Name: phage-mediated genetic manipulation of the lyme disease spirochete borrelia burgdorferi
Uploaded: 2022-09-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi at JoVE.com

Forfatteren ønsker at takke Shawna Reed, D. Scott Samuels og Patrick Secor for deres nyttige diskussion og Vareeon (Pam) Chonweerawong for deres tekniske bistand. Dette arbejde blev støttet af Institut for Biomedicinsk Videnskab og fakultetets forskningsbevillinger til Christian H. Eggers fra School of Health Sciences ved Quinnipiac University.

Alle eksperimenter ved hjælp af rekombinant DNA og BSL-2 organismer blev gennemgået og godkendt af Quinnipiac University Institutional Biosafety Committee.
1. Forberedelse af B. burgdorferi-kultur til produktion af φBB-1
<ol><li>Forbered Barbour-Stoenner-Kelly medium suppleret med 6,6% varmeinaktiveret normalt kaninserum (BSK)15. For 1 liter 1x BSK kombineres komponenterne i tabel 1 i 900 ml vand, pH justeres til 7,6 med 1...

Anvendelsen af transduktion kunne repræsentere en metode til at overvinde i det mindste nogle af de biologiske og tekniske barrierer forbundet med elektrotransformationen af B. burgdorferi 1,4,13,37. I mange systemer kan bakteriofag flytte værts-DNA (ikke-prophage) mellem bakterieceller ved enten generaliseret eller specialiseret transduktion 22,23,24,49,50.<s...

