Name: phage-mediated genetic manipulation of the lyme disease spirochete borrelia burgdorferi
Uploaded: 2022-09-28T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi at JoVE.com

Der Autor dankt Shawna Reed, D. Scott Samuels und Patrick Secor für ihre nützliche Diskussion und Vareeon (Pam) Chonweerawong für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch das Department of Biomedical Sciences und Forschungsstipendien der Fakultät an Christian H. Eggers von der School of Health Sciences der Quinnipiac University unterstützt.

Alle Experimente mit rekombinanter DNA und BSL-2-Organismen wurden vom Quinnipiac University Institutional Biosafety Committee überprüft und genehmigt.
1. Aufbereitung der B. burgdorferi-Kultur zur Herstellung von φBB-1
<ol><li>Barbour-Stoenner-Kelly-Medium mit 6,6% hitzeinaktiviertem normalem Kaninchenserum (BSK)15 zubereiten. Für 1 l 1x BSK die in Tabelle 1 aufgeführten Komponenten in 900 ml Wasser mischen, den pH-Wert mit 1</s...

Die Verwendung der Transduktion könnte eine Methode darstellen, um zumindest einige der biologischen und technischen Barrieren zu überwinden, die mit der Elektrotransformation von B. burgdorferi 1,4,13,37 verbunden sind. In vielen Systemen können Bakteriophagen Wirts-DNA (Nicht-Prophage) zwischen Bakterienzellen durch generalisierte oder spezialisierte Transduktion bewegen 22,23,24,...

