Name: phage-mediated genetic manipulation of the lyme disease spirochete borrelia burgdorferi
Uploaded: 2022-09-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi at JoVE.com

De auteur wil Shawna Reed, D. Scott Samuels en Patrick Secor bedanken voor hun nuttige discussie en Vareeon (Pam) Chonweerawong voor hun technische assistentie. Dit werk werd ondersteund door het Department of Biomedical Sciences en facultaire onderzoeksbeurzen aan Christian H. Eggers van de School of Health Sciences aan de Quinnipiac University.

Alle experimenten met recombinant DNA en BSL-2 organismen werden beoordeeld en goedgekeurd door de Quinnipiac University Institutional Biosafety Committee.
1. Bereiding van de B. burgdorferi-cultuur voor de productie van φBB-1
<ol><li>Bereid Barbour-Stoenner-Kelly medium aangevuld met 6,6% warmte-geïnactiveerd normaal konijnenserum (BSK)15. Combineer voor 1 l 1x BSK de in tabel 1 vermelde componenten in 900 ml water, stel d...

Het gebruik van transductie zou een methode kunnen zijn om ten minste enkele van de biologische en technische barrières in verband met de elektrotransformatie van B. burgdorferi 1,4,13,37 te overwinnen. In veel systemen kan bacteriofaag gastheer (niet-profaag) DNA tussen bacteriële cellen verplaatsen door gegeneraliseerde of gespecialiseerde transductie</...