Udviklingen af værktøjer til genetisk manipulation af spirochetalbakterien Borrelia burgdorferi har tilføjet umådelig værdi til forståelsen af borreliosens natur 1,2,3,4. B. burgdorferi har et usædvanligt komplekst genom bestående af et lille lineært kromosom og både lineære og cirkulære plasmider 5,6. Spontant plasmidtab, intragen omlejring (bevægelse af gener fra et plasmid til et andet inden for samme organisme) og horisontal genoverførsel (HGT, bevægelse af DNA mellem to organismer) har givet anledning til en svimlende mængde genetisk heterogenitet blandt B. burgdorferi (for et eksempel, se Schutzer et al.7). De resulterende genotyper (eller "stammer") er alle medlemmer af samme art, men har genetiske forskelle, der påvirker deres evne til at overføre til og inficere forskellige pattedyrværter 8,9,10,11. I denne rapport vil udtrykket "stamme" blive brugt til at henvise til B. burgdorferi med en særlig naturligt afledt genetisk baggrund; Udtrykket "klon" vil blive brugt til at henvise til en stamme, der er blevet genetisk modificeret til et bestemt formål eller som følge af eksperimentel manipulation.
Den molekylære værktøjskasse, der er tilgængelig til brug i B. burgdorferi, inkluderer valgbare markører, genreportere, shuttlevektorer, transponmutagenese, inducerbare promotorer og modvalgbare markører (for en gennemgang, se Drektrah og Samuels12). Den effektive anvendelse af disse metoder kræver kunstig introduktion af heterologt (fremmed) DNA i en B. burgdorferi-stamme af interesse. I B. burgdorferi opnås indførelsen af heterologt DNA næsten udelukkende via elektroporation, en metode, der udnytter en puls af elektricitet til at gøre en bakteriemembran forbigående gennemtrængelig for små stykker DNA, der indføres i mediet1. Størstedelen af cellerne (anslået til at være ≥99,5%) dræbes af pulsen, men de resterende celler har en høj frekvens for at bevare det heterologe DNA13. Selvom det anses for at være blandt de mest effektive metoder til at indføre DNA i bakterier, er frekvensen af elektroporation i B. burgdorferi meget lav (fra 1 transformerende i 5 × 104 til 5 × 106 celler)13. Hindringerne for at opnå højere transformationsfrekvenser synes at være både tekniske og biologiske. Tekniske barrierer for en vellykket elektroporation af B. burgdorferi omfatter både mængden af DNA (>10 μg), der er nødvendig, og spirocheternes krav om at være i nøjagtig den korrekte vækstfase (midt i loggen, mellem 2 × 10 7 celler · ml - 1 og 7 × 107 celler · ml - 1) ved fremstilling af elektrokompetente celler12,13. Disse tekniske barrierer kan dog være lettere at overvinde end de biologiske barrierer.
Lyme sygdomsforskere erkender, at B. burgdorferi kloner kan opdeles i to brede kategorier med hensyn til deres evne til at blive manipuleret genetisk13,14. Laboratorietilpassede isolater med høj passage transformeres ofte let, men har normalt mistet de plasmider, der er afgørende for infektivitet, opfører sig på en fysiologisk afvigende måde og er ikke i stand til at inficere en pattedyrvært eller fortsætte inden for en flåtvektor12,13. Mens disse kloner har været nyttige til at dissekere spirochetens molekylærbiologi i laboratoriet, er de af ringe værdi for at studere spirocheten inden for den biologiske kontekst af den enzootiske cyklus. Lavpassage infektiøse isolater opfører sig derimod på en fysiologisk måde, der afspejler en infektiøs tilstand og kan fuldføre den infektiøse cyklus, men er normalt genstridige over for indførelsen af heterologt DNA og er derfor vanskelige at manipulere til undersøgelse12,13. Vanskeligheden ved at omdanne isolater med lav passage er relateret til mindst to forskellige faktorer: (i) isolater med lav passage klumper sig ofte tæt sammen, især under de høje densitetsforhold, der kræves til elektroporation, og blokerer således mange celler fra enten fuld anvendelse af den elektriske ladning eller adgang til DNA'et i mediet13,15; og (ii) B. burgdorferi koder for mindst to forskellige plasmidbårne begrænsningsmodifikationssystemer (R-M), der kan gå tabt i højpassageisolater14,16. R-M-systemer har udviklet sig til at tillade bakterier at genkende og eliminere fremmed DNA17. Faktisk har flere undersøgelser i B. burgdorferi vist, at transformationseffektiviteten øges, når kilden til DNA'et er B. burgdorferi snarere end Escherichia coli13,16. Desværre er erhvervelse af den nødvendige høje koncentration af DNA til elektroporation fra B. burgdorferi et dyrt og tidskrævende perspektiv. En anden potentiel bekymring ved elektropotering og valg af isolater med lav passage er, at processen ser ud til at favorisere transformanter, der har mistet det kritiske virulensassocierede plasmid, lp2514,18,19; således kan selve handlingen med genetisk manipulation af lavpassage B. burgdorferi-isolater via elektroporation vælge for kloner, der ikke er egnede til biologisk relevant analyse inden for den enzootiske cyklus20. I betragtning af disse problemer kunne et system, hvor heterologt DNA kunne elektrotransformeres til højpassage B. burgdorferi kloner og derefter overføres til lavpassage infektiøse isolater ved en anden metode end elektroporation være en velkommen tilføjelse til den voksende samling af molekylære værktøjer, der er tilgængelige til brug i borrelia spirochete.