Die Entwicklung von Werkzeugen zur genetischen Manipulation des Spirochätenbakteriums Borrelia burgdorferi hat dem Verständnis der Natur der Borreliose 1,2,3,4 einen unermesslichen Mehrwert verliehen. B. burgdorferi hat ein ungewöhnlich komplexes Genom, das aus einem kleinen linearen Chromosom und sowohl linearen als auch zirkulären Plasmiden besteht 5,6. Spontaner Plasmidverlust, intragene Umlagerung (Bewegung von Genen von einem Plasmid zum anderen innerhalb desselben Organismus) und horizontaler Gentransfer (HGT, die Bewegung von DNA zwischen zwei Organismen) haben zu einer schwindelerregenden genetischen Heterogenität bei B. burgdorferi geführt (als Beispiel siehe Schutzer et al.7). Die resultierenden Genotypen (oder "Stämme") sind alle Mitglieder derselben Art, haben aber genetische Unterschiede, die ihre Fähigkeit beeinflussen, verschiedene Säugetierwirte zu übertragen und zu infizieren 8,9,10,11. In diesem Bericht wird der Begriff "Stamm" verwendet, um sich auf B. burgdorferi mit einem bestimmten natürlichen genetischen Hintergrund zu beziehen; Der Begriff "Klon" wird verwendet, um sich auf einen Stamm zu beziehen, der für einen bestimmten Zweck oder als Ergebnis experimenteller Manipulation genetisch verändert wurde.
Die molekulare Toolbox, die für den Einsatz in B. burgdorferi zur Verfügung steht, umfasst selektierbare Marker, Genreporter, Shuttle-Vektoren, Transposon-Mutagenese, induzierbare Promotoren und gegenselektierbare Marker (für eine Übersicht siehe Drektrah und Samuels12). Die effektive Anwendung dieser Methoden erfordert die künstliche Einführung heterologer (fremder) DNA in einen interessierenden B. burgdorferi-Stamm. Bei B. burgdorferi erfolgt die Einführung heterologer DNA fast ausschließlich durch Elektroporation, eine Methode, die einen Stromimpuls verwendet, um eine Bakterienmembran vorübergehend durchlässig für kleine DNA-Stücke zu machen, die in das Medium eingebracht werden1. Die Mehrheit der Zellen (geschätzt ≥99,5%) wird durch den Puls abgetötet, aber die verbleibenden Zellen haben eine hohe Häufigkeit, die heterologe DNAzu behalten 13. Obwohl sie als eine der effizientesten Methoden zur Einführung von DNA in Bakterien gilt, ist die Häufigkeit der Elektroporation in B. burgdorferi sehr gering (von 1 Transformator in 5 × 104 bis 5 × 106 Zellen)13. Die Hindernisse für das Erreichen höherer Transformationsfrequenzen scheinen sowohl technischer als auch biologischer Natur zu sein. Technische Hindernisse für die erfolgreiche Elektroporation von B. burgdorferi umfassen sowohl die Menge an DNA>, die notwendig ist, als auch die Anforderung der Spirochäten, sich in genau der richtigen Wachstumsphase (Mitte log, zwischen 2 × 10 7 Zellen·mL−1 und 7 × 107 Zellen·ml−1) bei der Herstellung elektrokompetenter Zellen12,13 zu befinden. Diese technischen Barrieren sind jedoch möglicherweise leichter zu überwinden als die biologischen Barrieren.
Borreliose-Forscher erkennen, dass B. burgdorferi-Klone in Bezug auf ihre Fähigkeit, genetisch manipuliert zu werden, in zwei große Kategorien unterteilt werden können13,14. Laborangepasste Isolate mit hoher Passage sind oft leicht transformierbar, haben aber in der Regel die für die Infektiosität essentiellen Plasmide verloren, verhalten sich physiologisch abweichend und sind nicht in der Lage, einen Säugetierwirt zu infizieren oder innerhalb eines Zeckenvektors zu persistieren12,13. Während diese Klone nützlich waren, um die Molekularbiologie der Spirochäte im Labor zu sezieren, sind sie für die Untersuchung der Spirochäte im biologischen Kontext des enzootischen Zyklus von geringem Wert. Infektiöse Isolate mit geringer Passage hingegen verhalten sich physiologisch und spiegeln einen infektiösen Zustand wider und können den Infektionszyklus abschließen, sind aber in der Regel widerspenstig gegenüber der Einführung heterologer DNA und daher für Studie12,13 schwer zu manipulieren. Die Schwierigkeit bei der Umwandlung von Isolaten mit geringer Passage hängt mit mindestens zwei verschiedenen Faktoren zusammen: (i) Isolate mit niedriger Passage verklumpen oft fest, insbesondere unter den für die Elektroporation erforderlichen Bedingungen mit hoher Dichte, wodurch viele Zellen entweder die vollständige Anwendung der elektrischen Ladung oder den Zugang zur DNA in den Medien blockieren13,15; und (ii) B. burgdorferi kodiert mindestens zwei verschiedene plasmidgetragene Restriktionsmodifikationssysteme (R-M), die in Hochpassageisolaten verloren gehen können14,16. R-M-Systeme haben sich entwickelt, damit Bakterien fremde DNA erkennen und eliminieren können17. Tatsächlich haben mehrere Studien an B. burgdorferi gezeigt, dass die Transformationseffizienz zunimmt, wenn die Quelle der DNA B. burgdorferi und nicht Escherichia coli13,16 ist. Leider ist der Erwerb der erforderlichen hohen DNA-Konzentration für die Elektroporation von B. burgdorferi eine teure und zeitaufwendige Angelegenheit. Ein weiteres potenzielles Problem bei der Elektropolierung und Auswahl von Isolaten mit geringer Passage ist, dass der Prozess Transformatoren zu bevorzugen scheint, die das kritische Virulenz-assoziierte Plasmid lp2514,18,19 verloren haben; Daher kann der Akt der genetischen Manipulation von B. burgdorferi-Isolaten mit geringer Passage durch Elektroporation für Klone selektieren, die für eine biologisch relevante Analyse innerhalb des enzootischen Zyklus nicht geeignet sind20. Angesichts dieser Probleme könnte ein System, in dem heterologe DNA elektrotransformiert in B. burgdorferi-Klone mit hoher Passage und dann durch eine andere Methode als die Elektroporation in infektiöse Isolate mit geringer Passage übertragen werden könnte, eine willkommene Ergänzung der wachsenden Sammlung molekularer Werkzeuge sein, die für den Einsatz in der Lyme-Borreliose Spirochäte zur Verfügung stehen.