De ontwikkeling van hulpmiddelen voor de genetische manipulatie van de spirochetale bacterie Borrelia burgdorferi heeft een onmetelijke waarde toegevoegd aan het begrip van de aard van de ziekte van Lyme 1,2,3,4. B. burgdorferi heeft een ongewoon complex genoom dat bestaat uit een klein lineair chromosoom en zowel lineaire als circulaire plasmiden 5,6. Spontaan plasmideverlies, intragene herschikking (beweging van genen van het ene plasmide naar het andere binnen hetzelfde organisme) en horizontale genoverdracht (HGT, de beweging van DNA tussen twee organismen) hebben geleid tot een duizelingwekkende hoeveelheid genetische heterogeniteit bij B. burgdorferi (zie bijvoorbeeld Schutzer et al.7). De resulterende genotypen (of "stammen") zijn allemaal leden van dezelfde soort, maar hebben genetische verschillen die hun vermogen om over te dragen op en infecteren van verschillende zoogdiergastherenbeïnvloeden 8,9,10,11. In dit rapport zal de term "stam" worden gebruikt om te verwijzen naar B. burgdorferi met een bepaalde natuurlijk afgeleide genetische achtergrond; de term "kloon" zal worden gebruikt om te verwijzen naar een stam die genetisch is gemodificeerd voor een bepaald doel of als gevolg van experimentele manipulatie.
De moleculaire toolbox die beschikbaar is voor gebruik in B. burgdorferi omvat selecteerbare markers, genreporters, shuttlevectoren, transposonmutagenese, induceerbare promotors en counter-selectable markers (voor een overzicht, zie Drektrah en Samuels12). Het effectieve gebruik van deze methodologieën vereist de kunstmatige introductie van heterologe (vreemde) DNA in een B. burgdorferi-belangenstam. In B. burgdorferi wordt de introductie van heterologe DNA bijna uitsluitend bereikt via elektroporatie, een methode die een puls elektriciteit gebruikt om een bacterieel membraan tijdelijk doorlaatbaar te maken voor kleine stukjes DNA die in de media worden geïntroduceerd1. De meerderheid van de cellen (geschat op ≥99,5%) worden gedood door de pols, maar de resterende cellen hebben een hoge frequentie van het behoud van het heterologe DNA13. Hoewel beschouwd als een van de meest efficiënte methoden om DNA in bacteriën te introduceren, is de frequentie van elektroporatie in B. burgdorferi zeer laag (variërend van 1 transformator in 5 × 104 tot 5 × 106 cellen)13. De barrières voor het bereiken van hogere frequenties van transformatie lijken zowel technisch als biologisch te zijn. Technische barrières voor de succesvolle elektroporatie van B. burgdorferi omvatten zowel de hoeveelheid DNA (>10 μg) die nodig is als de vereiste dat de spirocheten zich in precies de juiste groeifase bevinden (mid-log, tussen 2 × 107 cellen·ml−1 en 7 × 107 cellen·ml−1) bij het bereiden van elektrocompetente cellen12,13. Deze technische barrières kunnen echter gemakkelijker te overwinnen zijn dan de biologische barrières.
Onderzoekers van de ziekte van Lyme erkennen dat B. burgdorferi-klonen kunnen worden onderverdeeld in twee brede categorieën met betrekking tot hun vermogen om genetisch te worden gemanipuleerd13,14. Hoge passage, lab-aangepaste isolaten worden vaak gemakkelijk getransformeerd, maar hebben meestal de plasmiden verloren die essentieel zijn voor infectiviteit, gedragen zich op een fysiologisch afwijkende manier en zijn niet in staat om een zoogdiergastheer te infecteren of te volharden in een tekenvector12,13. Hoewel deze klonen nuttig zijn geweest voor het ontleden van de moleculaire biologie van de spirocheet binnen het laboratorium, zijn ze van weinig waarde voor het bestuderen van de spirocheet binnen de biologische context van de enzoötische cyclus. Infectieuze isolaten met een lage doorgang daarentegen gedragen zich op een fysiologische manier die een infectieuze toestand weerspiegelt en kunnen de infectiecyclus voltooien, maar zijn meestal recalcitrant voor de introductie van heterologe DNA en zijn daarom moeilijk te manipuleren voor onderzoek12,13. De moeilijkheid bij het transformeren van isolaten met een lage doorgang houdt verband met ten minste twee verschillende factoren: (i) isolaten met een lage doorgang klonteren vaak strak samen, vooral onder de omstandigheden met hoge dichtheid die nodig zijn voor elektroporatie, waardoor veel cellen worden geblokkeerd voor de volledige toepassing van de elektrische lading of de toegang tot het DNA in de media13,15; en (ii) B. burgdorferi codeert ten minste twee verschillende plasmide-borne restriction-modification (R-M) systemen die verloren kunnen gaan in high-passage isolaten14,16. R-M-systemen zijn geëvolueerd om bacteriën in staat te stellen vreemd DNA te herkennen ente elimineren 17. Inderdaad, verschillende studies in B. burgdorferi hebben aangetoond dat transformatie-efficiënties toenemen wanneer de bron van het DNA B. burgdorferi is in plaats van Escherichia coli13,16. Helaas is het verkrijgen van de vereiste hoge concentratie DNA voor elektroporatie van B. burgdorferi een duur en tijdrovend vooruitzicht. Een andere mogelijke zorg bij het elektropoderen en selecteren van isolaten met een lage doorgang is dat het proces de voorkeur lijkt te geven aan transformatoren die het kritische virulentie-geassocieerde plasmide, lp25 14,18,19, hebben verloren; dus, de handeling van het genetisch manipuleren van low-passage B. burgdorferi isolaten via elektroporatie kan selecteren op klonen die niet geschikt zijn voor biologisch relevante analyse binnen de enzoötische cyclus20. Gezien deze problemen zou een systeem waarin heterologe DNA kan worden geëlektrotransformeerd in B. burgdorferi-klonen met hoge passage en vervolgens kan worden overgebracht in infectieuze isolaten met een lage passage via een andere methode dan elektroporatie, een welkome aanvulling kunnen zijn op de groeiende verzameling moleculaire hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor gebruik in de spirocheet van de ziekte van Lyme.