Ud over transformation (optagelse af nøgent DNA) er der to andre mekanismer, hvormed bakterier regelmæssigt optager heterologt DNA: konjugation, som er udveksling af DNA mellem bakterier i direkte fysisk kontakt med hinanden og transduktion, som er udveksling af DNA medieret af en bakteriofag21. Faktisk er bakteriofagens evne til at mægle HGT blevet brugt som et eksperimentelt værktøj til dissekering af de molekylære processer inden for en række bakteriesystemer22,23,24. B. burgdorferi er ikke naturligt kompetent til optagelse af nøgent DNA, og der er få beviser for, at B. burgdorferi koder for det apparat, der er nødvendigt for at fremme en vellykket bøjning. Tidligere rapporter har imidlertid beskrevet identifikationen og den foreløbige karakterisering af φBB-1, en tempereret bakteriofag af B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 pakker en familie på 30 kb plasmider fundet i B. burgdorferi25; Medlemmerne af denne familie er blevet udpeget CP32s. I overensstemmelse med en rolle for φBB-1 ved deltagelse i HGT blandt B. burgdorferi-stammer rapporterede Stevenson et al. en identisk cp32 fundet i to stammer med ellers forskellige cp32'er, hvilket tyder på en nylig deling af denne cp32 mellem disse to stammer, sandsynligvis via transduktion29. Der er også tegn på signifikant rekombination via HGT blandt cp32'erne i et ellers relativt stabilt genom30,31,32,33. Endelig er φBB-1's evne til at transducere både cp32'er og heterologt shuttlevektor-DNA mellem celler af samme stamme og mellem celler med to forskellige stammer tidligere blevet påvist27,28. I betragtning af disse resultater er φBB-1 blevet foreslået som et andet værktøj, der skal udvikles til dissektion af molekylærbiologien af B. burgdorferi.
Målet med denne rapport er at detaljere en metode til inducering og rensning af φBB-1 fra B. burgdorferi samt give en protokol til udførelse af et transduktionsassay mellem B. burgdorferi-kloner og udvælgelse og screening af potentielle transduktanter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L filter units (PES, 0.22 &#181;m pore size)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2GPU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1450-0810</td>
			<td>holds 4 mL with low void volume (for induction)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.75&#34; Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8A</td>
			<td>autoclave prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1500-1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose LE</td>
			<td>Dot Scientific inc.</td>
			<td>AGLE-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Neopeptone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>DF0119-17-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto TC Yeastolate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>255772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (serum replacement grade)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>700-104P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (for molecular biology)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1145-1</td>
			<td>CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder)</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>C5900-01</td>
			<td>cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythromycin</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>E57000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin reagent solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (Dextrose Anhydrous)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP350-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GS (0.22 &#181;M pore size)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGSM33SS</td>
			<td>to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP25312</td>
			<td>CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-D-glucosamine</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>100068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides (primers for PCR)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPrep (total genomic extraction kit)</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (100 mm &#215; 15 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hausser counting chamber</td>
			<td>Hausser scientific</td>
			<td>HS-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hausser counting chamber cover glass</td>
			<td>Hausser scientific</td>
			<td>HS-5051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP233-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS)</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>31119-3</td>
			<td>heat inactivate as per manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro UV transparent cuvettes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9750-9150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8674-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronic Genesys 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S6501-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1804-500G</td>
			<td>sodium citrate for BSK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phage-mediated genetic manipulation of the lyme disease spirochete borrelia burgdorferi