Neben der Transformation (der Aufnahme nackter DNA) gibt es zwei weitere Mechanismen, durch die Bakterien regelmäßig heterologe DNA aufnehmen: die Konjugation, d.h. der Austausch von DNA zwischen Bakterien in direktem physischen Kontakt miteinander, und die Transduktion, bei der es sich um den Austausch von DNA handelt, der durch einen Bakteriophagen vermitteltwird 21. Tatsächlich wurde die Fähigkeit von Bakteriophagen, HGT zu vermitteln, als experimentelles Werkzeug zur Analyse der molekularen Prozesse in einer Reihe von Bakteriensystemenverwendet 22,23,24. B. burgdorferi ist von Natur aus nicht für die Aufnahme nackter DNA zuständig, und es gibt wenig Hinweise darauf, dass B. burgdorferi den Apparat kodiert, der notwendig ist, um eine erfolgreiche Konjugation zu fördern. Frühere Berichte haben jedoch die Identifizierung und vorläufige Charakterisierung von φBB-1, einem gemäßigten Bakteriophagen von B. burgdorferi25,26,27,28, beschrieben. φBB-1 packt eine Familie von 30 kb Plasmiden, die in B. burgdorferi25 gefunden wurden; Die Mitglieder dieser Familie wurden als CP32S bezeichnet. In Übereinstimmung mit einer Rolle von φBB-1 bei der Teilnahme an HGT unter B. burgdorferi-Stämmen berichteten Stevenson et al. über ein identisches cp32, das in zwei Stämmen mit ansonsten unterschiedlichen cp32s gefunden wurde, was auf eine kürzliche Aufteilung dieses cp32 zwischen diesen beiden Stämmen hindeutet, wahrscheinlich über Transduktion29. Es gibt auch Hinweise auf eine signifikante Rekombination über HGT unter den cp32s in einem ansonsten relativ stabilen Genom30,31,32,33. Schließlich wurde die Fähigkeit von φBB-1, sowohl cp32s als auch heterologe Shuttle-Vektor-DNA zwischen Zellen desselben Stammes und zwischen Zellen zweier verschiedener Stämme zu transduzieren, zuvor nachgewiesen27,28. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde φBB-1 als weiteres Werkzeug vorgeschlagen, das für die Zerlegung der Molekularbiologie von B. burgdorferi entwickelt werden soll.
Das Ziel dieses Berichts ist es, eine Methode zur Induktion und Reinigung von Phage φBB-1 aus B. burgdorferi zu beschreiben sowie ein Protokoll für die Durchführung eines Transduktionstests zwischen B. burgdorferi-Klonen und die Auswahl und das Screening potenzieller Transduktanten bereitzustellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L filter units (PES, 0.22 &#181;m pore size)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2GPU10RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1450-0810</td>
			<td>holds 4 mL with low void volume (for induction)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5618-8271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.75&#34; Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8A</td>
			<td>autoclave prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1500-1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose LE</td>
			<td>Dot Scientific inc.</td>
			<td>AGLE-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Neopeptone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>DF0119-17-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto TC Yeastolate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>255772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (serum replacement grade)</td>
			<td>Gemini Bio-Products</td>
			<td>700-104P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform (for molecular biology)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP1145-1</td>
			<td>CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder)</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>C5900-01</td>
			<td>cell culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythromycin</td>
			<td>Research Products International Corp</td>
			<td>E57000-25.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin reagent solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (Dextrose Anhydrous)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP350-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GS (0.22 &#181;M pore size)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGSM33SS</td>
			<td>to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP25312</td>
			<td>CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-D-glucosamine</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>100068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides (primers for PCR)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPrep (total genomic extraction kit)</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (100 mm &#215; 15 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hausser counting chamber</td>
			<td>Hausser scientific</td>
			<td>HS-3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hausser counting chamber cover glass</td>
			<td>Hausser scientific</td>
			<td>HS-5051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP233-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS)</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>31119-3</td>
			<td>heat inactivate as per manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro UV transparent cuvettes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9750-9150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P8674-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectronic Genesys 5</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S6501-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium citrate dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S1804-500G</td>
			<td>sodium citrate for BSK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phage-mediated genetic manipulation of the lyme disease spirochete borrelia burgdorferi