Naast transformatie (de opname van naakt DNA) zijn er nog twee andere mechanismen waarmee bacteriën regelmatig heterologe DNA opnemen: conjugatie, de uitwisseling van DNA tussen bacteriën in direct fysiek contact met elkaar, en transductie, wat de uitwisseling van DNA is gemedieerd door een bacteriofaag21. Inderdaad, het vermogen van bacteriofaag om HGT te bemiddelen is gebruikt als een experimenteel hulpmiddel voor het ontleden van de moleculaire processen binnen een aantal bacteriële systemen 22,23,24. B. burgdorferi is van nature niet bekwaam voor de opname van naakt DNA, en er is weinig bewijs dat B. burgdorferi codeert voor het apparaat dat nodig is om succesvolle conjugatie te bevorderen. Eerdere rapporten hebben echter de identificatie en voorlopige karakterisering beschreven van φBB-1, een gematigde bacteriofaag van B. burgdorferi 25,26,27,28. φBB-1 pakketten een familie van 30 kb plasmiden gevonden in B. burgdorferi25; de leden van deze familie zijn aangewezen als cp32's. Consistent met een rol voor φBB-1 bij deelname aan HGT onder B. burgdorferi-stammen, rapporteerden Stevenson et al. een identieke cp32 gevonden in twee stammen met anders ongelijksoortige cp32's, wat een recente verdeling van deze cp32 tussen deze twee stammen suggereert, waarschijnlijk via transductie29. Er zijn ook aanwijzingen voor significante recombinatie via HGT bij de cp32's in een verder relatief stabiel genoom 30,31,32,33. Ten slotte is het vermogen van φBB-1 om zowel cp32's als heterologous shuttle vector DNA te transduceren tussen cellen van dezelfde stam en tussen cellen van twee verschillende stammen eerder aangetoond27,28. Gezien deze bevindingen is φBB-1 voorgesteld als een ander te ontwikkelen instrument voor de dissectie van de moleculaire biologie van B. burgdorferi.
Het doel van dit rapport is om een methode te beschrijven voor het induceren en zuiveren van faag φBB-1 van B. burgdorferi, evenals een protocol voor het uitvoeren van een transductietest tussen B. burgdorferi-klonen en het selecteren en screenen van potentiële transductanten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L filter units (PES, 0.22 &#181;m pore size)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2GPU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1450-0810</td>
			<td>holds 4 mL with low void volume (for induction)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.75&#34; Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8A</td>
			<td>autoclave prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1500-1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose LE</td>
			<td>Dot Scientific inc.</td>
			<td>AGLE-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Neopeptone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>DF0119-17-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto TC Yeastolate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>255772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (serum replacement grade)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>700-104P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (for molecular biology)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1145-1</td>
			<td>CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder)</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>C5900-01</td>
			<td>cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythromycin</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>E57000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin reagent solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (Dextrose Anhydrous)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP350-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GS (0.22 &#181;M pore size)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGSM33SS</td>
			<td>to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP25312</td>
			<td>CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-D-glucosamine</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>100068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides (primers for PCR)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPrep (total genomic extraction kit)</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (100 mm &#215; 15 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hausser counting chamber</td>
			<td>Hausser scientific</td>
			<td>HS-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hausser counting chamber cover glass</td>
			<td>Hausser scientific</td>
			<td>HS-5051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP233-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS)</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>31119-3</td>
			<td>heat inactivate as per manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro UV transparent cuvettes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9750-9150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8674-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronic Genesys 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S6501-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1804-500G</td>
			<td>sodium citrate for BSK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phage-mediated genetic manipulation of the lyme disease spirochete borrelia burgdorferi

