلتر كما هو موضح سابقا ، أضف محلول 40٪ PEG-8000 إلى المادة الطافية إلى تركيز نهائي بنسبة 10٪ اخلطي جيدا وضعيه على الثلج لأكثر من ساعة ، حتى طوال الليل.جهاز طرد مركزي للعينات عند 8،000 G لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية كما هو موضح سابقا. تخلص من المادة الطافية وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من السوائل الزائدة دون فقد أي حبيبات تحتوي على جزيئات العاثية. أعد تعليق الحبيبات في الحد الأدنى من حجم وسط التعليق باستخدام وسيط التعليق لغسل جانب الزجاجة وجمع أي جزيئات عاثية محتملة.عالج عينة العاثية المستردة بحجم متساو من الكلوروفورم بناء على حجم التعليق. امزج العينة جيدا وأجهزة الطرد المركزي عند 8،000 جم لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة الطبقة المائية إلى أنبوب نظيف ، وتجنب أي من طبقات الواجهة السميكة.بعد تحديد الحجم المسترد ، بعد المعالجة الأولى بالكلوروفورم ، قم مرة أخرى بمعالجة العينة بكمية من الكلوروفورم تساوي 10٪ من هذا الحجم. انقل الطبقة المائية إلى أنبوب نظيف مع الحرص على تجنب أي من الواجهة أو الطبقات العضوية. استخدم العاثية على الفور أو قم بتخزينها عند أربع درجات مئوية.بعد تحضير مزارع Borrelia burgdorferi لاستخدامها كمتلقي في فحوصات النقل كما هو موضح سابقا ، قم بالطرد المركزي بحجم الثقافة عند 6،000 G لمدة 10 دقائق. صب المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 14.5 ملليلتر من BSK الطازج. أضف أقل من أو يساوي 500 ميكرولتر من عينة العاثية المترسبة ب PEG إلى ثقافة استنساخ المتلقي.بعد الخلط جيدا ، احتضن عند 33 درجة مئوية لمدة 72 إلى 96 ساعة. قم بإجراء اختيار المحولات عن طريق الطلاء في الطور الصلب بعد الخلط مع العاثية المترسبة ب PEG كما هو موضح في المخطوطة. اعتمادا على خلفية استنساخ المستلم ، تحقق من ظهور المستعمرات داخل الأغاروز على لوحات الاختيار بعد 10 إلى 21 يوما من الحضانة.اختر ما لا يقل عن 5 إلى 10 مستعمرات تنمو على الطبق في وجود كلا المضادات الحيوية باستخدام ماصة البورسليكات المعقمة 5.75 بوصة الموصولة بالقطن وقم بتلقيحها في 1.5 ملليلتر من BSK بالمضادات الحيوية المناسبة. تم إجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للجينات على 10 من الحيوانات المستنسخة التي تشفر مقاومة الكانامايسين والجنتاميسين. يمكن تضخيم جين مقاومة الكانامايسين من المتبرع c1673 والتحويلات المحتملة ولكن ليس المتلقي c1706.وبالمثل ، يمكن تضخيم جين مقاومة الجنتامايسين من المتلقي c1706 والتحويلات المحتملة ولكن ليس المتبرع ، مما يمثل أحداث النقل. لإثبات أن كاسيت مقاومة الكانامايسين قد تم تحويله بواسطة 5BB1 من المتبرع إلى المتلقي. تم تحديد خلفية المحولات باستخدام علامات خاصة بالإجهاد.يقوم استنساخ c1673 وخلفية CA-112A بتشفير مضخمات محددة أربعة وخمسة وستة ، في حين أن c1706 ، الذي يحتوي على خلفية B31 عالية المرور ، لا يفعل ذلك. وبالمثل ، كان المحولات واحد واثنان يفتقدان إلى الأمبليكون أربعة وخمسة وستة ، مما يدل على أن الحيوانات المستنسخة لها خلفية c1706 واكتسبت جين مقاومة الكانامايسين من c1673. بالنسبة لترسيب PEG للعاثية ، قم بتنفيذ جميع الخطوات بعناية لزيادة إنتاجية العاثية إلى أقصى حد ومعالجة العاثية المعاد تعليقها تماما باستخدام الكلوروفورم لإزالة أكبر قدر ممكن من ملوثات PEG ووسائط الاستزراع قبل استخدام العاثية وتخزينها.بمجرد إجراء اختبار النقل بنجاح والتحقق من المحول ، تكون هذه الحيوانات المستنسخة متاحة للإجابة على الأسئلة التي تتطلب Borrelia burgdorferi المعدلة وراثيا. نأمل أن يسمح تطوير هذه التقنية للباحثين بالتلاعب وراثيا بسلالات Borrelia burgdorferi التي يصعب حاليا إدخال الحمض النووي عن طريق التثقيب الكهربائي.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

بروتوكول للانتاج من الصليب الوراثية للطفيليات الملاريا القوارض

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

الطرق السريعة لنقل وتوطين مسببات المرض داخل القناة الهضمية لايم القراد

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

التلاعب الجيني في<em&gt; Δku80</em&gt; سلالات لتحليل الجينوم الوظيفي لل<em&gt; التوكسوبلازما جوندياي</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

فيروسات تنبيغ من الخلايا التائية المساعدة كنهج الوراثي لدراسة آليات السيطرة على التمايز وظيفة

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

وبسيط خلية الدم الحمراء تحلل طريقة لإنشاء خطوط الخلايا B Lymphoblastoid

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

مسحة طريقة أخذ العينات للكشف عن نوروفيروس الإنسان على السطوح

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

الجينات تدق في كريسبر / Cas9 وفرز الخلايا في خطوط الخلايا الماكروفاج و تي

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...