Das Einbringen von Fremd-DNA in die Spirochäte Borrelia burgdorferi erfolgte fast ausschließlich durch Umwandlung mittels Elektroporation. Dieser Prozess hat deutlich geringere Wirkungsgrade in der Lyme-Borreliose-Spirochäte im Vergleich zu anderen, besser charakterisierten gramnegativen Bakterien. Die Erfolgsrate der Transformation hängt stark von konzentrierten Mengen hochwertiger DNA aus spezifischen Hintergründen ab und unterliegt einer signifikanten Variabilität von Stamm zu Stamm. Alternative Mittel zum Einbringen fremder DNA (d.h. Shuttle-Vektoren, fluoreszierende Reporter und Antibiotikaresistenzmarker) in B. burgdorferi könnten eine wichtige Ergänzung zum Arsenal nützlicher Werkzeuge für die genetische Manipulation der Lyme-Borreliose-Spirochäte sein. Bakteriophagen sind als natürliche Mechanismen für die Bewegung von DNA zwischen Bakterien in einem Prozess namens Transduktion anerkannt. In dieser Studie wurde eine Methode entwickelt, um den ubiquitären Borrelialphagen φBB-1 zu verwenden, um DNA zwischen B. burgdorferi-Zellen mit demselben und unterschiedlichem genetischen Hintergrund zu transduzieren. Die transduzierte DNA umfasst sowohl borreliale DNA als auch heterologe DNA in Form von kleinen Shuttle-Vektoren. Diese Demonstration legt eine mögliche Verwendung der Phagen-vermittelten Transduktion als Ergänzung zur Elektroporation für die genetische Manipulation der Lyme-Borreliose-Spirochäte nahe. Dieser Bericht beschreibt Methoden zur Induktion und Reinigung von Phage φBB-1 aus B. burgdorferi, die Verwendung dieses Phagens in Transduktionsassays und die Auswahl und das Screening potenzieller Transduktanten.