Het introduceren van vreemd DNA in de spirocheet Borrelia burgdorferi is bijna uitsluitend bereikt door transformatie met behulp van elektroporatie. Dit proces heeft aanzienlijk lagere efficiënties in de ziekte van Lyme spirocheet in vergelijking met andere, beter gekarakteriseerde Gram-negatieve bacteriën. De mate van succes van transformatie is sterk afhankelijk van het hebben van geconcentreerde hoeveelheden hoogwaardig DNA uit specifieke achtergronden en is onderhevig aan significante variabiliteit tussen stammen. Alternatieve middelen voor het introduceren van vreemd DNA (d.w.z. shuttlevectoren, fluorescerende verslaggevers en antibioticaresistentiemarkers) in B. burgdorferi kunnen een belangrijke aanvulling zijn op het armamentarium van nuttige hulpmiddelen voor de genetische manipulatie van de ziekte van Lyme spirocheet. Bacteriofaag is goed erkend als natuurlijke mechanismen voor de beweging van DNA tussen bacteriën in een proces dat transductie wordt genoemd. In deze studie is een methode ontwikkeld voor het gebruik van de alomtegenwoordige borrelfaag φBB-1 om DNA te transduceren tussen B. burgdorferi-cellen van zowel dezelfde als verschillende genetische achtergronden. Het getransduceerde DNA omvat zowel borreliaal DNA als heterologe DNA in de vorm van kleine shuttlevectoren. Deze demonstratie suggereert een potentieel gebruik van faag-gemedieerde transductie als aanvulling op elektroporatie voor de genetische manipulatie van de ziekte van Lyme spirocheet. Dit rapport beschrijft methoden voor de inductie en zuivering van faag φBB-1 van B. burgdorferi, het gebruik van deze faag in transductietests en de selectie en screening van potentiële transductanten.

Het gebruik van bacteriofaag om DNA te verplaatsen tussen gemakkelijker transformeerbare B. burgdorferi-stammen of klonen die recalcitrant zijn voor elektrotransformatie, vertegenwoordigt een ander hulpmiddel voor het voortdurende moleculaire onderzoek naar de determinanten van de ziekte van Lyme. De hierin beschreven transductietest kan indien nodig worden aangepast om de beweging van DNA tussen klonen van belang te vergemakkelijken met behulp van een of twee antibiotica voor de selectie van potentiële transdu...