Introduktion af fremmed DNA i spirochete Borrelia burgdorferi er næsten udelukkende opnået ved transformation ved hjælp af elektroporation. Denne proces har især lavere effektivitet i borreliose spirochete i forhold til andre, bedre karakteriserede gramnegative bakterier. Transformationshastigheden er meget afhængig af at have koncentrerede mængder DNA af høj kvalitet fra specifikke baggrunde og er underlagt betydelig belastning-til-stamme-variabilitet. Alternative midler til at indføre fremmed DNA (dvs. shuttlevektorer, fluorescerende journalister og antibiotikaresistensmarkører) i B. burgdorferi kunne være en vigtig tilføjelse til armamentarium af nyttige værktøjer til genetisk manipulation af borreliose spirochete. Bakteriofag er blevet anerkendt som naturlige mekanismer til bevægelse af DNA blandt bakterier i en proces kaldet transduktion. I denne undersøgelse er der udviklet en metode til at bruge den allestedsnærværende borreliale φBB-1 til at transducere DNA mellem B. burgdorferi-celler med både samme og forskellige genetiske baggrunde. Det transducerede DNA omfatter både borrelialt DNA og heterologt DNA i form af små shuttlevektorer. Denne demonstration antyder en potentiel anvendelse af fagmedieret transduktion som et supplement til elektroporation til genetisk manipulation af borreliose spirochete. Denne rapport beskriver metoder til induktion og oprensning af φBB-1 fra B. burgdorferi, brugen af denne i transduktionsassays og udvælgelse og screening af potentielle transduktanter.

Brugen af bakteriofag til at flytte DNA mellem lettere transformerbare B. burgdorferi-stammer eller kloner, der er genstridige over for elektrotransformation, repræsenterer et andet værktøj til fortsat molekylær undersøgelse af determinanterne for borreliose. Transduktionsassayet beskrevet heri kan ændres efter behov for at lette bevægelsen af DNA mellem eventuelle kloner af interesse ved hjælp af enten et eller to antibiotika til udvælgelse af potentielle transduktanter. Transduktionen af både prophag...