Die Verwendung von Bakteriophagen zum Transport von DNA zwischen leichter transformierbaren B. burgdorferi-Stämmen oder Klonen, die der Elektrotransformation widerspenstig sind, stellt ein weiteres Werkzeug für die weitere molekulare Untersuchung der Determinanten der Lyme-Borreliose dar. Der hierin beschriebene Transduktionsassay kann nach Bedarf modifiziert werden, um die Bewegung von DNA zwischen beliebigen Klonen von Interesse zu erleichtern, wobei entweder ein oder zwei Antibiotika für die Auswahl potenz...

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Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

Die Fähigkeit von Bakteriophagen, DNA zwischen Bakterienzellen zu bewegen, macht sie zu wirksamen Werkzeugen für die genetische Manipulation ihrer bakteriellen Wirte. Hier wird eine Methodik zur Induktion, Wiederherstellung und Verwendung von φBB-1, einem Bakteriophagen von Borrelia burgdorferi, vorgestellt, um heterologe DNA zwischen verschiedenen Stämmen der Lyme-Borreliose Spirochäte zu transduzieren.

Phagenvermittelte genetische Manipulation der Borreliose Spirochete Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This ...

Dieses Protokoll ist bedeutsam, weil es ein weiteres wichtiges Werkzeug zur Analyse der Molekularbiologie des Borreliose-Wirkstoffs Borrelia burgdorferi beschreibt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie durch die Verwendung der Phagentransduktion eine alternative Methode zur Einführung von DNA in die Borrelia burgdorferi bietet, ohne dass ein elektrischer Impuls wie bei der Elektroporation erforderlich ist. Mit dieser Methode könnten weitere Einblicke in die molekularen Mechanismen von Borrelia burgdorferi gewonnen werden, um in ihrem enzootischen Zyklus zu persistieren und letztendlich Lyme-Borreliose beim Menschen zu verursachen.Um zu beginnen, inokulieren Sie 150 Mikroliter des entsprechenden Borrelia burgdorferi-Klons in 15 Milliliter BSK in dicht verschlossenen sterilen konischen Zentrifugenröhrchen für das Transduktionsprotokoll. Dann ergänzen Sie das Medium mit der entsprechenden Konzentration von Antibiotika oder einer Kombination von Antibiotika für die Selektion und Erhaltung heterologer DNA innerhalb des Borrelia burgdorferi-Klons und inkubieren Sie die Probe bei 33 Grad Celsius. Nachdem die Kultur erwachsen ist, zentrifugieren Sie das entsprechende Kulturvolumen bei 6.000 G für 10 Minuten.Nach dem Dekantieren des Überstands das Pellet in vier Milliliter bei frischem BSK resuspendieren und die Probe in das kleinste verfügbare sterile Röhrchen überführen, um die Probe mit minimalem Kopfraum aufzunehmen. Fügen Sie dann die entsprechende Menge des induzierenden Mittels zu der empfohlenen Konzentration hinzu, basierend auf einem Kulturvolumen von vier Millilitern, um die Phagenproduktion zu induzieren, verschließen Sie das Röhrchen fest und mischen Sie gründlich. Inkubieren Sie die Probe bei 33 Grad Celsius für zwei bis vier Stunden.Anschließend wird die Probe in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Zentrifugieren Sie die Probe bei 6.000 G für 10 Minuten. Nach dem Dekantieren des Überstands das Zellpellet in 15 Milliliter BSK resuspendieren.Ergänzen Sie die vorbereitete Kultur mit der entsprechenden im Manuskript beschriebenen Antibiotikakonzentration, während Sie die Probe bei 33 Grad Celsius für 72 bis 96 Stunden inkubieren. Um Lösungen für die PEG-Fällung herzustellen, werden 500 Milliliter fünfmolares Natriumchlorid, 500 Milliliter 40% PEG und 100 Milliliter Suspensionsmedium hergestellt, wie im Manuskript beschrieben. Zum Sterilisieren die Lösung autoklavieren, vor Gebrauch abkühlen und Raumtemperatur oder vier Grad Celsius lagern.Für die PEG-Fällung von Phagen aus dem Spender-Borrelia burgdorferi-Klon nach 72 bis 96 Stunden Inkubation zentrifugieren Sie die Proben bei 8.000 G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Dekantieren Sie den Überstand in ein sauberes, 50-Milliliter-konisches Rohr und entsorgen Sie das Zellpellet. Fügen Sie fünfmoliges Natriumchlorid zu einer Endkonzentration von einem Molaren hinzu.Nach dem guten Mischen eine Stunde lang bei Raumtemperatur vorsichtig schaukeln. Zentrifugieren Sie die Proben bei 8.