Watch this Scientific Journal Video about Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi at JoVE.com

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

Het vermogen van bacteriofaag om DNA tussen bacteriële cellen te verplaatsen, maakt ze effectieve hulpmiddelen voor de genetische manipulatie van hun bacteriële gastheren. Hier wordt een methodologie gepresenteerd voor het induceren, herstellen en gebruiken van φBB-1, een bacteriofaag van Borrelia burgdorferi, om heterologe DNA te transduceren tussen verschillende stammen van de ziekte van Lyme spirocheet.

Faag-gemedieerde genetische manipulatie van de ziekte van Lyme Spirochete Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This ...

Dit protocol is belangrijk omdat het een ander belangrijk hulpmiddel beschrijft voor het ontleden van de moleculaire biologie van het ziekteverwekkende middel borrelia burgdorferi. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het door het gebruik van faagtransductie een alternatieve methode biedt voor het introduceren van DNA in de Borrelia burgdorferi zonder de toepassing van een elektrische puls, zoals bij elektroporatie. Deze methode kan worden gebruikt om meer inzicht te geven in de moleculaire mechanismen die Borrelia burgdorferi gebruikt om te volharden in zijn enzoötische cyclus en uiteindelijk de ziekte van Lyme bij de mens te veroorzaken.Om te beginnen ent u 150 microliter van de juiste Borrelia burgdorferi-kloon in 15 milliliter BSK in strak afgedekte steriele conische centrifugebuizen voor het transductieprotocol. Vul vervolgens het medium aan met de juiste concentratie antibiotica of een combinatie van antibiotica voor de selectie en het onderhoud van heterologe DNA in de Borrelia burgdorferi-kloon en incubeer het monster bij 33 graden Celsius. Nadat de cultuur volwassen is geworden, centrifugeer je het juiste volume cultuur op 6.000 G gedurende 10 minuten.Nadat het supernatant is gedecanteerd, resuspenseert u de pellet in vier milliliter bij verse BSK en brengt u het monster over naar de kleinste steriele buis die beschikbaar is om het monster met minimale kopruimte vast te houden. Voeg vervolgens de juiste hoeveelheid inductiemiddel toe aan de aanbevolen concentratie op basis van een kweekvolume van vier milliliter om faagproductie te induceren, sluit de buis goed af en meng grondig. Incubeer het monster bij 33 graden Celsius gedurende twee tot vier uur.Breng het monster vervolgens over naar een centrifugebuis van 15 milliliter. Centrifugeer het monster bij 6.000 G gedurende 10 minuten. Na het decanteren van het supernatant, resuspenseren de cel pellet in 15 milliliter van BSK.Vul de bereide cultuur aan met de juiste antibioticaconcentratie die in het manuscript wordt beschreven, terwijl u het monster gedurende 72 tot 96 uur bij 33 graden Celsius incubeert. Om oplossingen voor PEG-neerslag te bereiden, bereidt u 500 milliliter natriumchloride van vijf kies, 500 milliliter 40% PEG en 100 milliliter suspensiemedium zoals beschreven in het manuscript. Om te steriliseren, autoclaaf de oplossing, koel voor gebruik en bewaar kamertemperatuur of vier graden Celsius.Voor PEG-neerslag van faag van de donor Borrelia burgdorferi-kloon, na 72 tot 96 uur incubatie, centrifugeer de monsters bij 8.000 G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Decanteer het supernatant in een schone, conische buis van 50 milliliter en gooi de celpellet weg. Voeg vijf molair natriumchloride toe aan een eindconcentratie van één kies.Na goed mengen, zachtjes op kamertemperatuur gedurende een uur. Centrifugeer de monsters bij 8.000 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Nadat u het supernatant in een schone conische buis van 50 milliliter hebt gedecanteerd, zoals eerder gedemonstreerd, voegt u 40% PEG-8000-oplossing toe aan het supernatant tot een uiteindelijke concentratie van 10% Meng goed en zet u meer dan een uur op ijs, tot een nacht.Centrifugeer naar de monsters bij 8.000 G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius zoals eerder aangetoond. Gooi het supernatant weg en verwijder zoveel mogelijk overtollige vloeistof zonder pellet te verliezen, die de faagdeeltjes bevat. Resuspenseer de pellet in een minimaal volume suspensiemedium met behulp van het suspensiemedium om de zijkant van de fles af te spoelen en eventuele faagdeeltjes te verzamelen.Behandel het teruggewonnen faagmonster met een gelijk volume chloroform op basis van het volume resuspensie. Meng het monster goed en centrifugeer gedurende 10 minuten op 8.000 G. Verwijder vervolgens de waterige laag naar een schone buis en vermijd een van de dikke interfacelagen.Na het bepalen van het teruggewonnen volume, na de eerste chloroformbehandeling, behandelt u het monster opnieuw met een hoeveelheid chloroform gelijk aan 10% van dat volume. Breng de waterige laag over op een schone buis terwijl u voorzichtig bent om een van de interface- of organische lagen te vermijden. Gebruik de faag direct of bewaar hem bij vier graden Celsius.Na het bereiden van Borrelia burgdorferi-culturen voor gebruik als ontvanger in transductietests zoals eerder aangetoond, centrifugeert u het volume van de cultuur bij 6.000 G gedurende 10 minuten. Decanteer het supernatant en resuspenseer de pellet in 14,5 milliliter vers BSK. Voeg minder dan of gelijk aan 500 microliter PEG-neergeslagen faagmonster toe aan de cultuur van de ontvangende kloon.Na goed mengen, incubeer bij 33 graden Celsius gedurende 72 tot 96 uur. Voer de selectie van transductanten uit door vaste fase plating na mengen met PEG-neergeslagen faag zoals beschreven in het manuscript. Controleer, afhankelijk van de achtergrond van de ontvanger-kloon, of de kolonies na 10 tot 21 dagen incubatie in de agarose op de selectieplaten verschijnen.Kies ten minste 5 tot 10 kolonies die op de plaat groeien in aanwezigheid van beide antibiotica met behulp van gesteriliseerde katoengeplugde 5,75-inch borosilicaatpipet en ent ze in 1,5 milliliter BSK met het juiste antibioticum. De PCR-amplificatie van de genen werd uitgevoerd op 10 van de klonen die coderen voor kanamycine- en gentamycineresistentie. Het kanamycineresistentiegen kan worden versterkt uit de donor c1673 en de potentiële transductanten, maar niet uit de ontvanger c1706.Evenzo kan het gentamycineresistentiegen worden versterkt door de ontvanger c1706 en de potentiële transductanten, maar niet door de donor, wat transductiegebeurtenissen vertegenwoordigt. Om aan te tonen dat de kanamycineresistentiecassette door 5BB1 van de donor naar de ontvanger werd overgeheveld. De achtergrond van de transductanten werd bepaald met behulp van stamspecifieke markers.De c1673-kloon en de CA-112A-achtergrond coderen specifieke amplicons vier, vijf en zes, terwijl c1706, dat een B31-achtergrond met hoge passage heeft, dat niet doet. Evenzo misten de transductanten één en twee amplicons vier, vijf en zes, wat aantoont dat de klonen de c1706-achtergrond hebben en het kanamycineresistentiegen van c1673 hebben verkregen. Voer voor de PEG-neerslag van faag alle stappen zorgvuldig uit om de opbrengst van faag te maximaliseren en behandel de geresuspendeerde faag grondig met chloroform om zoveel mogelijk PEG- en kweekmediaverontreinigingen te verwijderen voorafgaand aan faaggebruik en opslag.Zodra de transductietest met succes is uitgevoerd en de transductant is geverifieerd, zijn deze klonen beschikbaar om de vragen te beantwoorden die genetisch gemodificeerde Borrelia burgdorferi vereisen. De ontwikkeling van deze techniek zal onderzoekers hopelijk in staat stellen om Borrelia burgdorferi-stammen genetisch te manipuleren waarvoor de introductie van DNA via elektroporatie momenteel moeilijk is.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Protocol voor de productie van een genetische Kruis van het knaagdieren malariaparasieten

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Methoden voor snelle overdracht en localisatie van Lyme pathogenen in de Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetische Manipulatie in<em&gt; Δku80</em&gt; Stammen voor Functionele genomische analyse van<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Voederen van Ticks on Animals voor Transmissie en Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Retrovirale Transductie van helper T-cellen als een genetische benadering om te studeren mechanismen die hun differentiatie en functie

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A Simple Red Blood Cell Lysis Methode voor de oprichting van B lymfoblastoïde cellijnen

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Swab Sampling Methode voor de detectie van humane Norovirus op oppervlakken

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Gene Knock-in door CRISPR/Cas9 en celsortering in macrofaag- en T-cellijnen

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...