Watch this Scientific Journal Video about Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi at JoVE.com

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

Bakteriofagens evne til at flytte DNA mellem bakterieceller gør dem til effektive værktøjer til genetisk manipulation af deres bakterielle værter. Præsenteret her er en metode til at inducere, genoprette og bruge φBB-1, en bakteriofag af Borrelia burgdorferi, til at transducere heterologt DNA mellem forskellige stammer af Lyme-sygdommen spirochete.

Fagmedieret genmanipulation af borreliose Spirochete Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This ...

Denne protokol er vigtig, fordi den beskriver et andet vigtigt redskab til dissekering af molekylærbiologien af borrelia-midlet Borrelia burgdorferi. Den største fordel ved denne teknik er, at den ved hjælp af fagtransduktion giver en alternativ metode til at indføre DNA i Borrelia burgdorferi uden at kræve anvendelse af en elektrisk puls, som ved elektroporation. Denne metode kan bruges til at give yderligere indsigt i de molekylære mekanismer, som Borrelia burgdorferi bruger til at fortsætte i sin enzootiske cyklus og i sidste ende forårsage borreliose hos mennesker.Til at begynde med podes 150 mikroliter af den passende Borrelia burgdorferi-klon i 15 ml BSK i tæt lukkede sterile koniske centrifugerør til transduktionsprotokollen. Derefter suppleres mediet med den passende koncentration af antibiotika eller en kombination af antibiotika til udvælgelse og vedligeholdelse af heterologt DNA i Borrelia burgdorferi-klonen og inkuberer prøven ved 33 grader Celsius. Når kulturen er vokset op, centrifugeres det passende volumen kultur ved 6.000 G i 10 minutter.Efter dekantering af supernatanten suspenderes pelleten i fire ml ved frisk BSK og overføres til det mindste sterile rør, der er til rådighed for at holde prøven med minimal hovedplads. Derefter tilsættes den passende mængde inducerende middel til den anbefalede koncentration baseret på et kulturvolumen på fire milliliter for at inducere fagproduktion, dække røret tæt og blande grundigt. Inkuber prøven ved 33 grader Celsius i to til fire timer.Overfør derefter prøven til et 15 milliliter centrifugerør. Centrifuge prøven ved 6.000 G i 10 minutter. Efter dekantering af supernatanten resuspenderes cellepellet i 15 ml BSK.Suppler den tilberedte kultur med den passende antibiotikakoncentration, der er beskrevet i manuskriptet, mens prøven inkuberes ved 33 grader Celsius i 72 til 96 timer. For at forberede opløsninger til PEG-udfældning fremstilles 500 ml fem-molar natriumchlorid, 500 ml 40% PIND og 100 ml suspensionsmedium som beskrevet i manuskriptet. For at sterilisere autoklaver opløsningen, afkøles før brug og opbevares stuetemperatur eller fire grader Celsius.Til PEG-udfældning af fra donoren Borrelia burgdorferi-klon centrifugeres prøverne efter 72 til 96 timers inkubation ved 8.000 G i 20 minutter ved fire grader Celsius. Dekanter supernatanten i et rent, 50 milliliter konisk rør og bortskaf cellepellet. Tilsæt fem-molært natriumchlorid til en endelig koncentration af en kindtand.Efter blanding godt, rock forsigtigt ved stuetemperatur i en time. Centrifuge prøverne ved 8.000 G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Efter dekantering af supernatanten i et rent 50 milliliter konisk rør som tidligere demonstreret, tilsættes 40% PEG-8000-opløsning til supernatanten til en endelig koncentration på 10% Bland godt og sæt på is i mere end en time, op til natten over.Centrifuge til prøverne ved 8.000 G i 20 minutter ved fire grader Celsius som vist tidligere. Kassér supernatanten og fjern så meget overskydende væske som muligt uden at miste pellet, som indeholder fagpartiklerne. Resuspender pelleten i et minimalt volumen suspensionsmedium ved hjælp af suspensionsmediet til at vaske ned på siden af flasken og samle eventuelle fagpartikler.Den genvundne fagprøve behandles med et tilsvarende volumen chloroform baseret på resuspensionsvolumenet. Bland prøven godt og centrifuge ved 8.000 G i 10 minutter. Fjern derefter det vandige lag til et rent rør, og undgå nogen af de tykke grænsefladelag.Efter bestemmelse af det genvundne volumen efter den første chloroformbehandling behandles prøven igen med en mængde chloroform svarende til 10% af dette volumen. Overfør det vandige lag til et rent rør, mens du er forsigtig med at undgå nogen af grænsefladen eller organiske lag. Brug fagen med det samme eller opbevar den ved fire grader Celsius.Efter at have forberedt Borrelia burgdorferi-kulturer, der skal bruges som modtager i transduktionsassays som tidligere demonstreret, centrifugeres kulturvolumenet ved 6.000 G i 10 minutter. Dekanter supernatanten og suspenderer pelleten i 14,5 ml frisk BSK. Tilsæt mindre end eller lig med 500 mikroliter PEG-udfældet fagprøve til dyrkningen af modtagerklonen.Efter blanding godt, inkuberes ved 33 grader Celsius i 72 til 96 timer. Udfør udvælgelsen af transduktanter ved fastfasebelægning efter blanding med PEG-udfældet som beskrevet i manuskriptet. Afhængigt af baggrunden for modtagerklonen skal du kontrollere, at kolonierne vises inden for agarosen på udvælgelsespladerne efter 10 til 21 dages inkubation.Vælg mindst 5 til 10 kolonier, der vokser på pladen i nærværelse af begge antibiotika ved hjælp af steriliseret bomuldstilsluttet 5,75 tommer borosilikatpipette og pod dem i 1,5 ml BSK med det passende antibiotikum. PCR-forstærkningen af generne blev udført på 10 af klonerne, der koder for kanamycin- og gentamycinresistens. Kanamycinresistensgenet kunne forstærkes fra donoren c1673 og de potentielle transduktanter, men ikke recipienten c1706.På samme måde kan gentamycinresistensgenet forstærkes fra recipienten c1706 og de potentielle transduktanter, men ikke donoren, der repræsenterer transduktionshændelser. At demonstrere, at kanamycinresistenskassetten blev transduceret af 5BB1 fra donoren til modtageren. Baggrunden for transduktanterne blev bestemt ved hjælp af stammespecifikke markører.C1673-klonen og CA-112A-baggrunden koder for specifikke ampliconer fire, fem og seks, mens c1706, som har en B31-baggrund med høj passage, ikke gør det. På samme måde manglede transduktanterne et og to ampliconer fire, fem og seks, hvilket viser, at klonerne har c1706-baggrunden og har erhvervet kanamycinresistensgenet fra c1673. For PEG-udfældning af skal du udføre alle trin omhyggeligt for at maksimere udbyttet af og behandle den resuspenderede grundigt med chloroform for at fjerne så mange PEG- og kulturmedieforurenende stoffer som muligt inden fagbrug og opbevaring.Når transduktionsassayet er udført med succes og transduktanten verificeret, er disse kloner derefter tilgængelige for at besvare de spørgsmål, der kræver genetisk modificeret Borrelia burgdorferi. Udviklingen af denne teknik vil forhåbentlig gøre det muligt for forskere at genmanipulere Borrelia burgdorferi-stammer, for hvilke indførelsen af DNA via elektroporation i øjeblikket er vanskelig.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetisk Manipulation i<em&gt; Δku80</em&gt; Stammer til Functional Genomisk Analyse af<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Retroviral transduktion af Helper T-celler som en genetisk tilgang til at studere Mekanismer Controlling deres Differentiering og funktion

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

En simpel Red Blood Cell Lysis metode til fastsættelse af B lymfoblastoidcellelinier

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Swab Sampling metode til påvisning af menneskelige Norovirus på overflader

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Gene Knock-in af CRISPR / Cas9 og Celle sortering i makrofag og T Cellelinjer

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...