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Dekantieren des Überstands in ein sauberes 50-Milliliter-konisches Röhrchen, wie zuvor demonstriert, 40% PEG-8000-Lösung zum Überstand auf eine Endkonzentration von 10% hinzufügenGut mischen und länger als eine Stunde bis über Nacht auf Eis legen.Zentrifugieren Sie die Proben bei 8.000 G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius, wie zuvor demonstriert. Entsorgen Sie den Überstand und entfernen Sie so viel überschüssige Flüssigkeit wie möglich, ohne ein Pellet zu verlieren, das die Phagenpartikel enthält. Resuspendieren Sie das Pellet in einem minimalen Volumen des Suspensionsmediums mit dem Suspensionsmedium, um die Seite der Flasche abzuwaschen und mögliche Phagenpartikel zu sammeln.Behandeln Sie die gewonnene Phagenprobe mit einem gleichen Volumen Chloroform, basierend auf dem Volumen der Resuspension. Die Probe gut mischen und bei 8.000 g 10 Minuten zentrifugieren. Entfernen Sie dann die wässrige Schicht in ein sauberes Rohr und vermeiden Sie eine der dicken Grenzflächenschichten.Nach Bestimmung des gewonnenen Volumens wird die Probe nach der ersten Chloroformbehandlung erneut mit einer Menge Chloroform behandelt, die 10 % dieses Volumens entspricht. Übertragen Sie die wässrige Schicht in ein sauberes Röhrchen und achten Sie darauf, eine der Grenzflächen oder organischen Schichten zu vermeiden. Verwenden Sie den Phagen sofort oder lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius.Nach der Vorbereitung von Borrelia burgdorferi-Kulturen zur Verwendung als Empfänger in Transduktionsassays, wie zuvor demonstriert, zentrifugieren Sie das Kulturvolumen bei 6.000 G für 10 Minuten. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 14,5 Milliliter frischem BSK. Fügen Sie der Kultur des Empfängerklons weniger als oder gleich 500 Mikroliter PEG-gefällte Phagenprobe hinzu.Nach dem guten Mischen 72 bis 96 Stunden bei 33 Grad Celsius inkubieren. Führen Sie die Auswahl der Transduktanten durch Festphasenbeschichtung nach dem Mischen mit PEG-gefälltem Phagen durch, wie im Manuskript beschrieben. Überprüfen Sie je nach Hintergrund des Empfängerklons, ob die Kolonien innerhalb der Agarose nach 10 bis 21 Tagen Inkubation auf den Selektionsplatten erscheinen.Wählen Sie mindestens 5 bis 10 Kolonien, die in Gegenwart beider Antibiotika mit sterilisierter 5,75-Zoll-Borosilikatpipette auf dem Teller wachsen, und impfen Sie sie mit dem entsprechenden Antibiotikum in 1,5 Milliliter BSK. Die PCR-Amplifikation der Gene wurde an 10 der Klone durchgeführt, die für Kanamycin- und Gentamycinresistenz kodieren. Das Kanamycin-Resistenzgen konnte vom Spender c1673 und den potenziellen Transduktanten, aber nicht vom Empfänger c1706 amplifiziert werden.In ähnlicher Weise könnte das Gentamycin-Resistenzgen vom Empfänger c1706 und den potenziellen Transduktanten, aber nicht vom Spender amplifiziert werden, was Transduktionsereignisse darstellt. Es sollte gezeigt werden, dass die Kanamycinresistenzkassette von 5BB1 vom Spender in den Empfänger übertragen wurde. Der Hintergrund der Transduktanten wurde mit Hilfe von dehnungsspezifischen Markern bestimmt.Der c1673-Klon und der CA-112A-Hintergrund kodieren spezifische Amplikone vier, fünf und sechs, während c1706, das einen B31-Hintergrund mit hohem Durchgang hat, dies nicht tut. In ähnlicher Weise fehlten den Transduktanten eins und zwei die Amplikone vier, fünf und sechs, was zeigt, dass die Klone den c1706-Hintergrund haben und das Kanamycin-Resistenzgen von c1673 erworben haben. Führen Sie für die PEG-Fällung von Phagen alle Schritte sorgfältig durch, um die Ausbeute an Phagen zu maximieren, und behandeln Sie den resuspendierten Phagen gründlich mit Chloroform, um so viel PEG und Kulturmedienverunreinigungen wie möglich vor der Verwendung und Lagerung von Phagen zu entfernen.Sobald der Transduktionsassay erfolgreich durchgeführt und das Transduktant verifiziert wurde, stehen diese Klone zur Verfügung, um die Fragen zu beantworten, die genetisch veränderte Borrelia burgdorferi erfordern. Die Entwicklung dieser Technik wird es den Forschern hoffentlich ermöglichen, Borrelia burgdorferi-Stämme genetisch zu manipulieren, für die die Einführung von DNA durch Elektroporation derzeit schwierig ist.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Protokoll für die Herstellung eines genetischen Kreuz der Nager Malaria-Erregern

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Methoden zur raschen Transfer und die Lokalisierung von Lyme-Borreliose Erreger innerhalb der Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Genetische Manipulation in<em&gt; Δku80</em&gt; Die Stämme für Funktionelle Genomanalyse<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Fütterung von Zecken auf Tiere, die zur Übertragung und Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Retrovirale Transduktion von T-Helferzellen als genetischer Ansatz zur Untersuchung Mechanismen der Kontrolle ihrer Differenzierung und Funktion

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A Simple Red Blood Cell Lysis Verfahren zur Etablierung von B Lymphoblastoidzelllinien

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Swab Sampling Verfahren zum Nachweis von humanem Norovirus auf Oberflächen

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Gene Knock-in durch CRISPR/Cas9 und Zellsortierung in Makrophagen- und T-Zelllinien

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...